專利名稱：一種植酸酶分泌型轉(zhuǎn)基因芽孢桿菌菌株及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基因工程菌株，具體地說，是植酸酶分泌型轉(zhuǎn)基因芽孢桿菌菌株。
背景技術(shù)：
磷是植物生長發(fā)育的必需營養(yǎng)元素之一，參與組成植物體內(nèi)許多重要化合物，是植物體生長代謝過程不可缺少的。植物所利用的磷主要來源于土壤，土壤中磷的總含量約為0.02％～0.2％(P2O50.05％～0.46％)，與其它大量營養(yǎng)元素相比含量較低。據(jù)全國土壤普查資料估算，我國有2/3的土壤缺磷。缺磷的主要原因是由于土壤有效磷含量不足，施入土壤的大量磷素在土壤中以無效態(tài)被固定。磷肥的當(dāng)季利用率一般只有10％～25％，不能滿足一般作物的生理需求。植物吸收磷的主要形式是HPO42-和H2PO4-，由于土壤溶液中這種速效磷的濃度很低，一般只有1.5μmol/L，遠(yuǎn)不能滿足植物正常生長所需，在許多土壤中磷是限制植物生長的一個主要因子。但是與氮素相比，作為磷肥原料的磷礦石資源地下埋藏量非常有限，且無法象合成氨一樣人工合成。所以由于磷礦資源的短缺，磷可能成為二十一世紀(jì)全球農(nóng)業(yè)持續(xù)發(fā)展的一個重要限制因子。
植酸或者植酸鹽是土壤中有機(jī)磷的主要形式，不同土壤中有機(jī)磷含量占土壤總含磷量的1/3～1/2，其中植酸鹽的形式約占30％～50％；核酸態(tài)約占5％～10％；其它如磷脂、磷蛋白、磷酸糖各占1％～2％，還有相當(dāng)一部分有機(jī)磷的形態(tài)目前仍不十分清楚(N.沃爾克，土壤微生物學(xué)，北京科學(xué)出版社，1981，75-87)。
土壤有機(jī)磷通常能通過生物小循環(huán)不斷補充，但是植酸鹽類大多不溶于水，不能被植物利用，只有被植酸酶水解為無機(jī)磷之后才能為作物吸收利用。土壤中的無機(jī)磷極易被固定，因此磷是農(nóng)作物生產(chǎn)中一個重要限制因子(Saxena S.N.Phytase activity of plant roots.J.Exp.Bot.，1964，15654-65)。
植酸(phytic acid)也稱肌醇六磷酸，其化學(xué)名稱為環(huán)己六醇六磷酸酯，分子式為C6H18O23P6，它是一種淡黃色或淡褐色的粘稠液體，易溶于水、乙醇，幾乎不溶于苯、氯仿、醚和己烷，比重1.59，分子量660.08。植酸本身毒性很小，但卻具有很強(qiáng)的螯合能力，與EDTA接近?？膳c多種礦物質(zhì)離子如鎂、鉀、鈣、錳、鐵、鋅螯合，形成不溶性復(fù)合物。同時，還可與蛋白質(zhì)形成螯合物；當(dāng)介質(zhì)pH值低于等電點時，生成植酸-蛋白質(zhì)復(fù)合物，高于等電點時，形成植酸-金屬離子-蛋白質(zhì)復(fù)合物，因此具有抗?fàn)I養(yǎng)作用。植酸的提取物為白色粉末，難溶于水。當(dāng)植酸鹽受到高熱時可轉(zhuǎn)化為五、四、三磷酸肌醇，其螯合能力依次下降，降至三磷酸肌醇時，對植物鈣磷吸收的影響即很小(Han Y.W.Phytase production by AspergillusFicuum on semisolid substrate selectivity and kinetic characterization，Preparative Biochemistry，1988.184459-471)。
植酸酶即肌醇六磷酸水解酶，它可以通過催化水解反應(yīng)將磷酸鹽從植酸中釋放出來，因而利用植酸酶降解土壤中的植酸，不僅可以為植物提供可以吸收利用的無機(jī)磷，降低無機(jī)化肥的施用，防止無機(jī)化肥對土壤的破壞作用，又可以降低環(huán)境中的磷污染，防止土壤中的磷流失到水體中造成水體富營養(yǎng)化。植酸鹽不僅螯合礦物質(zhì)，而且螯合蛋白質(zhì)等，運用植酸酶去除植酸的效果不僅對單個礦物元素有影響，而且對多種礦物元素具有一定作用。植酸降解，釋放出礦物元素，有利于植物的生長。
南開大學(xué)和日本北海道大學(xué)合作首次證明，番茄在缺磷條件下根系誘導(dǎo)分泌植酸酶，并證明植酸酶能夠有效地水解土壤中的植酸態(tài)、核酸態(tài)和磷脂態(tài)土壤有機(jī)磷，釋放出可被植物有效吸收的速效無機(jī)磷，但植物在正常條件下很少分泌植酸酶，在農(nóng)業(yè)上難以應(yīng)用(未發(fā)表材料)。2003年，本實驗室李桂蘭博士將無花果曲霉的植酸酶基因轉(zhuǎn)化大豆植株，使得轉(zhuǎn)基因植株根特異性表達(dá)植酸酶，分解土壤中的有機(jī)磷供植物吸收利用，成功的培育分泌植酸酶的磷高效利用型轉(zhuǎn)基因大豆，這一研究證明了這一思路的可行性(李桂蘭南開大學(xué)博士論文，2004)。
二十世紀(jì)90年代后期，利用植酸酶開發(fā)解磷工程菌的研究也引起了植物營養(yǎng)學(xué)家的興趣。隨著生物技術(shù)的發(fā)展成熟和廣泛應(yīng)用，利用基因工程手段對野生工程菌的研究已經(jīng)引起了植物營養(yǎng)學(xué)家和分子生物學(xué)家的關(guān)注，成為改善植物磷營養(yǎng)，緩解磷礦產(chǎn)資源危機(jī)，保證農(nóng)業(yè)持續(xù)發(fā)展的研究熱點。
硅酸鹽細(xì)菌是一類能分解硅酸鹽礦物的細(xì)菌的俗稱，經(jīng)研究認(rèn)為有釋放鋁硅酸鹽礦物中鉀素的能力，又稱鉀細(xì)菌，常見種為膠質(zhì)芽孢桿菌(Bacillus mucilaginosus)。該菌能分解長石、云母、土壤礦物等鋁硅酸鹽類的原生態(tài)礦物，使土壤中難溶性K、P、Si等轉(zhuǎn)變?yōu)榭扇苄晕镔|(zhì)供植物生長利用，同時還可以產(chǎn)生多種生物活性物質(zhì)促進(jìn)植物生長。田間實驗表明，以膠質(zhì)芽孢桿菌為主要成分的生物鉀肥在缺鉀土壤中對各種農(nóng)作物表現(xiàn)出較好的增產(chǎn)效果。因此，該菌作為一種生物鉀肥在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上被廣泛應(yīng)用(賀積強(qiáng)，李登煜，張小平等。硅酸鹽細(xì)菌研究進(jìn)展。西南農(nóng)業(yè)學(xué)報，1999，12102～108)。
針對上述情況，2001年，我們從土壤中篩選出一株具有較好的磷鉀促溶、促進(jìn)植物生長，并有抑制植物病原菌作用的野生型膠質(zhì)芽孢桿菌D4B1菌株[吳作為，吳穎運，李欣等。膠質(zhì)芽胞桿菌(Bacillus mucilaginosus)D4B1菌株生理特性研究。土壤肥料，2004(2)40-43]，該菌株的許多特性特別適合于開發(fā)微生物菌肥。但實驗表明該菌沒有明顯的植酸酶活性，不能分解土壤中的植酸。我們采用微轉(zhuǎn)座子技術(shù)將外源的植酸酶基因穩(wěn)定地整合到膠質(zhì)芽胞桿菌的基因組DNA上，構(gòu)建組成型表達(dá)植酸酶的解磷解鉀多功能工程菌，可用于開發(fā)工程菌肥，改善植物磷營養(yǎng)。
硅酸鹽細(xì)菌又稱膠質(zhì)芽孢桿菌，是一類特殊的土壤微生物，它能夠產(chǎn)生大量的胞外多糖，并且能夠分解土壤中的礦物質(zhì)，釋放出能夠被植物直接吸收利用的可溶性鉀、磷和硅，在農(nóng)業(yè)和工業(yè)上有很大的應(yīng)用價值。為提高其分解植酸態(tài)有機(jī)磷的能力，本發(fā)明將一個植酸酶分泌表達(dá)元件插入到轉(zhuǎn)座子載體pSZ21的mini-Tn5內(nèi)，構(gòu)建成為植酸酶分泌型表達(dá)載體pSP43，首次通過基因槍的方法成功地將其轉(zhuǎn)化到硅酸鹽細(xì)菌內(nèi)，構(gòu)建了多功能的工程菌。通過Southern-blot分析，篩選到三個目的基因被穩(wěn)定地整合到細(xì)菌染色體上的工程菌株。植酸酶活性分析表明，工程菌的植酸酶活性比出發(fā)菌提高了36-46倍。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明填補了野生芽孢桿菌不能分泌植酸酶和分解土壤有機(jī)磷的缺陷，克隆了無花果曲酶的植酸酶基因，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)將其穩(wěn)定地整合到膠質(zhì)芽孢桿菌的基因組DNA上，用于制備植酸酶分泌型多功能微生物菌肥，有效利用可通過生物小循環(huán)再生的土壤有機(jī)磷，緩解磷資源短缺，減少無機(jī)化肥的施用量，降低濫施無機(jī)磷化肥對土壤及環(huán)境的破壞作用。
為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的把植酸酶分泌表達(dá)載體pSP43轉(zhuǎn)化到野生芽孢桿菌D4B1菌株中，構(gòu)建成多功能工程菌，該菌株被命名為NKTS。本發(fā)明人保證從申請日起20年內(nèi)向公眾提供該工程菌。
本發(fā)明是使用基因槍轉(zhuǎn)化的方法將植酸酶分泌表達(dá)載體pSP43導(dǎo)入到膠質(zhì)芽孢桿菌D4B1菌株中。
(1)工程菌的構(gòu)建方法1)質(zhì)粒的構(gòu)建以含有無花果曲霉植酸酶基因(phyA)的pMP2質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增不含有ATG起始密碼子的phyA基因。引物序列如下上游引物5′-ATGCCCGGGCTGGCAGTCCCCGCCTCGAGAAAT-3′下游引物5′-CTATCTAGACTAAGCAAAACACTCCGCCCAATC-3′下劃線部分為SmaI(上游引物)和XbaI(下游引物)識別位點。
擴(kuò)增出的片段與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，經(jīng)過酶切鑒定和植酸酶活性檢測，挑選出陽性轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒，用SmaI和XbaI雙酶切，回收1.4kb的phyA基因，克隆到芽孢桿菌分泌表達(dá)載體pUC980中，用EcoRI-XbaI雙酶切，回收1.9kb的片段，然后補平末端，與補平末端的自殺質(zhì)粒pSZ21連接，構(gòu)建成的載體命名為pSP43(圖1)。
2)膠質(zhì)芽孢桿菌的轉(zhuǎn)化使用基因槍轉(zhuǎn)化法將植酸酶分泌表達(dá)載體pSP43導(dǎo)入到膠質(zhì)芽孢桿菌D4B1中。本實驗使用的基因槍是PDS-1000/HE壓縮氣流傳送微彈。
①細(xì)菌細(xì)胞的預(yù)處理過夜培養(yǎng)的膠質(zhì)芽孢桿菌以1∶10的比例接種到新鮮的生長培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)至合適的細(xì)菌濃度(OD600＝1.0)，然后用高滲培養(yǎng)基(0.4mol/L甘露醇)處理4小時，4℃離心(5000轉(zhuǎn)/分鐘)5分鐘，收集菌體，以每毫升培養(yǎng)基中0.5克菌體的比例重懸于培養(yǎng)基中，將重懸的菌體均勻涂布于固體培養(yǎng)平板的表面，30℃培養(yǎng)4小時。
②DNA包裹微彈取金粉懸浮液(60mg金粉用無水乙醇消毒，懸浮于1mL無菌水中)50μL，加入5μg質(zhì)粒DNA、50μL的2.5mol/L CaCl2、20μL的0.1mol/L亞精胺，充分混勻，離心，70％乙醇洗沉淀，再重新懸浮于48μL無水乙醇中，每槍8μL均勻滴加在轟擊膜上。
③基因槍轟擊按照該基因槍手冊所述程序?qū)Π胁牧线M(jìn)行轟擊，其中可裂膜的壓力為1100psi，靶材料距離可裂膜9cm，轟擊后的細(xì)菌培養(yǎng)2小時后，轉(zhuǎn)入到含50mg/L卡那霉素生長培養(yǎng)基上篩選轉(zhuǎn)化子。以phyA基因為探針，對工程菌進(jìn)行Southern blot檢測，發(fā)現(xiàn)含有phyA基因(圖2)。圖2中各個泳道分別是1，野生菌；2，工程菌NKTS-1；3，工程菌NKTS-2；4，工程菌NKTS-3；5，質(zhì)粒pSP43。
3)植酸酶活性測定用磷鉬藍(lán)顯色(AMES)法測定。一個酶活力單位(U)定義為每分鐘釋放1μmol無機(jī)磷所需要的酶量。對3個工程菌進(jìn)行植酸酶活性測定，結(jié)果見圖3。對3個工程菌進(jìn)行SDS-PAGE檢測，發(fā)現(xiàn)都存在51kD的植酸酶蛋白(圖4)。
(2)微生物肥料的制備方法1)菌種的發(fā)酵培養(yǎng)菌種的發(fā)酵條件培養(yǎng)基是從多個配方中篩選較適宜的發(fā)酵培養(yǎng)基。該培養(yǎng)基易得，價格低廉，菌體生長良好。培養(yǎng)溫度在20～50℃范圍內(nèi)均能生長，最適溫度為28～32℃。pH值在4.0～8.5范圍內(nèi)均能正常生長，最適pH為5～7.5。菌種經(jīng)種子罐(20～25小時)和發(fā)酵罐(15～20小時)培養(yǎng)。
2)載體吸附以草炭作為載體，過顆粒度為317.5微米篩，每袋500g，菌液與草炭比例約為1∶4。
3)施用方法①移栽時將750g工程菌粉劑與適量細(xì)土拌勻后穴施。
②將工程菌發(fā)酵液750ml稀釋125倍，移栽蘸根后將所剩液體進(jìn)行灌根；在栽培管理上，應(yīng)將地平整，畝施餅肥20kg，煙草專用肥30kg，畝栽苗1666株(行距0.8m，株距0.5m)，其他按正常田間管理即可。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是該菌不僅具有硅酸鹽細(xì)菌的優(yōu)良特征，還能夠分泌植酸酶，分解土壤中的有機(jī)磷，將植酸分解成為能被植物吸收利用的無機(jī)磷，有效利用可通過生物小循環(huán)再生的土壤有機(jī)磷，緩解磷資源短缺，提高作物產(chǎn)量20％以上，減少無機(jī)化肥的施用量20％以上，降低過度施用無機(jī)磷化肥對土壤及環(huán)境的破壞作用。
下面結(jié)合附圖與具體實施方式
對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。


圖1植酸酶分泌表達(dá)載體pSP43圖2工程菌的Southen-blot檢測結(jié)果圖3工程菌的SDS-PAGE檢測結(jié)果圖4工程菌分泌植酸酶活性檢測結(jié)果
具體實施例方式
實施例1(1)工程菌的構(gòu)建方法1)質(zhì)粒的構(gòu)建以含有無花果曲霉植酸酶基因(phyA)的pMP2質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增不含有ATG起始密碼子的phyA基因。引物序列如下上游引物5′-ATGCCCGGGCTGGCAGTCCCCGCCTCGAGAAAT-3′下游引物5′-CTATCTAGACTAAGCAAAACACTCCGCCCAATC-3′下劃線部分為SmaI(上游引物)和XbaI(下游引物)識別位點。
PCR反應(yīng)體系 dNTP0.4μlBuffer 2.0μl上游primer 1.0μl下游primer 1.0μlTaq plus0.5μlcDNA模板1.0μlH2O14.1μl總計20.0μlPCR反應(yīng)程序 擴(kuò)增出的片段與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，經(jīng)過酶切鑒定和植酸酶活性檢測，挑選出陽性轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒，用SmaI和XbaI雙酶切，回收1.4kb的phyA基因，克隆到芽孢桿菌分泌表達(dá)載體pUC980中，用EcoRI-XbaI雙酶切，回收1.9kb的片段，然后補平末端，與補平末端的自殺質(zhì)粒pSZ21連接，構(gòu)建成的載體命名為pSP43。
2)膠質(zhì)芽孢桿菌的轉(zhuǎn)化使用基因槍轉(zhuǎn)化法將植酸酶分泌表達(dá)載體pSP43導(dǎo)入到膠質(zhì)芽孢桿菌D4B1中。本實驗使用的基因槍是PDS-1000/HE壓縮氣流傳送微彈。
①細(xì)菌細(xì)胞的預(yù)處理過夜培養(yǎng)的膠質(zhì)芽孢桿菌以1∶10的比例接種到新鮮的生長培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)至合適的細(xì)菌濃度(OD600＝1.0)，然后用高滲培養(yǎng)基(0.4mol/L甘露醇)處理4小時，4℃離心(5000轉(zhuǎn)/分鐘)5分鐘，收集菌體，以每毫升培養(yǎng)基中0.5克菌體的比例重懸于培養(yǎng)基中，將重懸的菌體均勻涂布于固體培養(yǎng)平板的表面，30℃培養(yǎng)4小時。
②DNA包裹微彈取金粉懸浮液(60mg金粉用無水乙醇消毒，懸浮于1mL無菌水中)50μL，加入5μg質(zhì)粒DNA、50μL的2.5mol/L CaCl2、20μL的0.1mol/L亞精胺，充分混勻，離心，70％乙醇洗沉淀，再重新懸浮于48μL無水乙醇中，每槍8μL均勻滴加在轟擊膜上。
③基因槍轟擊按照該基因槍手冊所述程序?qū)Π胁牧线M(jìn)行轟擊，其中可裂膜的壓力為1100psi，靶材料距離可裂膜9cm，轟擊后的細(xì)菌培養(yǎng)2小時后，轉(zhuǎn)入到含50mg/L卡那霉素生長培養(yǎng)基上篩選轉(zhuǎn)化子。
3)植酸酶活性測定用磷鉬藍(lán)顯色(AMES)法測定。一個酶活力單位(U)定義為每分鐘釋放1μmol無機(jī)磷所需要的酶量。
(2)工程菌的發(fā)酵培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因芽胞桿菌20℃條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)基為調(diào)整的有氮培養(yǎng)基(蔗糖10克，K2HPO42g，NaCl 0.2g，MgSO4·7H2O 0.5g，(NH4)2SO41g，酵母粉1g，F(xiàn)eCl30.005g，CaCO30.1g，蒸餾水1000mL，pH7.0)中，培養(yǎng)24小時。
實施例2(1)工程菌的構(gòu)建方法同實施例1。
(2)工程菌的發(fā)酵培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因芽胞桿菌50℃條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)基為調(diào)整的有氮培養(yǎng)基(蔗糖10克，K2HPO42g，NaCl 0.2g，MgSO4·7H2O 0.5g，(NH4)2SO41g，酵母粉1g，F(xiàn)eCl30.005g，CaCO30.1g，蒸餾水1000mL，PH 7.0)中，培養(yǎng)24小時。
實施例3(1)工程菌的構(gòu)建方法同實施例1。
(2)工程菌的發(fā)酵培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因芽胞桿菌30℃條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)基為調(diào)整的有氮培養(yǎng)基(蔗糖10克，K2HPO42g，NaCl 0.2g，MgSO4·7H2O 0.5g，(NH4)2SO41g，酵母粉1g，F(xiàn)eCl30.005g，CaCO30.1g，蒸餾水1000mL，pH 7.0)中，培養(yǎng)24小時。
實施例4(1)工程菌的構(gòu)建方法同實施例1。
(2)工程菌的發(fā)酵培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因芽胞桿菌30℃條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)基為調(diào)整的有氮培養(yǎng)基(蔗糖10克，K2HPO42g，NaCl 0.2g，MgSO4·7H2O 0.5g，(NH4)2SO4lg，酵母粉1g，F(xiàn)eCl30.005g，CaCO30.1g，蒸餾水1000mL，pH 4.0)中，培養(yǎng)24小時。
實施例5(1)工程菌的構(gòu)建方法同實施例1。
(2)工程菌的發(fā)酵培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因芽胞桿菌30℃條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)基為調(diào)整的有氮培養(yǎng)基(蔗糖10克，K2HPO42g，NaCl 0.2g，MgSO4·7H2O 0.5g，(NH4)2SO41g，酵母粉1g，F(xiàn)eCl30.005g，CaCO30.1g，蒸餾水1000ml，pH8.0)中，培養(yǎng)24小時。
實施例6(1)工程菌的構(gòu)建方法同實施例1。
(2)工程菌的發(fā)酵培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因芽胞桿菌30℃條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)基為調(diào)整的有氮培養(yǎng)基(蔗糖10克，K2HPO42g，NaCl 0.2g，MgSO4·7H2O 0.5g，(NH4)2SO41g，酵母粉1g，F(xiàn)eCl30.005g，CaCO30.1g，蒸餾水1000mL，pH7.5)中，培養(yǎng)24小時。
實施例7(1)工程菌的構(gòu)建方法同實施例1。
(2)工程菌的發(fā)酵培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因芽胞桿菌30℃條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)基為調(diào)整的有氮培養(yǎng)基(蔗糖10克，K2HPO42g，NaCl 0.2g，MgSO4·7H2O 0.5g，(NH4)2SO41g，酵母粉1g，F(xiàn)eCl30.005g，CaCO30.1g，蒸餾水1000mL，pH7.5)中，培養(yǎng)20小時。
實施例8(1)工程菌的構(gòu)建方法同實施例1。
(2)工程菌的發(fā)酵培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因芽胞桿菌30℃條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)基為調(diào)整的有氮培養(yǎng)基(蔗糖10克，K2HPO42g，NaCl 0.2g，MgSO4·7H2O 0.5g，(NH4)2SO41g，酵母粉1g，F(xiàn)eCl30.005g，CaCO30.1g，蒸餾水1000mL，pH7.5)中，培養(yǎng)30小時。
實施例9(1)工程菌的構(gòu)建方法同實施例1。
(2)工程菌的發(fā)酵培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因芽胞桿菌30℃條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)基為調(diào)整的有氮培養(yǎng)基(蔗糖10克，K2HPO42g，NaCl 0.2g，MgSO4·7H2O 0.5g(NH4)2SO41g，酵母粉1g，F(xiàn)eCl30.005g，CaCO30.1g，蒸餾水1000mL，pH7.5)中，培養(yǎng)25小時。
應(yīng)用實施例根據(jù)在山西石灰性土壤的大田煙草上的試驗結(jié)果，和空白對照比較，轉(zhuǎn)基因芽胞桿菌發(fā)酵液的增產(chǎn)效果最好，增產(chǎn)幅度最高，比對照增產(chǎn)24.4％。與草炭混合的工程菌粉劑的增產(chǎn)效果次之，比對照增產(chǎn)19.5％(表1)。上述增產(chǎn)效果較高的施肥處理，其長勢包括株高、株葉數(shù)等均表現(xiàn)出明顯優(yōu)勢(表2)，節(jié)約磷肥效果達(dá)到30％，節(jié)約鉀肥效果達(dá)到20％(表3)。
表1 大田試驗產(chǎn)量結(jié)果

表2工程菌對煙草長勢的影響結(jié)果

表3工程菌對土壤磷、鉀含量影響結(jié)果

序列列表SEQUENCE LISTING<110>南開大學(xué)<120>一株植酸酶分泌型轉(zhuǎn)基因芽孢桿菌及其應(yīng)用<130>20050527<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>33<212>DNA<213>NKTS<400>1
atgcccgggc tggcagtccc cgcctcgaga aat 33<210>2<211>33<212>DNA<213>NKTS<400>2ctatctagac taagcaaaac actccgccca atc 3權(quán)利要求
1.一種植酸酶分泌型轉(zhuǎn)基因芽孢桿菌菌株，其特征在于，該菌株命名為NKTS，它是使用基因槍轉(zhuǎn)化的方法將植酸酶分泌表達(dá)載體導(dǎo)入到野生芽孢桿菌(Bacillus mucilaginosus)中構(gòu)建成的多功能工程菌。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種植酸酶分泌型轉(zhuǎn)基因芽孢桿菌菌株及其應(yīng)用，其特征在于，所述的載體為pSP43，其構(gòu)建方法如下以含有無花果曲霉植酸酶基因(phyA)的pMP2質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增不含有ATG起始密碼子的phyA基因，設(shè)計的引物序列如下上游引物5′-ATGCCCGGGCTGGCAGTCCCCGCCTCGAGAAAT-3′下游引物5′-CTATCTAGACTAAGCAAAACACTCCGCCCAATC-3′下劃線部分為SmaI(上游引物)和XbaI(下游引物)識別位點，擴(kuò)增出的片段與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，經(jīng)過酶切鑒定和植酸酶活性檢測，挑選出陽性轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒，用SmaI和XbaI雙酶切，回收1.4kb的phyA基因，克隆到芽孢桿菌分泌表達(dá)載體pUC980中，用EcoRI-XbaI雙酶切，回收1.9kb的片段，然后補平末端，與補平末端的自殺質(zhì)粒pSZ21連接，構(gòu)建成的載體命名為pSP43。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種植酸酶分泌型轉(zhuǎn)基因芽孢桿菌菌株，其特征在于，所述的野生芽孢桿菌為膠質(zhì)芽孢桿菌(Bacillus mucilaginosus)D4B1。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種植酸酶分泌型轉(zhuǎn)基因芽孢桿菌菌株，其特征在于，該工程菌的構(gòu)建過程如下質(zhì)粒的構(gòu)建；膠質(zhì)芽孢桿菌的轉(zhuǎn)化；植酸酶活性測定。
5.一種植酸酶分泌型轉(zhuǎn)基因芽孢桿菌菌株的應(yīng)用，其特征在于，該菌株作為微生物肥料的應(yīng)用。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種植酸酶分泌型轉(zhuǎn)基因芽孢桿菌菌株的應(yīng)用，其特征在于，微生物肥料的制備方法如下·菌種的發(fā)酵培養(yǎng)培養(yǎng)溫度為20～50℃，培養(yǎng)基pH值為4.0～8.5，菌種經(jīng)種子罐(20～25小時)和發(fā)酵罐(15～20小時)培養(yǎng)；·載體吸附以草炭作為載體，過顆粒度為317.5微米篩，每袋500g，菌液與草炭比例大約為1∶4；·施用方法(1)移栽時將750g工程菌粉劑與適量細(xì)土拌勻后穴施；(2)將工程菌發(fā)酵液750mL稀釋125倍，移栽蘸根后將所剩液體進(jìn)行灌根；在栽培管理上，應(yīng)將地平整，畝施餅肥20kg，煙草專用肥30kg，畝栽苗1666株(行距0.8m，株距0.5m)，其他按正常田間管理即可。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種植酸酶分泌型轉(zhuǎn)基因芽孢桿菌菌株的應(yīng)用，其特征在于，所述的培養(yǎng)溫度為28～32℃。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種植酸酶分泌型轉(zhuǎn)基因芽孢桿菌菌株的應(yīng)用，其特征在于，所述的工程菌培養(yǎng)基的pH為5～7.5。
全文摘要
一種植酸酶分泌型轉(zhuǎn)基因芽孢桿菌菌株NKTS，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。植酸是土壤中磷的主要存在方式，但必須被植酸酶分解后才能被植物吸收利用。作為一種微生物肥料的硅酸鹽細(xì)菌不分泌植酸酶，限制了它的應(yīng)用。本發(fā)明將一個植酸酶分泌表達(dá)元件插入到轉(zhuǎn)座子載體pSZ21的mini－Tn5之內(nèi)，構(gòu)建成植酸酶分泌表達(dá)載體pSP43，首次通過基因槍的方法成功地將其轉(zhuǎn)化到硅酸鹽細(xì)菌內(nèi)，構(gòu)建了一個多功能的工程菌。彌補了野生芽孢桿菌不能分泌植酸酶、分解土壤有機(jī)磷的缺陷。轉(zhuǎn)基因芽胞桿菌發(fā)酵液的增產(chǎn)效果最好，比對照增產(chǎn)24.4％。與草炭混合的工程菌粉劑的增產(chǎn)效果次之，比對照增產(chǎn)19.5％，節(jié)約磷肥效果達(dá)到30％，節(jié)約鉀肥效果達(dá)到20％。
文檔編號C05F11/00GK1733902SQ20051001430
公開日2006年2月15日 申請日期2005年7月1日 優(yōu)先權(quán)日2005年7月1日
發(fā)明者李明剛, 李欣, 張克勤, 吳穎運, 吳作為, 李俊, 李力 申請人:南開大學(xué)