專利名稱：一種基于無性孢子的樟芝快速液態(tài)發(fā)酵工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基于無性孢子的樟芝(Antrodia camphorata)的快速液態(tài)發(fā)酵工藝。
背景技術(shù)：
樟芝(Antrodia camphorata)，俗名牛樟芝、牛樟菇，是臺灣特有的一種藥用真菌 (多孔菌科，非褶菌目)，具有高度的寄主專一性，只腐生于臺灣特有的常綠闊葉喬木牛樟樹的芯材內(nèi)部。長期以來，樟芝被民間用于解酒保肝、治療肝痛、食物中毒、腹痛、腹瀉、炎癥、皮膚瘙癢和肝癌等病癥，具有良好療效?，F(xiàn)代藥理研究證實樟芝子實體及發(fā)酵產(chǎn)物在保肝、抗氧化、治療肝癌方面具有獨特的功效。迄今為止，從樟芝的子實體和發(fā)酵產(chǎn)物中已經(jīng)分離得到70多種化合物，包括多糖、二萜類、三萜類、留體類、苯環(huán)衍生物等，由于樟芝良好的藥用功能和野生數(shù)量稀少且生長十分緩慢，使得其市場價格極高，被稱為世界上最昂貴的藥用真菌。目前研究學(xué)者和開發(fā)商都非常關(guān)注樟芝人工培養(yǎng)技術(shù)的研究。人工培養(yǎng)樟芝的技術(shù)主要有兩種途徑一是人工栽培子實體。這固然是最理想的方法，但樟芝固體栽培時間長達數(shù)月之久，難以商業(yè)化生產(chǎn)；二是利用無性型菌株進行菌絲體發(fā)酵，再從發(fā)酵產(chǎn)物中提取功能組分。這是目前較為現(xiàn)實，最經(jīng)濟環(huán)保的一條樟芝開發(fā)途徑。多家研究單位已對樟芝深層培養(yǎng)技術(shù)進行了研究。從研究結(jié)果來看，現(xiàn)有的樟芝深層培養(yǎng)技術(shù)主要存在下述問題 1)與其它微生物相比，樟芝的發(fā)酵周期較長。樟芝菌絲體發(fā)酵階段的時間大多需要十余天， 若加上菌種活化、發(fā)酵種子制備的時間則更久；幻發(fā)酵種子的質(zhì)量不穩(wěn)定容易導(dǎo)致樟芝發(fā)酵過程的可控性較差。傳統(tǒng)樟芝發(fā)酵均采用斜面菌絲挖塊法進行接種，該法容易造成接種不均勻，種子批次質(zhì)量不穩(wěn)定等問題。另外，樟芝絲狀菌絲在發(fā)酵過程中易纏繞形成菌絲球，普遍存在菌球內(nèi)外傳質(zhì)、傳熱、溶氧不一的情況。因此，整個樟芝發(fā)酵過程可控性較差， 最終導(dǎo)致樟芝發(fā)酵產(chǎn)物質(zhì)量的不穩(wěn)定；3)因為樟芝發(fā)酵時間長，當(dāng)發(fā)酵完成出罐后再進行清洗、空消、配置培養(yǎng)基、實消、冷卻以后再接種，非生產(chǎn)的清理時間占用過長，影響生產(chǎn)效率。同時由于生產(chǎn)周期長，工藝環(huán)節(jié)多，導(dǎo)致發(fā)酵過程中容易發(fā)生污染，對發(fā)酵設(shè)備要求較高，因此生產(chǎn)成本高，也影響發(fā)酵產(chǎn)物的質(zhì)量。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于解決上述現(xiàn)有樟芝深層發(fā)酵技術(shù)的不足，提供了一種基于無性孢子的樟芝快速液態(tài)發(fā)酵工藝，其特征在于包括本發(fā)明的目的通過以下方案實現(xiàn)1.將樟芝菌絲體轉(zhuǎn)接至斜面培養(yǎng)基中，25_32°C培養(yǎng)168-312小時。斜面培養(yǎng)基(g/L)馬鈴薯150-200，葡萄糖10-20，瓊脂15-25，pH自然。2.將步驟1中的斜面菌種轉(zhuǎn)接入裝有搖瓶培養(yǎng)基的搖瓶中，26-30°C培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速 100-180rpm,培養(yǎng) 48—72 小時。
搖瓶培養(yǎng)基(g/L)葡萄糖20-30，蛋白胨2-4，硫酸鎂0.5-1，磷酸二氫鉀1_2，麩皮 2-4，pH4.5。3.將步驟2中的樟芝發(fā)酵液按10% -20%的接種量轉(zhuǎn)接入裝有種子培養(yǎng)基的種子罐中，26-30°C培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速50-150rpm，通氣量0. 5_2vvm，培養(yǎng)48-72小時。 種子罐培養(yǎng)基與搖瓶培養(yǎng)基相同。4.將步驟3中的樟芝發(fā)酵液按10 % -20 %的接種量轉(zhuǎn)接入裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，26-30°C培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速50-150rpm，通氣量0. 5_2vvm，培養(yǎng)120-192小時。顯微鏡檢驗樟芝發(fā)酵液中可觀察大量的無性孢子存在。發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖20-40，蛋白胨2-4，酵母粉2-4，硫酸鎂0.5-2，磷酸二氫鉀 1-4，ρΗ4· 5。5.步驟4的發(fā)酵完成后，取出部分含有樟芝無性孢子的發(fā)酵液至另一裝有新鮮發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐繼續(xù)發(fā)酵。發(fā)酵溫度^-30°C，轉(zhuǎn)速50-150rpm，通氣量0. 5-2vvm。更具體的，上述工藝的所述步驟5中的再發(fā)酵循環(huán)可根據(jù)需要重復(fù)若干次。上述步驟5中所述的取出發(fā)酵液轉(zhuǎn)移至另一裝有新鮮發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐后，無性孢子的終濃度為IO4-IO6個/mL。本發(fā)明的有益效果是采用本發(fā)明的基于無性孢子的快速發(fā)酵工藝可使樟芝發(fā)酵周期較原有分批發(fā)酵工藝至少能夠縮短40 %，發(fā)酵產(chǎn)物質(zhì)量提高，雜菌污染機會減少，成本降低。顯然，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識和慣用手段，在不脫離本發(fā)明上述基本技術(shù)思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。例如，本發(fā)明所述的基于無性孢子的樟芝快速液態(tài)發(fā)酵工藝可應(yīng)用于所有的樟芝菌種。又如，可用于樟芝發(fā)酵過程中產(chǎn)生無性孢子的發(fā)酵培養(yǎng)基組成均屬于本發(fā)明的范疇。以下通過實例形式的具體實施方式
，對本發(fā)明的上述內(nèi)容再做進一步的詳細(xì)說明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。
具體實施例方式實施例1樟芝搖瓶快速發(fā)酵工藝1.菌種以樟芝(Antrodia camphorata)保藏號為ATCC No. 200183的菌株作為出發(fā)菌種。2.斜面培養(yǎng)將樟芝菌絲體轉(zhuǎn)接至斜面培養(yǎng)基中，28°C培養(yǎng)觀8小時。斜面培養(yǎng)基(g/L):馬鈴薯200，葡萄糖20，瓊脂20，pH自然。3.種子搖瓶培養(yǎng)斜面菌種轉(zhuǎn)接入裝有IOOmL搖瓶培養(yǎng)基的500mL搖瓶中， 培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速lOOrpm，培養(yǎng)72小時。搖瓶培養(yǎng)基(g/L)葡萄糖20，蛋白胨2，硫酸鎂0.75，磷酸二氫鉀1.5，麩皮2，？!1 4. 5。4.發(fā)酵搖瓶培養(yǎng)樟芝發(fā)酵液按15%的接種量轉(zhuǎn)接入裝有IOOmL發(fā)酵培養(yǎng)基的 500mL發(fā)酵搖瓶中，28°C培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速IOOrpm，培養(yǎng)192小時。發(fā)酵完成后，顯微鏡檢驗樟芝發(fā)酵液中可觀察到大量的無性孢子存在。發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖25，蛋白胨2，酵母粉1，硫酸鎂1，磷酸二氫鉀2，pH4.5。5.發(fā)酵搖瓶連續(xù)培養(yǎng)發(fā)酵完成后取出5%發(fā)酵液轉(zhuǎn)接入另一裝有新鮮發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，孢子濃度為1. 5X IO5個/mL。轉(zhuǎn)速IOOrpm 條件下培養(yǎng)168小時。本實施例進入搖瓶快速連續(xù)發(fā)酵程序后，無性孢子循環(huán)產(chǎn)生，每次發(fā)酵周期為168 小時，與原有采用斜面菌絲體作為接種物的分批發(fā)酵相比至少縮短40%，發(fā)酵成本降低。 由于在發(fā)酵罐中樟芝無性孢子統(tǒng)一萌發(fā)并形成菌絲體，進而所得到的菌球形狀大小較為均勻，因此樟芝發(fā)酵過程重復(fù)性好、產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定。實施例2樟芝發(fā)酵罐快速發(fā)酵工藝1.菌種以樟芝(Antrodia camphorata)保藏號為BCRC No. 35398的菌株作為出發(fā)菌種。2.斜面培養(yǎng)將樟芝菌絲體轉(zhuǎn)接至斜面培養(yǎng)基中，26°C培養(yǎng)312小時。斜面培養(yǎng)基(g/L)馬鈴薯180，葡萄糖18，瓊脂18，pH自然。3.種子搖瓶培養(yǎng)將樟芝斜面菌種轉(zhuǎn)接入裝有IOOmL搖瓶培養(yǎng)基的500mL搖瓶中，26°C培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速lOOrpm，培養(yǎng)48小時。搖瓶培養(yǎng)基(g/L)葡萄糖20，蛋白胨2，硫酸鎂0. 5，磷酸二氫鉀1，麩皮2，？朋.5。4.種子罐發(fā)酵將樟芝發(fā)酵液按15%的接種量轉(zhuǎn)接入裝有種子培養(yǎng)基的種子罐中，26°C培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速150rpm，通氣量lvvm，培養(yǎng)48小時。種子罐培養(yǎng)基與搖瓶培養(yǎng)基相同。5.發(fā)酵罐發(fā)酵樟芝發(fā)酵液按15%的接種量轉(zhuǎn)接入裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中， 培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速lOOrpm，通氣量lvvm，培養(yǎng)192小時。顯微鏡檢驗樟芝發(fā)酵液中可觀察大量
的無性孢子存在。發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)葡萄糖30，蛋白胨2-4，酵母粉2-4，硫酸鎂0.5-2，磷酸二氫鉀 1-4，ρΗ4· 5。6.發(fā)酵罐連續(xù)培養(yǎng)發(fā)酵完成后取出部分含有樟芝無性孢子的發(fā)酵液至另一裝有新鮮發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐，孢子濃度為1. 5 X IO5個/mL，繼續(xù)發(fā)酵。發(fā)酵溫度^TC,轉(zhuǎn)速 lOOrpm,通氣量 lvvm。本實施例進入發(fā)酵罐快速連續(xù)發(fā)酵程序后，孢子萌發(fā)形成菌絲體，進一步形成菌球，進而又產(chǎn)生無性孢子。無性孢子循環(huán)產(chǎn)生，每次發(fā)酵周期為168小時，與原有采用斜面菌絲體作為接種物的分批發(fā)酵相比至少縮短50%，發(fā)酵成本降低。由于在發(fā)酵罐中樟芝無性孢子統(tǒng)一萌發(fā)并形成菌絲體，進而所得到的菌球形狀大小較為均勻，因此樟芝發(fā)酵過程重復(fù)性好、產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定。另外，由于減少了發(fā)酵步驟，減少了染菌的機會。
權(quán)利要求
1.一種基于無性孢子的樟芝快速發(fā)酵工藝，其特征在于a、將樟芝斜面菌種接入液體搖瓶在培養(yǎng)48-72小時得到種子液，在種子罐擴大培養(yǎng)48-72小時；b、26-30°C條件下，在發(fā)酵罐中發(fā)酵120-192小時；c、步驟b的發(fā)酵完成后，取出部分含有無性孢子的樟芝發(fā)酵液并轉(zhuǎn)移至另一裝有新鮮發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐繼續(xù)發(fā)酵。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速發(fā)酵工藝，其特征在于步驟b發(fā)酵結(jié)束時樟芝發(fā)酵液中含有無性孢子。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速發(fā)酵工藝，其特征在于步驟c中所述的取出發(fā)酵液轉(zhuǎn)移至另一裝有新鮮發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐后，無性孢子的終濃度為IO4-IO6個/mL。
4.根據(jù)權(quán)利要求1中步驟c中所述的快速發(fā)酵工藝，可根據(jù)需要重復(fù)若干次。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種基于無性孢子的樟芝快速液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)工藝。其特征在于以樟芝(Antrodia camphorata)為出發(fā)菌株，在發(fā)酵罐中發(fā)酵并產(chǎn)生無性孢子；發(fā)酵完成后取出部分含有樟芝無性孢子的發(fā)酵液至另一裝有新鮮發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐繼續(xù)發(fā)酵。該去料、補料再發(fā)酵循環(huán)可根據(jù)需要重復(fù)若干次。本發(fā)明所用快速發(fā)酵工藝可使樟芝發(fā)酵周期較分批發(fā)酵工藝至少能夠縮短40％，具有提高生產(chǎn)強度、減少染菌幾率、穩(wěn)定樟芝發(fā)酵產(chǎn)品質(zhì)量等優(yōu)點。
文檔編號A01G1/04GK102172174SQ20111005331
公開日2011年9月7日 申請日期2011年3月7日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月7日
發(fā)明者史勁松, 竇文芳, 許正宏, 許泓瑜, 錢建瑛, 陸震鳴 申請人:江南大學(xué)