一株土芽孢乳桿菌及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種土芽孢乳桿菌HKM-1，及利用其發(fā)酵生產(chǎn)D-乳酸的方法。本發(fā)明的土芽孢乳桿菌(Sporolactobacillus?terrae)HKM-1，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號CCTCC?NO:M2013389，同時保藏于德國微生物菌種保藏中心，保藏號DSM?No.27555。HKM-1能夠利用廉價氮源-玉米漿干粉發(fā)酵生產(chǎn)D-乳酸，最高D-乳酸發(fā)酵產(chǎn)量為197g/L，對應(yīng)的發(fā)酵周期僅為47h，發(fā)酵生產(chǎn)能力高達(dá)4.19g/L/h，遠(yuǎn)超過目前已公開報道的值；本發(fā)明所使用的菌株HKM-1，具有穩(wěn)定的高產(chǎn)性能和產(chǎn)高光學(xué)純度D-乳酸特點(diǎn)，所產(chǎn)的D-乳酸光學(xué)純度達(dá)99.9%；發(fā)酵所用的原料來源廣泛，價格低廉，發(fā)酵狀態(tài)介于厭氧和微氧之間；利用本發(fā)明的方法發(fā)酵生產(chǎn)D-乳酸，能夠節(jié)約成本，提高生產(chǎn)效率，具有重要的工業(yè)應(yīng)用價值。
【專利說明】一株土芽孢乳桿菌及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明公開了一株D-乳酸制備【技術(shù)領(lǐng)域】的菌株及其應(yīng)用方法，具體是一種利用廉價氮源-玉米漿干粉作為有機(jī)氮源制備高光學(xué)純度、高濃度D-乳酸的土芽孢乳桿菌及其應(yīng)用方法。
【背景技術(shù)】
[0002]乳酸(lacticacid)又名 α -羥基丙酸(a-hydroxypropionic acid),因旋光性不同，可以分為D-乳酸、L-乳酸和DL-乳酸。其生產(chǎn)方法主要有化學(xué)合成法和微生物發(fā)酵法，化學(xué)法只能合成DL-乳酸，而發(fā)酵法根據(jù)所采用菌株的不同，可以合成單一的L-乳酸、D-乳酸或者DL-乳酸。目前，約90%的乳酸是通過微生物發(fā)酵法生產(chǎn)的。由于人體只有代謝L-乳酸的L-乳酸脫氫酶，L-乳酸作為食品添加劑等被廣泛使用，加之L-乳酸在聚乳酸方面的應(yīng)用，L-乳酸高產(chǎn)菌的選育及高效生產(chǎn)工藝已得到高度的開發(fā)，而D-乳酸的研究則相對較少。
[0003]D-乳酸作為一個重要的手性中間體，廣泛的應(yīng)用于醫(yī)藥、農(nóng)藥、化工等方面的多種手性物質(zhì)合成。尤其是D-乳酸可作為下一代高強(qiáng)度生物可降解塑料聚乳酸的單體，引起全球大公司和科學(xué)家的高度關(guān)注。D-乳酸的全球需求量每年都以6~8%的速度增長，目前全世界D-乳酸的產(chǎn)量為1.6萬噸，而D-乳酸的需求量約2.6萬噸，由此可見，D-乳酸的市場前景廣泛。
[0004]近年來，芳氧丙酸類除草劑在農(nóng)業(yè)中的應(yīng)用越來越廣泛，這類除草劑是國際上最早實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)的一大類旋光性除草劑，此類除草劑中有一個手性碳原子，其中D(_)型的藥性比L(+)型高出6~12倍，合成這類除草劑最重要的原料是R-(+)-2-氯丙酸。以D-乳酸為原料可以制備光學(xué)活`性的R-(+)_2-氯丙酸，即D-乳酸是制備這類除草劑的光學(xué)活性前體。
[0005]隨著新型生物材料的普及推廣，L-乳酸、D-乳酸在新材料的應(yīng)用方面有了很大的發(fā)展。例如，以乳酸為原料來制造聚乳酸類(PLA)生物降解塑料。聚乳酸以其良好的生物可降解性及其它優(yōu)良的使用特性(如透明性、熱塑性、產(chǎn)物安全性等)而被認(rèn)為是理想的取代傳統(tǒng)塑料的生物材料之一。聚乳酸(PLA)分為聚D-乳酸(PDLA)、聚L-乳酸(PLLA)和聚DL-乳酸(PDLLA)。由純的D-乳酸、L-乳酸或者DL-乳酸聚合而成的聚乳酸具有更好的穩(wěn)定性，其中，PDLA具有更好的熱穩(wěn)定性。聚乳酸具有良好的生物可降解性，在使用之后可以被自然界中微生物完全降解，不污染環(huán)境，對環(huán)境保護(hù)非常有利。
[0006]南京工業(yè)大學(xué)丁子建等于2004年首次報道利用芽孢乳桿菌(Sporolactobacillus sp.)從葡萄糖發(fā)酵產(chǎn)D-乳酸的工藝，發(fā)酵72h后產(chǎn)酸40.7g/L,光學(xué)純度96% ;南京工業(yè)大學(xué)楊文革等在2006年發(fā)表組合發(fā)酵生產(chǎn)D-乳酸工藝(中國專利申請?zhí)朇N200610097453.6)以乳桿菌(Lactobacillus)進(jìn)行有氧、微氧、厭氧三段組合發(fā)酵技術(shù)，發(fā)酵時間25~38h，產(chǎn)酸達(dá)到75~131g/L ;申請?zhí)枮镃N201010101421.5的中國發(fā)明專利公開了利用重組大腸桿菌以甘油為原料發(fā)酵制備D-乳酸的方法，但是菌株對酸的耐受性差，生產(chǎn)率低，使得大腸桿菌在D-乳酸實際應(yīng)用當(dāng)中受到限制；申請?zhí)枮镃N201010247826.X的中國發(fā)明公開了利用基因工程手段，成功構(gòu)建了產(chǎn)高光學(xué)純度D-乳酸的基因工程菌并利用其進(jìn)行乳酸發(fā)酵生產(chǎn)，其D-乳酸產(chǎn)量達(dá)到40g/L以上，純度為99%以上；申請?zhí)枮镃N201010235511.3的中國發(fā)明專利公開了利用同源重組的方法得到產(chǎn)純D-乳酸的基因工程菌并用其進(jìn)行乳酸發(fā)酵生產(chǎn)，其D-乳酸產(chǎn)量僅為20g/L以上，純度為99%以上；申請?zhí)枮镃N201010235511.3的中國發(fā)明專利公開了利用同源重組的方法得到產(chǎn)純D-乳酸的基因工程菌并用其進(jìn)行乳酸發(fā)酵生產(chǎn)，其D-乳酸產(chǎn)量僅為20g/L以上，純度為99%以上。上述現(xiàn)有技術(shù)中D-乳酸的產(chǎn)量普遍不高。繼續(xù)檢索發(fā)現(xiàn):申請?zhí)枮镃N200810098908.5的中國發(fā)明專利公開了一株高光學(xué)純度D-乳酸生產(chǎn)菌及其發(fā)酵生產(chǎn)D-乳酸的工藝，申請?zhí)枮镃N201210472413.0的中國發(fā)明專利公開了一株乳桿菌及利用其發(fā)酵生產(chǎn)D-乳酸的方法，申請?zhí)枮镃N201010208148.6的中國發(fā)明專利公開了一種采用花生柏同步酶解發(fā)酵生產(chǎn)高濃度D-乳酸的方法及其專用培養(yǎng)基。上述現(xiàn)有技術(shù)發(fā)酵時間過長，均在70h以上。這些公開的技術(shù)，與L-乳酸生產(chǎn)菌株和方法相比，D-乳酸生產(chǎn)菌株和方法存在發(fā)酵時間過長或者產(chǎn)D-乳酸濃度相對較低的缺點(diǎn)，需要進(jìn)一步開發(fā)基于高效D-乳酸生產(chǎn)菌株的生產(chǎn)方法。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)存在的上述不足，提供一種用于制備D-乳酸的芽孢乳桿菌及其應(yīng)用方法，可以直接利用六碳糖，如葡萄糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖等作為碳源；酵母粉、蛋白胨、花生柏、玉米漿干粉作為氮源發(fā)酵生產(chǎn)D-乳酸，發(fā)酵生產(chǎn)高濃度、高光學(xué)純度的D-乳酸，在節(jié)約成本的同時提高生產(chǎn)效率，適合于工業(yè)生產(chǎn)中推廣應(yīng)用。所述芽孢乳桿菌為土芽孢乳桿菌(Sporolactobacillus terrae)HKM_l,保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心,簡稱CCTCC，保藏編號為CCTCC N0:M2013389，保藏日期為:2013年9月2日，保藏單位地址:中國武漢武漢大學(xué)，分類命名:土芽孢乳桿菌Sporolactobacillus terrae。
[0008]本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的:本發(fā)明涉及上述用于制備D-乳酸的芽孢乳桿菌的應(yīng)用方法:首先對芽孢乳桿菌進(jìn)行種子培養(yǎng)獲得種子培養(yǎng)液，然后以葡萄糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖作為碳源，酵母粉、蛋白胨、花生柏、玉米漿干粉作為氮源的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，得到D-乳酸。
[0009]具體包括如下步驟:
[0010]I)斜面培養(yǎng)
[0011]將土芽孢乳桿菌(HKM-1)菌種接種于含有20g/L瓊脂的固體斜面培養(yǎng)基上，40~45 °C條件下，培養(yǎng)24~48h ；
[0012]2)種子培養(yǎng)
[0013]將經(jīng)過斜面培養(yǎng)的芽孢乳桿菌在無菌條件下接種到種子培養(yǎng)基中，35~45°C條件下，靜止培養(yǎng)24~36h，加入中和劑控制發(fā)酵液pH，制得種子培養(yǎng)液；
[0014]3)發(fā)酵培養(yǎng)
[0015]按5~20%體積比的接種量接入到發(fā)酵培養(yǎng)基中，在35°C~45°C環(huán)境下培養(yǎng)48~72h，溫度優(yōu)選42 °C。
[0016]優(yōu)選地，步驟2)所述的種子培養(yǎng)基每升中含有:葡萄糖100~120g，酵母粉8~12g,蛋白胨3~8g,碳酸鈣50g,余量為水,優(yōu)選含有:葡萄糖100g,酵母粉IOg,蛋白胨5g,碳酸鈣50g，余量為水；該種子培養(yǎng)基的pH為6.0。115°C滅菌15min。中和劑包括NaOH、NH4OH和Ca (OH) 2中的一種或幾種。
[0017]優(yōu)選地，步驟3)中所述的發(fā)酵培養(yǎng)基的組分及其含量為:碳源40~120g/L、氮源添加量5~20g/L。
[0018]優(yōu)選地，步驟3)中所述的發(fā)酵培養(yǎng)基的組分及其含量為:葡萄糖/蔗糖/麥芽糖/果糖40~120g/L、玉米漿干粉10~20g/L、酵母粉3~10g/L、蛋白胨3~10g/L、花生柏5~20g/L，用于調(diào)控培養(yǎng)基pH的中和劑(NH40H、Na0H、Ca(0H)2)，余量為水。115°C滅菌15min。
[0019]優(yōu)選地，步驟3)中所述的發(fā)酵工藝為補(bǔ)料流加工藝，該補(bǔ)料流加工藝是指:當(dāng)發(fā)酵液中總還原糖含量低于20~30g/L時補(bǔ)加碳源,使總還原糖含量維持在30~70g/L,或達(dá)到50~70g/L。
[0020]優(yōu)選地，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基的pH為5.0~7.0。
[0021]以葡萄糖、蔗糖、果糖、麥芽糖作為碳源，酵母粉、蛋白胨、花生柏、玉米漿干粉作為氮源。上述原料可從商業(yè)途徑獲得。
[0022]本發(fā)明選用葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、果糖作為碳源，酵母粉、蛋白胨、花生柏、玉米漿干粉作為氮源，通過提供相應(yīng)的發(fā)酵工藝條件，使得該D-乳酸生產(chǎn)工藝原料易得，成本低廉，D-乳酸產(chǎn)量最高可達(dá)197g/L，光學(xué)純度大于99.9%，糖酸轉(zhuǎn)化率最高可達(dá)0.94g/g，發(fā)酵生產(chǎn)能力4.19g/L/h。因此，利用本發(fā)明方法生產(chǎn)D-乳酸，能節(jié)約成本、簡化操作流程，具有廣闊的工業(yè)應(yīng)用前景。
【專利附圖】

【附圖說明】
`[0023]圖1為土芽孢乳桿菌(HKM-1)的16S rRNA系統(tǒng)進(jìn)化樹分析圖。
[0024]圖中:實線的水平距離(長度之和)代表菌株的進(jìn)化距離，選取的參照菌是與本發(fā)明提供的土芽孢乳桿菌(HKM-1)親緣關(guān)系較近的菌株，共10株。
【具體實施方式】
[0025]下面對本發(fā)明的實施例作詳細(xì)說明，本實施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實施，給出了詳細(xì)的實施方式和具體的操作過程，本發(fā)明的保護(hù)范圍包括但不限于下述的實施例。
[0026]以下實施例涉及的土芽孢乳桿菌(HKM-1)的分離、篩選和鑒定方法如下:
[0027]一、菌株的分離、篩選
[0028]該實施例中所用的培養(yǎng)基的組成如下:
[0029]營養(yǎng)液體培養(yǎng)基:葡萄糖80g/L，酵母粉8g/L，蛋白胨3g/L，碳酸鈣35g/L，pH為6。
[0030]營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基:葡萄糖40g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨5%，碳酸鈣2g/L，瓊脂粉20g/L, pH 為 6。115°C滅菌 15min。
[0031]菌株篩選培養(yǎng)基:葡萄糖120g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨5g/L，碳酸鈣50g/L，pH為
6。115。。滅菌 15min。
[0032]該實施例的具體操作過程如下:[0033]采集自云南的土壤，稱取2g溶于40mL營養(yǎng)液體培養(yǎng)基中，42°C富集培養(yǎng)24h。然后用無菌的生理鹽水稀釋培養(yǎng)液，分別稀釋10倍、100倍、1000倍、10000倍后涂布到含營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，42°c培養(yǎng)48h。待長出單菌落后，挑選菌落面積和產(chǎn)酸透明圈面積大的菌落，接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，42°C靜止培養(yǎng)48h，測定D-乳酸的產(chǎn)量，經(jīng)過多次篩選，挑取一株D-乳酸產(chǎn)量較高的菌株。
[0034]將上述菌株多次在營養(yǎng)瓊脂平板上劃線分離純化，然后再進(jìn)行10個循環(huán)的發(fā)酵測試，10次循環(huán)發(fā)酵產(chǎn)生的D-乳酸產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率基本保持原有水平，證明上述菌株即是目標(biāo)菌株，名稱為HKM-1。
[0035]二、菌株的鑒定
[0036]1.菌株HKM-1的生理生化鑒定:
[0037]生理生化鑒定在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)完成，具體生理生化鑒定如表
1、表2所示。
[0038]2.菌株HKM-116S rRNA系統(tǒng)進(jìn)化樹分析
[0039]對菌株HKM-1進(jìn)行培養(yǎng)，當(dāng)0D_為2~5時，抽提菌株HKM-1的全基因組，然后擴(kuò)增菌株HKM-1的16S rRNA的DNA序列。選取的參照菌是與本發(fā)明提供的菌株親緣關(guān)系較近的菌株，共10株，菌株HKM-1的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析圖見圖1。
[0040]表1 土芽孢乳桿菌 HKM-1 (革蘭氏陽性菌)生理生化特性-利用碳源產(chǎn)酸
[0041]
【權(quán)利要求】
1.一種芽孢乳桿菌，其特征在于，所述芽孢乳桿菌為土芽孢乳桿菌(Sporolactobacillus terrae)HKM_l,保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心,保藏編號為CCTCCN0:M2013389o
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的土芽孢乳桿菌HKM-1在發(fā)酵制備D-乳酸中的應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，以六碳糖作為碳源，以酵母粉、玉米漿干粉、蛋白胨和花生柏中的一種或多種作為氮源，進(jìn)行發(fā)酵后得到D-乳酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述六碳糖為葡萄糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖中的一種或多種。
5.一種制備D-乳酸的方法，包括如下步驟: 1)斜面培養(yǎng) 將土芽孢乳桿菌(HKM-1)菌種接種于含有20g/L瓊脂的固體斜面培養(yǎng)基上，40~45°C條件下，培養(yǎng)24~48h; 2)種子培養(yǎng) 將經(jīng)過斜面培養(yǎng)的芽孢乳桿菌在無菌條件下接種到種子培養(yǎng)基中，35~45°C條件下，靜止培養(yǎng)24~36h，加入中和劑控制發(fā)酵液pH，制得種子培養(yǎng)液； 3)發(fā)酵培養(yǎng) 按5~20%體積比的接種量接入到發(fā)酵培養(yǎng)基中，在35°C~45°C環(huán)境下培養(yǎng)48~72h。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于:步驟2)所述的種子培養(yǎng)基每升中含有:葡萄糖100~120g,酵母粉8~12g,蛋白胨3~8g,碳酸|丐30~60g。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于:步驟3)中所述的發(fā)酵培養(yǎng)基的組分及其含量包括:碳源40~120g/L、氮源添加量5~20g/L。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于:步驟3)中所述的發(fā)酵培養(yǎng)基的組分及其含量包括:碳源40~120g/L、玉米漿干粉10~20g/L、酵母粉3~10g/L、蛋白胨3~IOg/L、花生柏5~20g/L。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于:步驟3)中所述的發(fā)酵工藝為補(bǔ)料流加工藝，該補(bǔ)料流加工藝是指:當(dāng)發(fā)酵液中總還原糖含量低于20~30g/L時補(bǔ)加碳源，使總還原糖含量維持在30~70g/L，或達(dá)到50~70g/L。
10.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述的中和劑包括NaOH、NH4OH和Ca(OH)2中的一種或幾種，培養(yǎng)體系pH控制在5.0~7.0。
【文檔編號】C12P7/56GK103756939SQ201410022868
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2014年1月17日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月17日
【發(fā)明者】許平, 黃開明, 唐鴻志, 陶飛 申請人:上海交通大學(xué)