一種快速制備牛樟芝無性孢子的方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，提供一種快速制備牛樟芝無性孢子的方法。該方法基于液體深層發(fā)酵技術(shù)，通過特有的發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵溫度控制，使牛樟芝于前期發(fā)酵過程中累積菌絲體，于后期不利生長環(huán)境脅迫下快速的轉(zhuǎn)變?yōu)榇罅康臒o性孢子。該溫度誘導(dǎo)脅迫方法大大縮短了孢子培養(yǎng)的周期，從而克服了目前液體發(fā)酵制備牛樟芝無性孢子周期長的問題。
【專利說明】一種快速制備牛樟芝無性孢子的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物工程領(lǐng)域，特別涉及基于液體深層發(fā)酵和溫度誘導(dǎo)脅迫快速制備牛樟芝無性孢子的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]牛樟芝是臺灣地區(qū)名貴的藥用真菌，牛樟芝外型呈板狀或鐘狀，表面呈鮭紅色，用于養(yǎng)生保健，效果遠(yuǎn)優(yōu)于靈芝，只生長在高海拔的常綠闊葉大喬木的牛樟樹上。牛樟芝富含類三萜化合物、超氧化物歧化酶、腺苷、多糖體、β -D-葡聚糖、維生素、免疫球蛋白等，常用于抗癌、抗癢、抗過敏及抗疲勞。在傳統(tǒng)療法，牛樟芝被譽(yù)為是一種“抗癌圣藥”。
[0003]目前牛樟芝人工培植的主要方法有液體發(fā)酵法、固體培養(yǎng)法和椴木栽培法。牛樟芝在椴木等固體培養(yǎng)時可以產(chǎn)生有性生殖的擔(dān)孢子，但牛樟芝產(chǎn)擔(dān)孢子所需時間較長，且不宜收集。牛樟芝菌絲體在液體培養(yǎng)過程中可以產(chǎn)生無性的節(jié)孢子或厚垣孢子，牛樟芝孢子可以提取牛樟芝孢子油或用以菌種長期保藏，快速獲得大量牛樟芝孢子，具備較大的實用價值，而液體發(fā)酵快速產(chǎn)無性孢子是大量獲得牛樟芝孢子的最佳方式。現(xiàn)有液體發(fā)酵產(chǎn)牛樟芝方法多為恒溫培養(yǎng)，培養(yǎng)周期較長，通常需要長達(dá)300個小時以上。如名稱為“一種基于無性孢子的牛樟芝快速液態(tài)發(fā)酵工藝”的發(fā)明專利公開了一種液體發(fā)酵獲得牛樟芝無性孢子的工藝，該技術(shù)牛樟芝無性孢子的培養(yǎng)時間需要長達(dá)380個小時，培養(yǎng)周期長。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種快速制備牛樟芝無性孢子的方法，以解決現(xiàn)有技術(shù)中牛樟芝孢子培養(yǎng)周期長的問題。本發(fā)明采用特定的產(chǎn)孢子培養(yǎng)基配方，通過控制不同階段的牛樟芝培養(yǎng)溫度，使牛樟芝菌絲體于不利生長環(huán)境脅迫下快速的轉(zhuǎn)變?yōu)榇罅康臒o性孢子。
[0005]本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)`方案實現(xiàn):
[0006]本發(fā)明提供一種快速制備牛樟芝無性孢子的方法，包括以下步驟:步驟一，取牛樟芝菌絲體或孢子接種到瓊脂平板培養(yǎng)基I培養(yǎng)；步驟二，將所述瓊脂平板上長有菌絲體的部分切下，接入液體培養(yǎng)基II，分階段變溫培養(yǎng)，得牛樟芝無性孢子。
[0007]作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，所述分階段變溫培養(yǎng)為:第一階段，在25_28°C下培養(yǎng)60-72小時；第二階段，將第一階段所得培養(yǎng)物在12-17°C下繼續(xù)培養(yǎng)6_8小時；第三階段，將第二階段所得培養(yǎng)物置于24-35°C下，靜置6-8小時。
[0008]作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，所述步驟二中液體培養(yǎng)基II中各組分的重量百分比為:1-2%玉米淀粉、2-4%麩皮、0.1-1%麥芽浸膏、0.1-1%蛋白胨、0.05-0.2%葡萄糖，余量為水。
[0009]作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，所述步驟一中瓊脂平板培養(yǎng)基I中各物質(zhì)的重量百分比為:2%玉米淀粉、1%麥芽浸膏、0.1%蛋白胨、0.01%樟樹精油和1.5%瓊脂粉，余量為水。
[0010]作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，所述步驟一中所述瓊脂平板培養(yǎng)基I放置于25-28°C培養(yǎng) 60-72h。
[0011]本發(fā)明的有益結(jié)果在于:(1)采取溫度脅迫誘生孢子的技術(shù)，顯著縮短培養(yǎng)周期，能夠在較短的時間內(nèi)獲取大量牛樟芝無性孢子；(2)采用的特殊產(chǎn)孢子培養(yǎng)基既保證了菌絲體在溫度誘生孢子前大量繁殖，又能夠啟動牛樟芝利用復(fù)雜碳源的酶系，傳遞培養(yǎng)基中簡單碳源耗盡的信號，為無性孢子生產(chǎn)提供了基礎(chǔ)條件。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0012]圖1是實施例1發(fā)酵液牛樟芝無性孢子400倍光學(xué)顯微鏡觀察圖； [0013]圖2是實施例1發(fā)酵液牛樟芝無性孢子5000倍掃描電鏡觀察圖。
【具體實施方式】
[0014]本發(fā)明采用特定的產(chǎn)孢子發(fā)酵培養(yǎng)基配方，通過控制不同階段的培養(yǎng)溫度，人為創(chuàng)造不利環(huán)境，使牛樟芝累積的菌絲體于不利生長環(huán)境脅迫下快速的轉(zhuǎn)變?yōu)榇罅康臒o性孢子。
[0015]本發(fā)明的具體實施方法為:
[0016]S1:挑取牛樟芝菌絲體或孢子(保藏號為ATCC200183)接種到瓊脂平板培養(yǎng)基中心位置，放置于28°C培養(yǎng)60h。
[0017]瓊脂平板培養(yǎng)基成分為2%玉米淀粉、1%麥芽浸膏、0.1%蛋白胨、0.01%樟樹精油和1.5%瓊脂粉，余量為水。
[0018]S2:將所述瓊脂平板上長有菌絲體的部分切下，并碾碎，碎屑接入含有200ml產(chǎn)孢子培養(yǎng)基的1000ml錐形瓶中，并于培養(yǎng)瓶中放置直徑約3-5mm的玻璃小球10-20個。
[0019]產(chǎn)孢子培養(yǎng)基成分為1-2%玉米淀粉、2-4%麩皮、0.1-1%麥芽浸膏、0.1_1%蛋白胨、
0.05-0.2%葡萄糖，余量為水。
[0020]S3:將所述接種有牛樟芝菌絲體的錐形瓶放置于恒溫震蕩搖床上，分階段培養(yǎng):第一階段:25-28°C，200rpm 培養(yǎng) 60-72 小時；
[0021]第二階段:將震蕩搖床溫度調(diào)節(jié)到12_17°C，繼續(xù)培養(yǎng)6-8個小時；
[0022]第三階段:將培養(yǎng)物置于24_35°C下，靜置培養(yǎng)6_8小時。
[0023]S4:取培養(yǎng)物顯微鏡檢查無性孢子生成狀態(tài)。
[0024]下面結(jié)合具體參數(shù)作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實施方式不局限于此。本發(fā)明所使用牛樟芝菌種、儀器、試劑等，均可從商業(yè)途經(jīng)獲得。
[0025]實施例1
[0026]S1:挑取牛樟芝菌絲體或孢子接種到瓊脂平板培養(yǎng)基中心位置，放置于28°C培養(yǎng)60h。瓊脂平板培養(yǎng)基成分為2%玉米淀粉、1%麥芽浸膏、0.1%蛋白胨、0.01%樟樹精油和
1.5%瓊脂粉，余量為水。
[0027]S2:將所述瓊脂平板上長有菌絲體的部分切下，并碾碎，碎屑接入含有200ml產(chǎn)孢子培養(yǎng)基的1000ml錐形瓶中，并于培養(yǎng)瓶中放置直徑約3-5mm的玻璃小球10個。產(chǎn)孢子培養(yǎng)基成分為1%玉米淀粉、2.2%麩皮、1%麥芽浸膏、0.1%蛋白胨、0.1%葡萄糖，余量為水。
[0028]S3:將所述接種有牛樟芝菌絲體的錐形瓶放置于恒溫震蕩搖床上，分階段培養(yǎng):第一階段:28°C, 200rpm培養(yǎng)72小時；[0029]第二階段:將震蕩搖床溫度調(diào)節(jié)到12°C，繼續(xù)培養(yǎng)6個小時；
[0030]第三階段:將培養(yǎng)物置于35°C下，靜置培養(yǎng)6小時。
[0031]S4:取培養(yǎng)物顯微鏡檢查無性孢子生成狀態(tài)。
[0032]實施例2
[0033]S1:挑取牛樟芝菌絲體或孢子(保藏號為CCTCC M2013359)接種到瓊脂平板培養(yǎng)基中心位置，放置于25°C培養(yǎng)72h。瓊脂平板培養(yǎng)基成分為2%玉米淀粉、1%麥芽浸膏、0.1%蛋白胨、0.01%樟樹精油和1.5%瓊脂粉，余量為水。
[0034]S2:將所述瓊脂平板上長有菌絲體的部分切下，并碾碎，碎屑接入含有100ml產(chǎn)孢子培養(yǎng)基的500ml錐形瓶中，并于培養(yǎng)瓶中放置直徑約3-5_的玻璃小球15個。產(chǎn)孢子培養(yǎng)基成分為1%玉米淀粉、2.2%麩皮、1%麥芽浸膏、0.1%蛋白胨、0.1%葡萄糖，余量為水。
[0035]S3:將所述接種有牛樟芝菌絲體的錐形瓶放置于恒溫震蕩搖床上，分階段培養(yǎng):第一階段:25°C, 180rpm培養(yǎng)60小時；
[0036] 第二階段:將震蕩搖床溫度調(diào)節(jié)到17°C，繼續(xù)培養(yǎng)8個小時；
[0037]第三階段:將培養(yǎng)物置于24°C下，靜置培養(yǎng)8小時。
[0038]S4:取培養(yǎng)物顯微鏡檢查無性孢子生成狀態(tài)。
[0039]實施例3
[0040]S1:挑取牛樟芝菌絲體或孢子(保藏號為BCRC37849)接種到瓊脂平板培養(yǎng)基中心位置，放置于26°C培養(yǎng)70h。瓊脂平板培養(yǎng)基成分為2%玉米淀粉、1%麥芽浸膏、0.1%蛋白胨、0.01%樟樹精油和1.5%瓊脂粉，余量為水。
[0041]S2:將所述瓊脂平板上長有菌絲體的部分切下，并碾碎，碎屑接入含有200ml產(chǎn)孢子培養(yǎng)基的1000ml錐形瓶中，并于培養(yǎng)瓶中放置直徑約3-5mm的玻璃小球20個。產(chǎn)孢子培養(yǎng)基成分為1%玉米淀粉、2.2%麩皮、1%麥芽浸膏、0.1%蛋白胨、0.1%葡萄糖，余量為水。
[0042]S3:將所述接種有牛樟芝菌絲體的錐形瓶放置于恒溫震蕩搖床上，分階段培養(yǎng):第一階段:26°C, 190rpm培養(yǎng)68小時；
[0043]第二階段:將震蕩搖床溫度調(diào)節(jié)到15°C，繼續(xù)培養(yǎng)7個小時；
[0044]第三階段:將培養(yǎng)物置于32°C下，靜置培養(yǎng)7小時。
[0045]S4:取培養(yǎng)物顯微鏡檢查無性孢子生成狀態(tài)。
[0046]對比例I
[0047]S1:挑取牛樟芝菌絲體或孢子(保藏號為CCTCC M2013359)接種到瓊脂平板培養(yǎng)基中心位置，放置于28°C培養(yǎng)60h。瓊脂平板培養(yǎng)基成分為2%玉米淀粉、2%麥芽浸膏、0.1%蛋白胨、0.01%樟樹精油和1.5%瓊脂粉，余量為水。
[0048]S2:將所述瓊脂平板上長有菌絲體的部分切下，并碾碎，碎屑接入含有200ml產(chǎn)孢子培養(yǎng)基的1000ml錐形瓶中，并于培養(yǎng)瓶中放置直徑約3-5mm的玻璃小球7-20個。產(chǎn)孢子培養(yǎng)基成分為1%玉米淀粉、2.2%麩皮、1%麥芽浸膏、0.1%蛋白胨、0.1%葡萄糖，余量為水。
[0049]S3:將所述接種有牛樟芝菌絲體的錐形瓶放置于恒溫震蕩搖床上，26°C，190rpm培養(yǎng)180小時。取培養(yǎng)物于顯微鏡下檢測菌絲體生長狀態(tài)及有無無性孢子生成。
[0050]S4:將培養(yǎng)物置于32°C下，靜置20小時。取培養(yǎng)物顯微鏡檢查無性孢子生成狀態(tài)。
[0051]取實施例1、2、3和對比例I培養(yǎng)液統(tǒng)計孢子數(shù)目，如下表1所示，實施例1、2、3中所示變溫培養(yǎng)較對比例I恒溫培養(yǎng)產(chǎn)孢子所需時間周期短，且本發(fā)明快速制備牛樟芝孢子的發(fā)酵方法適用于不同來源的菌種。
[0052]表1牛樟芝不同培養(yǎng)條件下無性孢子產(chǎn)生情況
【權(quán)利要求】
1.一種快速制備牛樟芝無性孢子的方法，其特征在于，包括以下步驟: 步驟一，取牛樟芝的菌絲體或孢子接種到瓊脂平板培養(yǎng)基I培養(yǎng)； 步驟二，將所述瓊脂平板上長有菌絲體的部分切下，接入液體培養(yǎng)基II，分階段變溫培養(yǎng)，得牛樟芝無性孢子。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述制備牛樟芝無性孢子的方法，其特征在于，步驟二中所述分階段變溫培養(yǎng)為: 第一階段，在25-28°C下培養(yǎng)60-72小時； 第二階段，將第一階段所得培養(yǎng)物在12-17°C下繼續(xù)培養(yǎng)6-8小時； 第三階段，將第二階段所得培養(yǎng)物置于24-35°C下，靜置6-8小時。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述制備牛樟芝無性孢子的方法，其特征在于，步驟二中液體培養(yǎng)基II中各組分的重量百分比為:1-2%玉米淀粉、2-4%麩皮、0.1-1%麥芽浸膏、0.1-1%蛋白胨、0.05-0.2%葡萄糖，余量為水。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述制備牛樟芝無性孢子的方法，其特征在于，步驟一中瓊脂平板培養(yǎng)基I中各物質(zhì)的重量百分比為:2%玉米淀粉、1%麥芽浸膏、0.1%蛋白胨、0.01%樟樹精油和1.5%瓊脂粉，余量為水。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述制備牛樟芝無性孢子的方法，其特征在于，步驟一中瓊脂平板培養(yǎng)基I中各組分的重量百分比為:2%玉米淀粉、1%麥芽浸膏、0.1%蛋白胨、0.01%樟樹精油和1.5%瓊脂粉，余量為水。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，步驟一中所述瓊脂平板培養(yǎng)基I放置于 25-28 °C 培養(yǎng) 60-72h。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，步驟一中所述瓊脂平板培養(yǎng)基I放置于25-28 °C 培養(yǎng) 60-72h。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，步驟一中所述瓊脂平板培養(yǎng)基I放置于25-28 °C 培養(yǎng) 60-72h。
【文檔編號】A01G1/04GK103650916SQ201310676580
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年12月12日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月12日
【發(fā)明者】趙宗杰, 李光飛, 謝海濤, 周榮靈 申請人:深圳市仁泰生物科技有限公司