一種酯水解酶、編碼基因、載體、工程菌及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種來自于巨大芽孢桿菌（Bacillus?megaterium）的酯水解酶及其編碼基因，含有該編碼基因的載體、工程菌及其應用。所述酯水解酶氨基酸序列如SEQ?ID?NO.2所示，編碼基因如SEQ?ID?NO.1所示。本發(fā)明重組的酯水解酶是可用于立體選擇性催化手性化合物的合成，具有較高的催化活力和立體選擇性。
【專利說明】一種酯水解酶、編碼基因、載體、工程菌及其應用
(-)【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種具有S-異構(gòu)體立體選擇性的酯水解酶及其編碼基因，含有該編碼基因的載體、工程菌及其應用。
(二)【背景技術(shù)】
[0002]酯水解酶包括有脂肪酶和酯酶，它是一類在手性合成中有著重要用途的生物催化劑。這些酶能識別很寬的底物，目前> 40%的生物不對物合成反應可有酯水解酶催化完成，這些反應具有條件溫和、反映的區(qū)域選擇性和立體選擇性高等特點。在酶動力學拆分外消旋酯、胺和轉(zhuǎn)化前手性醇等方面等到廣泛的應用。另外，它們還可用于選擇性酯化、轉(zhuǎn)酯化和聚合反應中。
[0003]由于對手性藥物和中間體需求的增長，利用生物法或酶法合成手性化合物日益得到人們的重視和工業(yè)化應用。生物法合成手性化合物的關(guān)鍵問題在于尋找具有高度立體選擇性催化功能的生物催化劑。由于酯水解酶具有廣泛的用途，篩選新的酯水解酶正成為酶工程的研究熱點。雖然酯水解酶在微生物界分布很廣，但它們的立體選擇性催化功能不一樣。在同一生物體內(nèi)往往存在多種酯水解酶，由于它們之間立體選擇性存在差異性，利用為生物細胞或它們的粗酶制品進行酶法合成手性化合物時往往會降低產(chǎn)物的光學純度(Geun-Joong Kim, Journal of Molecular Catalysis B:Enzymaticl7, 2002:29-38)。解決這一問題可以通過工程的調(diào)控手段來減少副反應的發(fā)生，也可以通過分離純化得到單一的酶制劑來進行催化反應，但這些過程往往較復雜和高的成本，再生產(chǎn)中不易被采用。如果通過基因工程的手段，直接克隆和表達所需要的酶的基因，就能夠很方便達到以上的目的。 (三)
【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明目的是提供一種篩選獲得的具有S-異構(gòu)體立體選擇性的酯水解酶，含有該編碼基因的載體、工程菌及其應用。
[0005]本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:
[0006]一種具有S-異構(gòu)體立體選擇性的酯水解酶，其氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0007]本發(fā)明人通過篩選大量的微生物，發(fā)現(xiàn)巨大芽孢桿菌能產(chǎn)生一種有高度立體選擇性的酯水解酶，本發(fā)明酯水解酶來自巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium) WZ009,該菌株保藏編號為CCTCC NO:M2010171，已在CN102168036A中披露。發(fā)明人通過PCR擴增得到巨大芽孢桿菌的一種具有S-異構(gòu)體立體選擇性的酯水解酶基因BMEST，測定了其核苷酸序列，如序列表中SEQ ID N0.1所示，其中編碼序列(⑶S)從DNA第I個堿基起至第1401終止，ATG為轉(zhuǎn)錄起始密碼子，TAA為轉(zhuǎn)錄終止密碼；并得到相應的氨基酸序列，如列表中SEQID N0.2 所示。
[0008]由于氨基酸序列的特殊性，任何含有SEQ ID N0.2所示氨基酸序列的肽蛋白的片段或其變體，如其保守性變體、生物活性片段或衍生物，只要該肽蛋白的片段或肽蛋白變體與前述氨基酸序列同源性在90%以上，均屬于本發(fā)明保護范圍之列。具體的所述改變可包括氨基酸序列中氨基酸的缺失、插入或替換；其中，對于變體的保守性改變，所替換的氨基酸具有與原氨基酸相似的結(jié)構(gòu)或化學性質(zhì)，如用亮氨酸替換異亮氨酸，變體也可具有非保守性改變，如用色氨酸替換甘氨酸。
[0009]本發(fā)明還涉及所述酯水解酶的編碼基因。具體的，所述基因核苷酸序列如SEQ IDN0.1所示。
[0010]由于核苷酸序列的特殊性，任何SEQ ID N0.1所示多核苷酸的變體，只要其與該多核苷酸具有90%以上同源性，均屬于本發(fā)明保護范圍之列。所述多核苷酸的變體是指一種具有一個或多個核苷酸改變的多核苷酸序列。此多核苷酸的變體可以使生的變位變異體或非生的變異體，包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領(lǐng)域所知的，等位變異體是一個多核苷酸的替換形式，它可能是一個多核苷酸的取代、缺失或插入，但不會從實質(zhì)上改變其編碼的肽蛋白的功能。
[0011]本發(fā)明還涉及含有所述編碼基因的重組載體，以及利用所述重組載體轉(zhuǎn)化得到的
重組基因工程菌。
[0012]所述重組載體是用常規(guī)方法將本發(fā)明的酯水解酶基因的核苷酸序列連接于各種載體上構(gòu)建而成，該載體可以是市售的質(zhì)粒、粘粒、噬菌體或病毒載體等，如pUC，pBluescript(Stratagene)，pLEX(Novagen, Inc., Madison, ffis.), PQE (Qiagen)，pREP,PSE420和pLEX(Invitrogen)，但不是僅限于這些載體。較佳的是將PCR擴增到的BMEST基因產(chǎn)物通過TA克隆和表達載體pEASY-El連接，形成BMEST基因的表達載體(質(zhì)粒)pEASY-E 1-BMEST。表達載體pEASY-E 1-BMEST轉(zhuǎn)化Transl-Tl感受態(tài)細胞，擴增質(zhì)粒。
[0013]所述工程菌是將包含本發(fā)明酯水解酶基因核苷酸序列的表達載體轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌E.coli BL21 (DE3)中得到的基因工程菌株，如將質(zhì)粒pEASY-E 1-BMEST轉(zhuǎn)化其中得到含有 pEASY-E 1-BMEST 的`大腸桿菌 E.coli BL21 (DE3)/pEASY-E 1-BMEST。
[0014]本發(fā)明還涉及所述基因在制備重組酯水解酶中的應用。具體的應用包括用上述本發(fā)明表達載體轉(zhuǎn)化宿主細胞，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體，獲得重組的酯水解酶。其中，該宿主細胞可以為原核、真核微生物或昆蟲等。較佳的是大腸桿菌，得到相應的轉(zhuǎn)化體為上述的基因工程菌株:大腸桿菌E.coli BL21 (DE3)/pEASY-E1-BMEST。此菌株可在常規(guī)的IPTG誘導下(在0D600=0.5~0.6左右時加入，至其濃度為0.1~lmmol/L均可)高效表達酯水解酶蛋白，即為本發(fā)明的重組酯水解酶。
[0015]本發(fā)明還涉及所述的酯水解酶在立體選擇性催化拆分外消旋底物制備手性化合物中的應用。所述外消旋底物為下列之一:4_氯-3-羥基丁酸酯、3-羥基丁酸酯、四氫糠酸酯。本發(fā)明的酯水解酶可以用于制備光學純的手性化合物。
[0016]本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在:本發(fā)明的酯水解酶可以用于制備光學純的手性化合物，具有較高的催化活力和立體選擇性。
(四)【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]圖1為本發(fā)明BMEST的PCR擴增電泳圖譜，其中，1、DNA Marker(λ -Hind III digest, TakaRa 公司)；2、BMEST 的 PCR 擴增產(chǎn)物。
[0018]圖2為本發(fā)明質(zhì)粒pEASY-E 1-BMEST PCR驗證電泳圖譜，其中，1、DNA Marker(λ -Hind III digest, TakaRa 公司)；2、重組質(zhì)粒 pEASY-E1-BMEST PCR 產(chǎn)物；[0019]圖3為本發(fā)明基因工程菌株E.coli BL21(DE3)/pEASY-El-BMEST表達產(chǎn)物的PAGE電泳圖，其中，1、基因工程菌株E.coli BL21(DE3)/pEASY-El-BMEST誘導前產(chǎn)物；2、基因工程菌株E.coli BL21(DE3)/pEASY-E1-BMEST經(jīng)IPTG誘導后產(chǎn)物；3、低分子量標準蛋白質(zhì)(TakaRa 公司)。
[0020]圖4為表達質(zhì)粒pEASY-E 1-BMEST構(gòu)建示意圖。
(五)【具體實施方式】
[0021]下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進行進一步描述，但本發(fā)明的保護范圍并不僅限于此:
[0022]實施例中的材料與方法為:
[0023]所采用的分子克隆技術(shù)參見J.薩姆布魯克等編的《分子克隆實驗指南》。
[0024]TransStartTM Taq DNA Polymerase購于TransGen Biotech 公司。DNA marker、基因組提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、DNA回收純化試劑盒、瓊脂糖電泳試劑均購自TaKaRa，大連寶生物公司，使用方法參考商品說明書。
[0025]Transl-Tl感受態(tài)細胞，北京全式金生物技術(shù)有限公司。
[0026]大腸埃希氏菌BL21 (DE3), TakaRa,大連寶生物公司。
[0027]N1-NTA Sefinose Kit, Bio Basic INC 公司。
[0028]實施例1:從巨大芽孢桿菌克隆BMEST基因
[0029]根據(jù)Bacillus megaterium DSM319 脂肪酶的 DNA 序列(GenBank:CP001982.1)設(shè)計簡并引物I和引物2。
[0030]引物I 序列:ATGAATATCACAACGTTTGACG
[0031]引物2 序列:TTATTTTTCTGTTGATATGCTTTTC
[0032]以巨大芽抱桿菌(Bacillus megaterium) DSM319基因組DNA為模板進行PCR擴增(利用TakaRa試劑盒)，PCR反應體系和反應條件如表1和表2所示。步驟2到4重復25次。
[0033]表1:PCR擴增反應體系
【權(quán)利要求】
1.一種具有s-異構(gòu)體立體選擇性的酯水解酶，其氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
2.編碼權(quán)利要求1所述酯水解酶的基因。
3.如權(quán)利要求2所述的基因，其特征在于所述基因核苷酸序列如SEQID N0.1所示。
4.含有權(quán)利要求2或3所述基因的重組載體。
5.一種用權(quán)利要求4所述重組載體轉(zhuǎn)化得到的重組基因工程菌。
6.權(quán)利要求2或3所述基因在制備重組酯水解酶中的應用。
7.權(quán)利要求1所述的酯水解酶在立體選擇性催化拆分外消旋底物制備手性化合物中的應用。
8.如權(quán)利要求7所述的應用，其特征在于所述外消旋底物為下列之一:4_氯-3-羥基丁酸酯、3-羥基丁酸酯、四氫糠酸酯。
【文檔編號】C12P41/00GK103820417SQ201410022851
【公開日】2014年5月28日 申請日期:2014年1月17日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月17日
【發(fā)明者】鄭建永, 汪釗, 應向賢, 章銀軍 申請人:浙江工業(yè)大學