專利名稱：枯草酶變種及組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新的突變蛋白酶類或酶突變體，其用于配制去污劑組合物，并使去污劑的洗滌效果得以改良；涉及含有所說酶的洗滌和去污組合物；涉及當(dāng)插入到適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞或生物體時用于編碼所說酶的表達(dá)的突變基因；以及涉及以此轉(zhuǎn)化了的并能表達(dá)所說的酶變種的這類宿主細(xì)胞。發(fā)明背景在去污劑工業(yè)中，酶作為洗滌劑成分已被用了30多年了。在這些洗滌劑中所用的酶包括蛋白酶、脂酶、淀粉酶、纖維素酶以及其它酶，或者它們的混合物，市場上最重要的酶是蛋白酶。
商業(yè)上用得越來越多的蛋白酶是天然存在的野生型蛋白酶的蛋白質(zhì)工程的變體，例如DURAZYM_(Novo Nordisk A/S),RELASE_(Novo Nordisk A/S),MAXAPEM_(Gist-Brocades N.V.),PURAFECTt_(Genecor Intemational,Inc.)。
另外文獻(xiàn)中還描述了一系列的蛋白酶，例如EP 130756(GENENTECH)(相應(yīng)于US再頒布專利號34,606(GENENCOR))；EP 214435(HENKEL)；WO87/04461(AMGEN)；WO 87/05050(GENEX)；EP 260105(GENENCOR)；Thomas,Russell，和Fersht(1985)自然318 375-376；Thomas,Russell，和Fersht(1987)分子生物學(xué)雜志193 803-813；Russel and Fersht自然328 496-500(1987)；WO 88/08028(Genex)；WO 88/08033(Amgen)；WO 95/27049(SOLVAY S.A.)；WO 95/30011(PROCTER&GAMBLE公司)；WO 95/30010(PROCTER & GAMBLE公司)；WO 95/29979(PROCTER & GAMBLE公司)；US 5.543.302(SOLVAY S.A.)；EP 251 446(GENENCOR)；WO 89/06279(NOVO NORDISK A/S)；WO 91/00345(NOVO NORDISK A/S)；EP 525 610A1(SOLVAY)；和WO 94/02618(GIST-BROCADES N.V.).
然而，雖然已描述了一些有用的蛋白酶變體，還需要新的改良的蛋白酶變體用于一些工業(yè)用途。
因此，本發(fā)明的目的之一是提供改良了的蛋白質(zhì)工程的蛋白酶變體，尤其是將其用于洗滌劑工業(yè)。發(fā)明簡述最近發(fā)現(xiàn)有一種方法可以得到洗滌效果得以增強(qiáng)的枯草酶(Subtilase)變體，該方法是在親本枯草酶的憎水結(jié)構(gòu)域處或在該結(jié)構(gòu)域附近的一個或多個氨基酸殘基用一個或多個比原來氨基酸更加憎水的氨基酸取代，所說的憎水結(jié)構(gòu)域包含對應(yīng)于BLS 309的1165、Y167、Y171的殘基，而且在其附近的所說殘基包括對應(yīng)于BLS 309的殘基E136、G159、S164、R170、A194和G195(WO 96/34946)。
根據(jù)這些信息，本發(fā)明人深入地研究了SAVINASE_的Y167和R170的各種可能的組合，并且發(fā)現(xiàn)了其洗滌效果有出人意料的提高的一些變體。
進(jìn)一步的細(xì)節(jié)請參閱下文的工作實(shí)施例。
因此，本發(fā)明首先涉及在洗滌劑中增強(qiáng)洗滌效果的枯草酶蛋白酶變體，包括167和170位置的修飾。
其次，本發(fā)明涉及在洗滌劑中能增強(qiáng)洗滌效果的枯草酶蛋白酶變體，包括至少一個選自下列的修飾167{G,A,S，或T}+170{G,A,S，或T}167{G,A,S，或T}+170{L,I，或V}167{G,A,S，或T}+170{Q，或N}167P167P+170{L,I，或V}167{L,I，或V}+170{G,A,S，或T}167{L,I，或V}+170{Q，或N}167P+170{G,A,S，或T}167{L,I或V}+170{L,I，或V}167{F,W或Y}+170{G,A,S，或T}167{F,W或Y}+170{E，或D}167{F,W或Y}+170{R,K，或H}167{F,W或Y}+170{L,I，或V}167{L,I，或V}170H167{G,A,S，或T}。
上述的命名例如“167{G,A,S，或T}+170{G,A,S，或T}”變體是基本命名，其中術(shù)語“167{G,A,S，或T}+170{G,A,S，或T}”包括下列變體167G+170G,167G+170A,167G+170S,167G+170T,167A+170G,167A+170A,167A+170S,167A+170T,167S+170G,167S+170A,167S+170S,167S+170T,167T+170G,167T+170A,167T+170S，或167T+170T。
關(guān)于此處的枯草酶變體命名的進(jìn)一步的細(xì)節(jié)請參考下文的“定義”一節(jié)。
本發(fā)明的第三方面涉及編碼本發(fā)明的枯草酶變體的分離的DNA序列。
本發(fā)明的第四方面涉及含有編碼本發(fā)明的枯草酶變體的分離的DNA序列的表達(dá)載體。
本發(fā)明的第五方面涉及用根據(jù)第四方面的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的微生物宿主細(xì)胞。
本發(fā)明的另一方面還涉及本發(fā)明的枯草蛋白酶的生產(chǎn)，其方法是將根據(jù)第四方面的表達(dá)載體插入到適當(dāng)?shù)奈⑸锼拗髦校囵B(yǎng)宿主以表達(dá)所需的枯草酶，并回收酶產(chǎn)物。
本發(fā)明還在一個方面涉及含有本發(fā)明的枯草酶變體的組合物。
最后本發(fā)明涉及該突變酶用于一些工業(yè)相關(guān)的應(yīng)用，尤其是用于洗滌組合物和含有該突變酶的洗滌組合物中，特別是含有突變枯草蛋白酶的洗滌劑組合物中。定義在進(jìn)一步對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)討論之前，將對下述各詞首先進(jìn)行定義。
氨基酸命名A=Ala=丙氨酸V=Val=纈氨酸L=Leu=亮氨酸I=Ile=異亮氨酸P=Pro=脯氨酸F=Phe=苯丙氨酸W=Trp=色氨酸M=Met=甲硫氨酸
G=Gly=甘氨酸S=Ser=絲氨酸T=Thr=蘇氨酸C=Cys=半胱氨酸Y=Tyr=酪氨酸N=Asn=天冬酰胺Q=Gln=谷氨酰胺D=Asp=天冬氨酸E=Glu=谷氨酸K=Lys=賴氨酸R=Arg=精氨酸H=His=組氨酸X=Xaa=任何氨基酸核酸命名A=腺嘌呤G=鳥嘌呤C=胞嘧啶T=胸腺嘧啶(僅存在于DNA中)U=尿嘧啶(僅存在于RNA中)變體命名在對本發(fā)明中產(chǎn)生出或設(shè)計(jì)出的各種酶變體進(jìn)行描述時，為便于參考采用了下述命名原來的氨基酸位置取代的氨基酸據(jù)此，在195位的谷氨酸對甘氨酸的取代被命名為Gly195Glu或G 195E在相同位置的甘氨酸的缺失為Gly195*或G 195*而插入一個另外的氨基酸殘基如賴氨酸為Gly195GlyLys或G195GK當(dāng)指出與原來用于編號的序列相比的缺失時，在這樣一個位置上的插入被命名為
*36Asp或*36D用于說明在36位上插入了一個天冬氨酸。
被加號分開的多個突變，例如Arg 170 Tyr+Gly 195 Glu或R107Y+G195E分別代表在170和195位上用酪氨酸和谷氨酸取代了精氨酸和甘氨酸。
當(dāng)原來的氨基酸可能包含任何氨基酸時，那么僅提其位置和取代氨基酸，例如170 Ser。
該命名尤其適合涉及根據(jù)本發(fā)明的同源枯草酶(參見下文)的修飾。因此170 Ser例如包括BASBPN中的一個Lys 170 Ser修飾和BLSSAVI中的一個Arg 170 Ser修飾。參見與所說實(shí)施例相關(guān)的

圖1。
當(dāng)取代的氨基酸可包含任何氨基酸時，僅提其原來的氨基酸和位置，例如Arg 170。
當(dāng)原來的氨基酸和取代的氨基酸都可以是任何氨基酸時，那么僅指出其位置，例如170。
當(dāng)原來的氨基酸和/或取代的氨基酸可包括超過一種但并非全部氨基酸時，那么所選擇的氨基酸用“{}”包圍，例如Arg 170{Gly,Ala,Ser，或Thr}包括變體Arg 170 Gly,Arg 170 Ala,Arg 170 Ser或Arg 170 Thr；或例如Tyr 167{Gly,Ala,Ser，或Thr}+Arg 170{Gly,Ala,Ser，或Thr}包括變體Tyr167Gly+Arg170Gly, Tyr167Gly+Arg170Ala,Tyr167Gly+Arg170Ser, Tyr167Gly+Arg170Thr,Tyr167Ala+Arg170Gly, Tyr167Ala+Arg170Ala,Tyr167Ala+Arg170Ser, Tyr167Ala+Arg170Thr,Tyr167Ser+Arg170Gly, Tyr167Ser+Arg170Ala,Tyr167Ser+Arg170Ser, Tyr167Ser+Arg170Thr,Tyr167Thr+Arg170Gly, Tyr167Thr+Arg170Ala,Tyr167Thr+Arg170Ser,或Tyr167Thr+Arg170Thr.
該命名尤其適合涉及本發(fā)明一個優(yōu)選枯草酶變體的保守氨基酸修飾。
例如一個優(yōu)選變體Tyr 167 Ala+Arg 170 Ser的保守氨基酸修改例如是Tyr 167{Gly,Ala,Ser，或Thr}+Arg 170{Gly,Ala,Ser，或Thr}，其中此處用一個小的氨基酸取代了另一個小氨基酸。進(jìn)一步的細(xì)節(jié)請參見“發(fā)明詳述”一節(jié)。蛋白酶在蛋白質(zhì)底物中切開酰胺鍵的酶被分類為蛋白酶，或(可互換地)肽酶(見Walsh,1979，酶反應(yīng)機(jī)理W.H.Freeman和Company,San Francisco，第3章)。氨基酸位置/殘基的編號如果不另外指出，則此處所用的氨基酸編號對應(yīng)于枯草酶BPN′(BASBPN)的序列。對BPN′序列的進(jìn)一步描述參見Siezen等，Protein Engng.4(1991)719-737及圖1。絲氨酸蛋白酶絲氨酸蛋白酶是催化肽鍵水解的酶，而且活性位置上有一個必需的絲氨酸殘基(White,Handler和Smith,1973“Principles of Biochemistry，”第5版，McGraw-Hill Book Company,NY，第271-272頁)。
細(xì)菌性絲氨酸蛋白酶的分子量在20000到45000道爾頓的范圍內(nèi)。它們被二異丙基氟磷酸所抑制。其水解簡單的末端酯，其活性與真核胰凝乳蛋白酶類似，后者亦為一種絲氨酸蛋白酶。一個更狹義的名詞，堿性蛋白酶，包括了一個亞群，其反映了某些絲氨酸蛋白酶的高的最適pH，范圍從pH9.0至11.0(綜述，參見Priest(1997))Bacteriological Rev.41 711-753)。枯草酶Siezen等提出了臨時被命名為枯草酶(subtilase)的一個亞群的絲氨酸蛋白酶(Protein Engng.4(1991)719-737)。它們是通過絲氨酸蛋白酶的超過40個氨基酸序列的同源性分析確定的，而后者以前已被認(rèn)為是類枯草蛋白酶的蛋白酶?？莶莸鞍酌赶惹氨徽J(rèn)為是格蘭氏陽性菌和真菌產(chǎn)生的一種絲氨酸蛋白酶，根據(jù)Siezen等人現(xiàn)在它被認(rèn)為是枯草酶的一個亞群。我們已發(fā)現(xiàn)了許多的枯草酶，而且也確定了許多枯草酶的氨基酸序列。關(guān)于這種枯草酶及其氨基酸序列的更詳細(xì)的描述請參考Siezen等及本文中的圖1。
枯草酶的一個亞群，即I-S1，其包括“傳統(tǒng)的”枯草蛋白酶，例如枯草蛋白酶168，枯草蛋白酶BPN′，枯草蛋白酶Carlsberg(ALCALASE_,NOVONORDISK A/S)，和枯草蛋白酶DY。
另一個亞群枯草酶I-S2是由Siezen等發(fā)現(xiàn)的(同上)。I-S2亞群蛋白酶被描述成是高度堿性的枯草蛋白酶，其所包括的酶例如有枯草蛋白酶PB92(MAXACAL_,Gist-Brocades NY)，枯草蛋白酶309(SAVINASE_,NOVO NORDISK A/S)，枯草蛋白酶147(ESPERASE_,NOVO NORDISKA/S)，以及堿性彈性蛋白酶YaB?！癝AVINASE_”SAVINASE_由NOVO NORDISK A/S出售。
其是來自于緩慢芽孢桿菌(B.lentus)的枯草蛋白酶309，其與BABP92(參見本文圖1)不同僅在于帶有N87S。親本枯草酶名詞“親本枯草酶”是根據(jù)Siezen等(Protein Engineering 4:719-737(1991))所定義的一種枯草酶。進(jìn)一步細(xì)節(jié)請參見前面的“枯草酶”的描述。親本枯草酶還可能是從天然來源分離到的枯草酶，其中隨后對其進(jìn)行修飾但保持枯草酶的特征?？蛇x擇地，術(shù)語“親本枯草酶”可被稱為“野生型枯草酶”。枯草酶變體的修飾此處所討論的與枯草酶變體相關(guān)的術(shù)語“修飾”被定義為既包括化學(xué)修飾，也包括遺傳操作。該修飾可以是對目的氨基酸的取代，缺失和/或插入。枯草酶變體在本發(fā)明的范圍內(nèi)，術(shù)語枯草酶變體或突變的枯草酶指的是由表達(dá)從具有原始的或親本基因并產(chǎn)生相應(yīng)親本酶的親本微生物衍生的突變基因的有機(jī)體產(chǎn)生的枯草酶，為產(chǎn)生突變基因已將親本基因突變，當(dāng)突變基因在適當(dāng)?shù)乃拗髦斜磉_(dá)時可產(chǎn)生所說的突變的枯草酶蛋白酶。同源枯草酶序列為了獲得本發(fā)明的枯草酶變體對SAVINASE_枯草酶的特定氨基酸殘基進(jìn)行了鑒定以進(jìn)行本文所述的修飾。
然而，本發(fā)明并不限于這個特定的枯草酶的修飾，而可以擴(kuò)展到其它親本(野生型)枯草酶上，其與SAVINASE_有著同源的一級結(jié)構(gòu)。
為了識別其它同源枯草酶，在本發(fā)明的范圍內(nèi)，將所說的枯草酶與先前已進(jìn)行過序列對比的枯草酶進(jìn)行序列對比，同時保持原來的排列不變。對枯草酶中18個高度保守的殘基進(jìn)行了對比。這18個高度保守的殘基見表Ⅰ(參見Siezen等以了解關(guān)于所說保守殘基的進(jìn)一步細(xì)節(jié))。
表Ⅰ枯草酶中18個高度保守的殘基位置保守殘基23G32D34G39H64H65G66T70G83G125 S127 G146 G154 G155 N219 G220 T221 S225 P在進(jìn)行了允許有必要的插入和缺失以維持排列的序列對比后，發(fā)現(xiàn)了適當(dāng)?shù)耐礆埢?。然后，所說的同源殘基即可根據(jù)本發(fā)明進(jìn)行修飾。
用CLUSTALW(版本1.5,1995年4月)計(jì)算機(jī)序列對比程序(Thompson,J.D.,Higgins,D.G.和G.Bson,T.J.(1994)Nucleic Acids Research,22:4673-4680.)，采用10.0的GAP開放補(bǔ)償和0.1的GAP延伸補(bǔ)償，用BLOSUM 30蛋白質(zhì)重量矩陣，就可以使用程序中的特征序列對比選項(xiàng)得到某一給定枯草酶與一組先前已進(jìn)行過序列對比的枯草酶之間的序列對比。對一個在本發(fā)明范圍之內(nèi)的給定的枯草酶，優(yōu)選該18個高度保守殘基100％地保守。但是，只要18個殘基中有大于或等于17個能夠匹配，或者所說的保守殘基匹配少至16個時，仍足以識別同源殘基。在枯草酶中催化三聯(lián)體Asp32/His 64/Ser 221的保守性應(yīng)得以維持。
先前所確定的序列匹配如圖1所示，其中也表明了在此序列匹配中各枯草酶與該18個高度保守殘基一致性的百分率。
所說方法還進(jìn)一步涉及本發(fā)明范圍內(nèi)的同源親本(野生型)枯草酶的鑒定，上述的該18個保守殘基與所說同源親本枯草酶的親本(野生型)一級結(jié)構(gòu)相關(guān)。也就是說，如果親本枯草酶在上述18個保守殘基中的任何一個上發(fā)生了修飾，那么就是在所說18個保守殘基中的原始親本野生型序列來確定原來的親本枯草酶及所說的親本枯草酶的可能變體(其在上述所說的18個保守殘基中的任何一個上有修飾)是否為在本發(fā)明的范圍內(nèi)同源的枯草酶。
根據(jù)本描述，一個本領(lǐng)域的技術(shù)人員來鑒別適當(dāng)?shù)耐纯莶菝负拖鄳?yīng)的同源殘基(根據(jù)本發(fā)明，其可被修飾)是相當(dāng)簡單的。為了說明，下面的這個表Ⅱ列出了同源枯草酶和根據(jù)本發(fā)明要被修飾的相應(yīng)的適當(dāng)殘基的一個有限的一覽表。
表Ⅱ同源枯草酶和根據(jù)本發(fā)明適于被修飾的相應(yīng)的同源殘基

很明顯一個本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以很容易地制出一個類似或更大的表來涵蓋其它的同源枯草酶。洗滌效果酶在催化在例如洗滌的過程中要被清洗去的某一物體上的各種天然存在的底物的降解的能力常被稱為是其洗滌能力、洗滌力、凈化力或洗滌效果。在整個本應(yīng)用中，術(shù)語洗滌效果用于包括該特征。分離的DNA序列當(dāng)用于一個DNA序列分子時，術(shù)語“分離的”指的是被從其天然遺傳環(huán)境中取出來因而不含其它額外或不需要的編碼序列的DNA序列，從而其存在的形式適于用在遺傳工程蛋白質(zhì)生產(chǎn)系統(tǒng)中。這類分離的分子是那些從其天然環(huán)境中取出并包括cDNA和基因組克隆的分子。本發(fā)明的分離的DNA分子已與那些其一般相聯(lián)系的其它基因分離開來，但可能包括天然存在的5′和3′非翻譯區(qū)例如啟動子和終止子。對相關(guān)聯(lián)區(qū)域的識別對一個本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員而言也是很明顯的(見例如，Dynan和Tijan,Nature316:774-78,1985)。術(shù)語“分離的DNA序列”可互換地被稱之為“克隆的DNA序列”。分離的蛋白質(zhì)當(dāng)用于蛋白質(zhì)時，術(shù)語“分離的”指的是在非其天然環(huán)境中發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)。在一個優(yōu)選的形式下，分離的蛋白質(zhì)基本不含其它蛋白質(zhì)，尤其是那些同源蛋白質(zhì)(即“同源雜質(zhì)”(見下面))。優(yōu)選提供高純度形式的蛋白質(zhì)，即大于40％純度，大于60％純度，高于80％純，更優(yōu)選大于95％純度，進(jìn)一步優(yōu)選大于99％純度，其純度以SDS-PAGE確定。
術(shù)語“分離的蛋白質(zhì)”可互換地被稱之為“純化蛋白質(zhì)”。同源雜質(zhì)術(shù)語“同源雜質(zhì)”指的是從同源細(xì)胞而來的任何雜質(zhì)(例如本發(fā)明的多肽之外的其它多肽)，而本發(fā)明的多肽最初就是來源于該同源細(xì)胞。來自于此處所用的與特定的微生物源相聯(lián)系的術(shù)語“來自于”指的是由特定的來源或由其中插入有由此來源獲得的基因的細(xì)胞產(chǎn)生的多核苷酸和/或多肽。底物此處所用的與蛋白酶底物相關(guān)的術(shù)語“底物”應(yīng)以其最廣義的含義被解釋為包括含有至少一個易被枯草蛋白酶水解的肽鍵的化合物。產(chǎn)物所用的與來源于蛋白酶酶催反應(yīng)的產(chǎn)物相關(guān)的術(shù)語“產(chǎn)物”在本發(fā)明的上下文中應(yīng)被理解為包括涉及枯草酶蛋白酶的水解反應(yīng)的產(chǎn)物。一個產(chǎn)物可能為隨后的水解反應(yīng)的底物。附圖簡述圖1列出了一些同源枯草酶的匹配，其匹配于枯草酶的18個高度保守殘基。該18個高度保守的殘基以黑體著重指出。所有列出的枯草酶，除了JP 170，都100％地具有所說的保守殘基。JP 170在保守的殘基G 146處具有一個“N”而非“G”。發(fā)明詳述具有改良的洗滌效果的枯草酶變體本發(fā)明的許多枯草酶變體在此處都被測試并在洗滌劑中表現(xiàn)出了改良的洗滌效果(見下文的操作實(shí)施例)。
因此，本發(fā)明的一個實(shí)施方案涉及一個根據(jù)本發(fā)明第二方面的枯草酶變體，其中修飾選自(按BASBPN編號)167A+170S,167A+170L,167A+170N167P167P+170L167V+170T167I+170T167V+170Q167S+170Q167T+170N167A+170A167T+170L167T+170A167P+170S167I+170L167F+170T167F+170E167F+170H167F+170T167F+170L167L170H167S.
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了BLS 309變體(SAVINASE_)具有改良的洗滌效果，在其親本野生型一級序列中含有如原來野生型氨基酸的Y167和R170(見圖1)。
因此，本發(fā)明的另一個實(shí)施方案涉及根據(jù)本發(fā)明第二方面的枯草酶變體，其中的修飾選自(按BASBPN編號)Y167{G,A,S，或T}+R170{G,A,S，或丁}Y167{G,A,S，或T}+R170{L,I，或V}Y167{G,A,S，或T}+R170{Q，或N}Y167PY167P+R170{L,I，或V}Y167{L,I，或V}+R170{G,A,S，或T}Y167{L,I，或V}+R170{Q，或N}Y167P+R170{G,A,S，或T}Y167{L,I，或V}+R170{L,I，或V}Y167{F,W，或Y}+R170{G,A,S，或T}Y167{F,W，或Y}+R170{E，或D}Y167{F,W，或Y}+R170{R,K，或H}Y167{F,W，或Y}+R170{L,I，或V}Y167{L,I，或V}R170HY167{G,A,S，或T}；或更優(yōu)選的根據(jù)上面實(shí)施方案的枯草酶酶變體，其中的修飾選自(按BASBPN編號)Y167A+R170SY167A+R170LY167A+R170NY167PY167P+R170LY167V+R170TY167I+R170TY167V+R170QY167S+R170QY167T+R170NY167A+R170AY167TY167T+R170AY167P+R170SY167I+R170LY167F+R170TY167F+R170EY167F+R170HY167F+R170TY167F+R170LY167LR170HY167S.
在本領(lǐng)域中，眾所周知將一個氨基酸取代為另一個類似保守的氨基酸只會對酶的特征產(chǎn)生一個微小的變化。
下面的表Ⅲ列出了保守氨基酸組。
表Ⅲ保守氨基酸取代堿性的R=精氨酸K=賴氨酸H=組氨酸酸性的E=谷氨酸D=天冬氨酸極性的Q=谷氨酰胺N=天冬酰胺憎水的L=亮氨酸I=異亮氨酸V=纈氨酸M=甲硫氨酸芳香族的F=苯丙氨酸W=色氨酸Y=酪氨酸小的G=甘氨酸A=丙氨酸S=絲氨酸T=蘇氨酸因此，枯草酶變體例如167A+170S,167G+170S,167S+170S，以及167T+170S將具有相似的洗滌效果改良。
而且，枯草酶變體例如Y167G+R170S,Y167S+R170S，以及Y167T+R170S將具有與變體Y167A+R170S相似的洗滌效果改良。見例如本文操作實(shí)施例中對所說Y167A+R170S變體所作的特定的洗滌效果測試。
根據(jù)本文所公開尤其是所列舉的各種枯草酶變體，按照本發(fā)明的所有方面和枯草酶變體的具體實(shí)施方案，為了得到其改良的洗滌效果的枯草酶變體，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通過常規(guī)方法就可發(fā)現(xiàn)尤其是所說的列舉的變體的進(jìn)一步適宜的保守性修飾。
在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，目的枯草酶是屬于I-S1和I-S2亞群的那些。
關(guān)于I-S1亞群，優(yōu)選的親本枯草酶選自ABSS 168、BASBPN、BSSDY以及BLSCAR或其保留了I-S1亞群的特征的功能性變體。
關(guān)于I-S2亞群，優(yōu)選的親本枯草酶選自BLS 147、BLS 309、BAPB92、TVTHER和BYSYAB或保留了I-S2亞群的特征的它們的功能性變體。
尤其，所說的親本枯草酶是BLS 309(SAVINASE_NOVO NORDISKA/S)。
本發(fā)明也包括在親本酶的氨基酸序列上的上述位置上的一個或多個修飾并同時有任何的其它修飾。尤其是與那些本領(lǐng)域已知的并能給所設(shè)計(jì)的酶提供改良的特性的修飾相結(jié)合?，F(xiàn)有技術(shù)描述了一些具有不同改良特征的枯草酶變體及本文的“發(fā)明背景”一節(jié)中所提到的那些(上文)。這些參考文獻(xiàn)均作為鑒別枯草酶變體的參考，該變體可以與本發(fā)明的枯草酶變體進(jìn)行有益的組合。
這種組合包括位置222(改善氧化穩(wěn)定性)，218(改善熱穩(wěn)定性)，在Ca結(jié)合位點(diǎn)上穩(wěn)定酶的取代，例如第76位，以及在現(xiàn)有技術(shù)中很明顯的其它位置。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的一個枯草酶變體可與下列位置的一個或多個修飾有益地組合起來27,36,57,76,87,97,101,104,120,123,206,218,222,224,235和274。
特別地，下列的BLS 309和BAPB變體被認(rèn)為是適于組合的K27R,*36D, S57P,N76D, S87N,G97N,S101G,V104A,V104N,V104Y,H120D,N123S,Q206E,N218S,M222S,M222A,T224S,K235L andT274A.
而且包括下列變體中的任一個的變體S101G+V104N,S87N+S101G+V104N,K27R+V104Y+N123S+T274A，或者N76D+V104A或者是這些突變(V104N、S101G、K27R、V104Y、N123S、T274A、N76D、V104A)的其它組合與上面提到的一個或多個修飾的組合表現(xiàn)改善了特征。
本發(fā)明的主要方面的更進(jìn)一步的枯草酶變體優(yōu)選與下列位置上的修飾中的任一個進(jìn)行組合，這些位置為129、131、133和194，優(yōu)選為129K、131H、133P和194P修飾，最優(yōu)選為P129K、P131H、A133P、A133D和194P修飾。這些修飾中的任一個都可以產(chǎn)生本發(fā)明的枯草酶變體的更高水平的表達(dá)。進(jìn)一步的細(xì)節(jié)請參考本文(下文)的操作實(shí)施例。
因此，本發(fā)明的更進(jìn)一步的實(shí)施方案涉及一個根據(jù)本發(fā)明的變體，其中所說的修飾選自Y167A+R170S+A194PY167A+R170L+A194PY167A+R170N+A194PY167A+R170S+P129KY167A+R170L+P129KY167A+R170N+P129KY167A+R170S+P131HY167A+R170L+P131HY167A+R170N+P131HY167A+R170S+A133PY167A+R170L+A133PY167A+R170N+A133PY167A+R170S+A133DY167A+R170L+A133DY167A+R170N+A133D枯草酶基因突變的產(chǎn)生克隆本發(fā)明的枯草酶和在基因(例如枯草酶基因)中導(dǎo)入突變的許多方法是本領(lǐng)域熟知的。
為了得到本發(fā)明的枯草酶變體，一般可以使用用來克隆基因并在該基因中導(dǎo)入突變(隨機(jī)的和/或定點(diǎn)的)的標(biāo)準(zhǔn)方法。對適宜的技術(shù)的進(jìn)一步描述請參考本文(下文)的操作實(shí)施例和(Sambrook等(1989)分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，冷泉港，NY；Ausubel,F.M.等(編輯)“當(dāng)代分子生物學(xué)方法”。John Wiley & Sons,1995；Harwood,C.R.，和Cutting,S.M.(編者)“芽胞桿菌屬的分子生物學(xué)方法”。John Wiley & Sons,1990)；和WO 96/34946。表達(dá)載體包括編碼本發(fā)明的酶的DNA構(gòu)建體的重組表達(dá)載體可以是方便地進(jìn)行DNA重組步驟的任何載體，載體的選擇常取決于其所要導(dǎo)入的宿主細(xì)胞。因此，該載體可以是自主復(fù)制載體，即可作為染色體外實(shí)體存在的載體，其復(fù)制獨(dú)立于染色體復(fù)制，例如質(zhì)粒。或者，該載體可以是這樣一個當(dāng)其被導(dǎo)入宿主細(xì)胞中時，其可部分或全部地整合到宿主細(xì)胞基因組中并與其所整合的染色體一起復(fù)制。
該載體優(yōu)選為表達(dá)載體，其中編碼本發(fā)明的酶的DNA序列可操作地與該DNA的轉(zhuǎn)錄必需的其它節(jié)段進(jìn)行連接。一般地，該表達(dá)載體衍生自壓質(zhì)粒或病毒DNA，或同時含有二者的成分。術(shù)語“可作地連接”是指設(shè)計(jì)該節(jié)段從而其功能與其期望的目的一致，如起始于啟動子并在編碼該酶的DNA序列中進(jìn)行的轉(zhuǎn)錄。
該啟動子可以是任何DNA序列，其在所選擇的宿主細(xì)胞中表現(xiàn)出了轉(zhuǎn)錄活性，并且可衍生于編碼與宿主細(xì)胞同源或異源的蛋白質(zhì)的基因。
在細(xì)菌宿主細(xì)胞中所用的適當(dāng)?shù)膯幼拥膶?shí)例包括嗜熱脂肪芽孢桿菌麥芽糖淀粉酶基因、地衣芽孢桿菌α-淀粉酶基因，解淀粉芽孢桿菌α-淀粉酶基因、枯草芽孢桿菌堿性蛋白酶基因、或者短小芽孢桿菌木糖苷酶基因的啟動子或者是λ噬菌體的Pr或Pl啟動子或者大腸桿菌lac、trp或tac啟動子。
如果有必要，編碼本發(fā)明的酶的DNA序列也可以可操縱地與一個適宜的終止子相連接。
本發(fā)明的重組載體可進(jìn)一步含有可使得載體在所討論的宿主細(xì)胞中復(fù)制的DNA序列。
該載體還可含有可選擇的標(biāo)記，例如在宿主細(xì)胞中其產(chǎn)物為彌補(bǔ)缺陷的基因，或編碼對抗生素例如卡那霉素、氯霉素、紅霉素、四環(huán)素、大觀霉素等的抗性，或編碼對重金屬或殺蟲劑抗性的基因。
為指導(dǎo)本發(fā)明的酶進(jìn)入宿主細(xì)胞的分泌途徑，可在重組載體中提供分泌信號序列(也稱之為前導(dǎo)序列、前序列原或前序列)。該分泌信號序列在正確的讀碼框內(nèi)被結(jié)合到編碼該酶的DNA序列上。分泌信號序列一般位于編碼該酶的DNA序列的5′。該分泌信號序列可以是那些一般與酶相關(guān)的或可以是來源于編碼其它分泌蛋白的基因。
用于分別連接編碼本發(fā)明的酶的DNA序列、啟動子以及任選的終止子和/或分泌信號序列的方法，或通過適當(dāng)?shù)腜CR擴(kuò)增方法來裝配這些序列的方法，以及將其插入適當(dāng)?shù)暮袕?fù)制或整合所必需的信息的載體的方法，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言都是熟知的(參考，例如Sambrook等，在所引用的書中)宿主細(xì)胞引入宿主細(xì)胞的編碼本發(fā)明的酶的DNA序列與所討論的宿主既可以是同源的，也可以是異源的。如果與宿主細(xì)胞同源，即在天然狀態(tài)下由宿主細(xì)胞產(chǎn)生，其將典型地被可操縱地連接到與其天然環(huán)境中的不同的另一個啟動子序列上或者，如果可適用地，連到另外一個分泌信號序列和/或終止子序列上。術(shù)語“同源的”意指包括編碼所討論的問題中的宿主有機(jī)體的天然酶的DNA序列。術(shù)語“異源的”是指包括不是由宿主細(xì)胞在天然狀態(tài)下表達(dá)的DNA序列。因此，該DNA序列可來源于其它有機(jī)體，或者它也可能是合成序列。
本發(fā)明的DNA構(gòu)建體或重組載體所導(dǎo)入的細(xì)胞可以是任何能產(chǎn)生本發(fā)明的酶的細(xì)胞，并包括細(xì)菌、酵母、真菌和高等真核細(xì)胞。
在培養(yǎng)中能產(chǎn)生本發(fā)明的酶的細(xì)菌宿主細(xì)胞的實(shí)例是格蘭氏陽性細(xì)菌例如芽孢桿菌菌株，例如枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、短芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、嗜堿芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌(B.megatherium)或蘇云金芽孢桿菌菌株、或鏈霉菌屬，例如淺青紫鏈霉菌或鼠灰鏈霉菌菌株，或格蘭氏陰性菌例如大腸桿菌。細(xì)菌的轉(zhuǎn)化可通過原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化、電穿孔、共沉淀或通過目前已知的利用感受態(tài)細(xì)胞的方式來實(shí)現(xiàn)(參考，Sambrook等，同上)。
當(dāng)在細(xì)菌如大腸桿菌中表達(dá)該酶時，該酶可留在胞質(zhì)中，一般以不溶粒狀物的形式(稱之為“包涵體”)，或者也可通過細(xì)菌分泌序列定位到外周質(zhì)間隙去。在頭一種情況下，細(xì)胞被裂解并回收顆粒物并變性，然后通過稀釋變性劑而將酶進(jìn)行再折疊。在后一種情況下，例如通過超聲波或滲透休克來釋放外周質(zhì)間隙的內(nèi)容物并回收該酶。
當(dāng)在格蘭氏陽性菌例如芽孢桿菌或鏈霉菌菌株中表達(dá)該酶時，該酶可留在胞質(zhì)中，或可通過細(xì)菌性分泌序列定位到細(xì)胞外培養(yǎng)基中去。在后一種情況下，該酶可如下所述從培養(yǎng)基中回收。產(chǎn)生枯草酶的方法本發(fā)明提供一種產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明的分離的酶的方法，其中合適的宿主細(xì)胞(其已用編碼該酶的DNA序列轉(zhuǎn)化)在允許該酶產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)，所得的酶從培養(yǎng)物中回收。
當(dāng)將包含有編碼該酶的DNA序列的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化進(jìn)入異源宿主細(xì)胞中時，就有可能產(chǎn)生本發(fā)明的酶的異源重組體。
因此就有可能制備高度純化的枯草酶組合物，其特征在于其不含同源雜質(zhì)。
在本文范圍內(nèi)，同源雜質(zhì)意指來源于本發(fā)明的酶的原始來源的同源細(xì)胞的任何不純物(例如除了本發(fā)明的酶之外的其它多肽)。
用于培養(yǎng)該轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基可以是適于所討論的宿主細(xì)胞生長的任何傳統(tǒng)培養(yǎng)基。所表達(dá)的枯草酶可方便地分泌到培養(yǎng)基中并可用熟知的方法由此回收，這些方法包括從培養(yǎng)基中離心或過濾而分離細(xì)胞，用鹽例如硫酸銨沉淀蛋白質(zhì)成分，接著為層析法例如離子交換層析，親和層析等。本發(fā)明的枯草酶變體的用途本發(fā)明的枯草酶變體可用于一些工業(yè)應(yīng)用中，尤其是在洗滌劑工業(yè)中。
而且，本發(fā)明涉及酶組合物，其包括本發(fā)明的枯草酶變體。
優(yōu)選的工業(yè)應(yīng)用及相應(yīng)的優(yōu)選的酶組合物的總結(jié)如下所述。
此總結(jié)在任何情況下都不是本發(fā)明的合適的枯草酶變體的合適應(yīng)用的全部列舉。本發(fā)明的枯草酶變體可用于本領(lǐng)域熟知的包括應(yīng)用蛋白酶，尤其是枯草酶的其它工業(yè)應(yīng)用中。包括該突變酶的洗滌劑組合物本發(fā)明包括將本發(fā)明的突變酶用于清潔和洗劑組合物中以及包括突變枯草蛋白酶的組合物中的應(yīng)用。本領(lǐng)域中這類清潔和洗滌組合物已進(jìn)行了詳細(xì)描述，并參考WO 96/34946；WO 97/07202；WO 95/30011以便進(jìn)一步對合適的清潔和洗滌組合物進(jìn)行描述。
進(jìn)一步的參考可見本文的操作實(shí)施例，其中表明本發(fā)明的許多枯草酶變體的改善的洗滌效果。洗滌劑公開和實(shí)施例表面活性劑系統(tǒng)根據(jù)本發(fā)明的洗滌劑組合物包括一個表面活性劑系統(tǒng)，其中的表面活性劑可選自非離子和/或陰離子和/或陽離子和/或兩性和/或兼性離子和/或半極性型表面活性劑。
該表面活性劑典型的含量為從0.1％到60％重量。
該表面活性劑優(yōu)選配成與組合物中的酶組分相容的。液態(tài)或凝膠組合物中，該表面活性劑最優(yōu)選地以可以提高，或至少不降低這些組合物中任何酶的穩(wěn)定性的方式配制。
根據(jù)本發(fā)明所使用的優(yōu)選系統(tǒng)包括一至多個此處所述的非離子和/或陰離子表面活性劑。
烷基酚的聚環(huán)氧乙烷，聚環(huán)氧丙烷和聚環(huán)氧丁烷縮合物適于用作本發(fā)明的表面活性劑系統(tǒng)的非離子表面活性劑，優(yōu)選聚環(huán)氧乙烷縮合物。這些化合物包括具有烷基的烷基酚縮合產(chǎn)物，該烷基含約6到14個碳原子，優(yōu)選從約8至約14個碳原子，其與環(huán)氧烷形成直鏈或支鏈構(gòu)型。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，對每一摩爾烷基酚而言，環(huán)氧乙烷的量約等于2到25摩爾，更優(yōu)選約3到約15摩爾。市場上可買到的這種類型的非離子表面活性劑包括IgepalTMCO-630，由GAF公司出售；以及由Rohm & Haas公司出售的TritonTMX-45、X-114、X-100和X-102。這些表面活性劑一般被稱為烷基酚烷氧基化物(例如，烷基酚乙氧基化物)。
伯和仲脂族醇與約1到約25摩爾的環(huán)氧乙烷的縮合產(chǎn)物適于用作本發(fā)明的非離子表面活性劑系統(tǒng)的非離子表面活性劑。脂族醇的烷基鏈可以是直鏈，也可以是支鏈，可以是伯的，也可以是仲的，并且一般含有約8到約22個碳原子。優(yōu)選那些具有含約8到約20個碳原子、更優(yōu)選從10到18個碳原子的烷基的醇與對每摩爾醇來說含約2到約10摩爾的環(huán)氧乙烷的縮合產(chǎn)物。在所說的縮合產(chǎn)物中對每摩爾醇有約2到約7摩爾的環(huán)氧乙烷并且最優(yōu)選從2到5摩爾的環(huán)氧乙烷。市場上可買到這種類型的非離子表面活性劑的實(shí)例包括TergitolTM15-5-9(C11-C15線性醇與9摩爾環(huán)氧乙烷的縮合物)，TergitolTM24-L-6 NMW(C12-C14伯醇與有窄的分子量分布范圍的6摩爾的環(huán)氧乙烷縮合物)，二者都由Union Carbide公司出售；NeoddTM45-9(C14-C15線性醇與4摩爾的環(huán)氧乙烷縮合產(chǎn)物)，NeodolTM23-3(C12-C13線性醇與3.0摩爾的環(huán)氧乙烷的縮合物)，NeodolTM45-7(C14-C15線性醇與7摩爾環(huán)氧乙烷的縮合物)，NeodolTM45-5(C14-C15線性醇與5摩爾環(huán)氧乙烷的縮合物)，它們由Shell化學(xué)公司出售；由Procter & Gamble公司出售的KyroTMEOB(C13-C15醇與9摩爾的環(huán)氧乙烷的縮合物)，由Hoechst出售的GenapolLA 050(C12-C14醇與5摩爾的環(huán)氧乙烷的縮合物)。這些產(chǎn)品中優(yōu)選的HLB范圍從8-11而且最優(yōu)選從8-10。
也在本發(fā)明的表面活性劑系統(tǒng)中用作非離子表面活性劑是US 4,564,647所公開的烷基多糖，其帶有的疏水基因含有約6到約30個碳原子，優(yōu)選約10到約16個碳原子以及多糖，例如聚苷，親水基含約1.3到約10，優(yōu)選約1.3到約3，最優(yōu)選約1.3到約2.7個多糖單位?？墒褂萌魏魏?到6個碳原子的還原多糖，例如葡萄糖、半乳糖而半乳糖基部分可用來代替葡糖基部分(可選地疏水基結(jié)合到2-,3-,4-等位上從而得到與葡糖苷或半乳糖苷相對的葡萄糖或半乳糖)。該多糖間鍵可為，例如，在一個額外的多糖單位的位置與上述多糖單位的2-,3-,4-和/或6-位之間。
優(yōu)選的烷基多糖具有下面的通式R2O(CnH2nO)t(糖基)x其中R2選自烷基、烷基苯基、羥烷基、羥烷基苯基，或者它們的混合物，其中的烷基含有約10到約18，優(yōu)選從約12到約14個碳原子；n為2或3；t從0到約10；優(yōu)選0；X從1.3到約10，優(yōu)選從1.3到約3，最優(yōu)選從1.3到約2.7。糖基優(yōu)選衍生自葡萄糖。為制備這些化合物，首先制備醇或烷基聚乙氧基醇，然后與葡萄糖或葡萄糖源反應(yīng)以形成葡糖苷(結(jié)合到1-位上)。然后，該額外的糖基單位可以在其1-位與原先的糖基單位的2-、3-、4-和/或6-位結(jié)合，優(yōu)選絕大部分在2-位間結(jié)合。
環(huán)氧丙烷與丙二醇縮合所形成的疏水基與環(huán)氧乙烷的縮合物也適于用作本發(fā)明的另一的非離子表面活性劑系統(tǒng)。這些化合物的疏水部分優(yōu)選具有從約1500到約1800的分子量并且具水不溶性。聚氧乙烯部分在這種疏水部分的加入能夠增加整個分子的水溶性，并且該產(chǎn)品的液態(tài)特征保留到聚氧乙烯含量到濃縮物總重的50％，其相當(dāng)于與達(dá)約40摩爾的環(huán)氧乙烷發(fā)生縮合。這種類型的化合物的實(shí)例包括由BASF出售的一些在市場上可買到的PluronicTM表面活性劑。
還可用作本發(fā)明的非離子表面活性劑系統(tǒng)的非離子表面活性劑是環(huán)氧乙烷與由環(huán)氧丙烷和1,2-乙二胺反應(yīng)所得的產(chǎn)物所形成的縮合物。這些產(chǎn)物的疏水部分由1,2-乙二胺和過量的環(huán)氧丙烷的反應(yīng)產(chǎn)物組成，并且一般其分子量從約2500到約3000。該疏水部分與環(huán)氧乙烷縮合至縮合產(chǎn)物中含有40％到約80％重量的聚氧乙烯并且分子量從約5000到約11000的程度。這種類型的非離子表面活性劑包括某些市場上可買到的由BASF出售的TetronicTM產(chǎn)品。
優(yōu)選用作在本發(fā)明的表面活性劑系統(tǒng)中的非離子表面活性劑的為烷基酚的聚環(huán)氧乙烷縮合物，伯和仲脂族醇與從約1到約25摩爾的環(huán)氧乙烷的濃縮物，烷基多糖，及它們的混合物。最優(yōu)選的是具有從3到15個乙氧基的C8-C14烷基酚乙氧基化物和C8-C18醇乙氧基化物(優(yōu)選C10平均數(shù))，而后者具有從2到10個乙氧基，以及它們的混合物。
高度優(yōu)選的非離子表面活性劑是具有下列通式的多羥基脂肪酸酰胺表面活性劑

其中R1為H，或R1為C1-4烴基、2-羥乙基、2-羥丙基或它們的混合物，R2是C5-31烴基，而Z為聚羥基烴基，其具有一個線性烴基鏈，其上有與其直接相連的至少三個烴基，或它們的乙氧化的衍生物。優(yōu)選R1為甲基，R2為直鏈的C11-15烷基或C16-C18烷基或鏈烯基鏈例如椰子烷基或其混合物，而Z衍生自還原胺化反應(yīng)中的還原糖例如葡萄糖、果糖、麥芽糖或乳糖。
高度優(yōu)選的陰離子表面活性劑包括烷基烷氧基化的硫酸鹽表面活性劑。此處的實(shí)例包括通式為RO(A)mSO3M的水溶性的鹽或酸，其中R為未取代的C10-C24烷基或具有C10-C24烷基成分的羥烷基，優(yōu)選C12-C20烷基或羥烷基，更優(yōu)選C12-C18烷基或羥烷基，A為乙氧基或丙氧基單位，m大于零，典型地在0.5到約6之間，更優(yōu)選在0.5到約3之間，而M為H或陽離子，例如可為一個金屬陽離子(例如，鈉、鉀、鋰、鈣、鎂，等)，銨或取代的銨陽離子。烷基乙氧基化的硫酸鹽及烷基丙氧基化的硫酸鹽在本發(fā)明中都被考慮。取代的銨陽離子的特定實(shí)例包括甲基、二甲基、三甲基銨陽離子以及季銨陽離子例如四甲基銨以及二甲基哌啶鎓離子及那些衍生自烷基胺例如乙胺、二乙胺、三乙胺的，它們的混合物，及諸如此類。表面活性劑的實(shí)例為C12-C18烷基聚乙氧基化物(1.0)硫酸鹽(C12-C18E(1.0)M),C12-C18烷基聚乙氧基化物(2.25)硫酸鹽(C12-C18(2.25)M，以及C12-C18烷基聚乙氧基化物(3.0)硫酸鹽(C12-C18E(3.0)M)，以及C12-C18烷基聚乙氧基化物(4.0)硫酸鹽(C12-C18E(4.0)M)，其中M可便利地從鈉和鉀中選擇。
所要使用的合適的陰離子表面活性劑為烷基酯磺酸鹽表面活性劑，包括根據(jù)“美國石油化學(xué)學(xué)會期刊”，52(1975)第323-329頁用氣態(tài)SO3磺化的C8-C20羧酸(即，脂肪酸)的線性酯。合適的起始物質(zhì)可包括衍生自動物脂、棕櫚油等的天然的脂肪族物質(zhì)。
優(yōu)選的烷基酯磺酸鹽表面活性劑，尤其是用于洗衣的，包括具有下列結(jié)構(gòu)通式的烷基酯磺酸鹽表面活性劑

其中R3是C8-C20烴基，優(yōu)選烷基，或其組合，R4是C1-C6烴基，優(yōu)選烷基，或其組合，M是與烷基酯磺酸鹽形成水溶性鹽的陽離子。合適的形成鹽的陽離子包括金屬，如鈉鉀，和鋰，以及取代或非取代的銨陽離子，例如單乙醇胺、二乙醇胺，和三乙醇胺。優(yōu)選R3為C10-C16烷基，R4為甲基，乙基或異丙基。尤其優(yōu)選的是甲基酯磺酸鹽，其中R3為C10-C16烷基。
其它合適的陰離子表面活性劑包括烷基硫酸鹽表面活性劑，其為通式為ROSO3M的水溶性鹽或酸，其中R優(yōu)選為C10-C24烴基，優(yōu)選為具有C10-C20烷基成分的烷基或羥烷基，更優(yōu)選為C12-C18烷基或羥烷基，而M為H或陽離子，例如堿金屬陽離子(例如鈉、鉀、鋰)，或銨或取代的銨(例如甲基-、二甲基-、和三甲基銨陽離子及季銨陽離子例如四甲基銨和二甲基哌啶鎓陽離子及衍生自例如乙銨、二乙胺、三乙胺，和它們的混合物的季胺陽離子，等等)。一般而言，C12-C16的烷基鏈優(yōu)選于較低的洗滌溫度(例如低于約50℃)以及C16-C18烷基鏈優(yōu)選于較高的洗滌溫度(例如高于約50℃)。
用于洗滌目的其它陰離子表面活性劑也可包括到本發(fā)明的洗衣劑組合物中來。這些可包括皂的鹽(包括，例如，鈉、鉀、銨和取代的銨鹽例如單、二和三乙醇銨鹽)，C8-C22伯或仲烷基磺酸鹽，C8-C24烯屬磺酸鹽，通過堿土金屬檸檬酸鹽的熱解產(chǎn)物的磺化制備的磺化的聚羧酸，例如英國專利說明書1,082,179所描述，C8-C24烷基聚乙二醇醚硫酸鹽(含有多至10摩爾的環(huán)氧乙烷)；烷基甘油磺酸鹽，脂肪酰甘油磺酸鹽、脂肪油酰甘油硫酸鹽、烷基、酚環(huán)氧乙烷醚硫酸鹽、鏈烷烴磺酸鹽、烷基磷酸鹽、羥乙磺酸鹽例如酰基羥乙磺酸鹽，N-酰基?；撬猁}，烷基琥珀酰胺酸鹽和磺基琥珀酸鹽，磺基琥珀酸酯的單酯(尤其是飽和和未飽和的C12-C18單酯)以及磺基琥珀酸酯的二酯(尤其是飽和和未飽和的C6-C12二酯)，?；“彼猁}，烷基多糖的硫酸鹽例如烷基聚葡糖苷的硫酸鹽(如下所述的非離子非硫酸化的化合物)，支鏈的伯烷基硫酸鹽，以及烷基聚乙氧基羧酸鹽例如那些具通式RO(CH2CH2O)k-CH2OO-M+的，其中R是C8-C22烷基，k是1-10的整數(shù)，而M為形成可溶鹽的陽離子。樹脂酸和氫化的樹脂酸也是適合的，例如松脂、氫化的松脂，以及存在于或衍生自浮油的樹脂酸和氫化的樹脂酸。
高度優(yōu)選的是烷基苯磺酸鹽。尤其優(yōu)選的是線性(直鏈)的烷基苯磺酸鹽(LAS)，其中的烷基優(yōu)選含有從10到18個碳原子。
進(jìn)一步的實(shí)例見“表面活性劑和去污劑”(第Ⅰ卷和第Ⅱ卷，Schwartz,Perry和Berch)。許多這種表面活性劑在US 3,929,678中也有一般性的公開(第23段，第58行到第29段，第23行，在此處用作參考)。
若被包括其中，本發(fā)明的洗衣劑組合物一般從約1％到約40％，優(yōu)選從約3％到約20％重量的這種陰離子表面活性劑。
本發(fā)明的洗衣劑組合物也可含有陽離子、兩性、兩性離子和半極性的表面活性劑，以及除了本文已描述過的以外的其它非離子和/或陰離子表面活性劑。
適于本發(fā)明的洗衣去污劑組合物所用的陽離子去污表面活性劑是具一個長鏈烴基的那些。這種陽離子表面活性劑的實(shí)例包括銨表面活性劑例如烷基三甲基銨鹵化物，以及具有通式[R2(OR3)y][R4(OR3)y]2R5N+X-的表面活性劑，其中R2為烷基或在烷基鏈中具有約8到約18個碳原子的烷基芐基基團(tuán)，每個R3選自-CH2CH2-,-CH2CH(CH3)-,CH2CH(CH2OH)-,-CH2CH2CH2-，以及它們的混合物；每個R4選自C1-C4烷基，C1-C4羥烷基，通過將兩個R4基團(tuán)結(jié)合在一起形成的芐環(huán)，-CH2CHOHCHOHCOR6CHOHCH2OH其中R6為己糖或任何分子量小于1000的己糖多聚物，而且當(dāng)y不是0時，它是氫；R5與R4相同或者它是一個烷基鏈，其中碳原子總數(shù)或R2加上R5不多于約18；每個y從0到約10，而y值的總數(shù)從0到約15；X是任何相容的陰離子。
高度優(yōu)選的陽離子表面活性劑是本發(fā)明的組合物中所用的水溶性季銨化合物，其具有下列通式R1R2R3R4N+X-(i)其中R1為C8-C16烷基，R2,R3和R4中的每一個分別是C1-C4烷基，C1-C4羥烷基，芐基，以及-(C2H40)xH其中x的值從2到5，而X為陰離子。R2,R3或R4中不少于一個應(yīng)為芐基。
對R1，優(yōu)選的烷基鏈長為C12-C15，尤其若其中烷基為衍生自椰子或棕櫚核脂肪的鏈長的混合物或者是由烯烴構(gòu)建或羰基合成醇合成而人工合成衍生時。
優(yōu)選的R2R3和R4基團(tuán)是甲基和羥乙基，而且陰離子X可選自鹵離子、甲基硫酸根、乙酸根及磷酸根離子。
此處所用的合適的通式(ⅰ)的季銨化合物的實(shí)例為氯化或溴化椰子三甲基銨；氯化或溴化椰子甲基二羥乙基銨；氯化癸基三乙基銨；氯化或溴化癸基二甲基羥乙基銨；氯化或溴化C12-C15二甲基羥乙基銨；氯化或溴化椰子二甲基羥乙基銨；甲基硫酸肉豆蔻基三甲基銨；氯化或溴化月桂基二甲基芐銨；氯化或溴化月桂基二甲基(乙氧基)4銨；膽堿酯(通式(ⅰ)的化合物，其中R1為

烷基而且R2R3R4為甲基)。
二-烷基咪唑啉[通式(ⅰ)的化合物]。
此處所用的其它陽離子表面活性劑也在US 4,228,044和EP 000 224中有描述。
若在其中包括，本發(fā)明的洗衣劑組合物一般包括從0.2％到約25％，優(yōu)選從約1％到8％重量的這種陽離子表面活性劑。
兩性表面活性劑也適用于本發(fā)明的洗衣劑組合物。這些表面活性劑可被廣泛地描述為仲胺或叔胺的脂族衍生物；或者是雜環(huán)仲胺和叔胺的脂族衍生物，其中脂族基團(tuán)可以是直鏈也可是支鏈的。其中的一個脂族取代基含有至少約8個碳原子，一般從約8到約18個碳原子，并且至少一個是含有陰離子的水溶性基團(tuán)的，例如羧基、磺酸根，硫酸根。兩性表面活性劑的實(shí)例見US 3,929,678(第19段，第18-35行)。
若包括其中，本發(fā)明的洗衣劑組合物一般含有從0.2％到約15％，優(yōu)選從約1％到10％的重量的這種兩性表面性劑。
兩性離子表面活性劑也適用于洗衣劑組合物。這些表面表面活性劑可被廣泛地描述為仲胺和叔胺的衍生物，雜環(huán)仲胺和叔胺的衍生物，或者季胺的衍生物，季磷鎓或叔锍化合物的衍生物。兩性離子表面活性劑的實(shí)例參見US 3,929,678(第19段，第39行至第22段，第48行)。
若包括其中，本發(fā)明的洗衣劑組合物一般包括從0.2％到約15％，優(yōu)選從約1％到約10％重量的這種兩性離子表面活性劑。
半極性的非離子表面活性劑是一類特殊的非離子表面活性劑，其包括水溶性的氧化胺，其含有一個烷基部分，有從約10到約18個碳原子，以及選自含有約1到約3個碳原子的烷基和羥烷基的2個部分；含有一個從約10到約18個碳原子的烷基部分以及選自含約1-3個碳原子的烷基和羥烷基的2部分的水溶性氧化膦；以及含約10到約18個碳原子的烷基部分及一個選自含從約1到約3個碳原子的烷基和羥烷基部分的水溶性的亞砜。
半極性的非離子去污劑表面活性劑包括具有下式的氧化胺表面活性劑

其中R3為含從約8到約22個碳原子的烷基、羥烷基、或烷基苯基或其混合物；R4為含有從約2到約3個碳原子的亞烷基或羥亞烷基或其混合物；x從0到約3而每個R5為烷基或羥烷基，其含有從約1到約3個碳原子，或含有從約1到約3個環(huán)氧乙烷基團(tuán)的聚環(huán)氧乙烷基。該R5基團(tuán)可互相結(jié)合，例如，通過一個氧原子或氮原子來形成環(huán)的結(jié)構(gòu)。
這些氧化胺表面活性劑尤其包括C10-C18烷基二甲基氧化胺和C8-C12烷氧基乙基二羥基乙基氧化胺。
若包括于其中，本發(fā)明的洗衣洗劑組合物一般包含從0.2％到約15％；優(yōu)選從約1％到約10％重量的這種半極性非離子表面活性劑。助洗劑系統(tǒng)根據(jù)本發(fā)明的組合物可進(jìn)一步含有助洗劑系統(tǒng)。任何傳統(tǒng)的助洗劑系統(tǒng)都在此處適用，包括硅鋁酸鹽材料、硅酸鹽、聚羧酸鹽和脂肪酸，例如乙二胺四乙酸鹽的材料，金屬離子螯合劑，如氨基聚膦酸鹽，尤其是乙二胺四亞甲基膦酸及二乙三胺五亞甲基膦酸。雖由于明顯的環(huán)境原因而較不優(yōu)選，但此處還是可以使用磷酸鹽助洗劑的。
合適的助洗劑可以是無機(jī)的離子交換物質(zhì)，一般是無機(jī)的水合的硅鋁酸鹽材料，更具體是水合的合成的沸石例如水合沸石A、X、B、HS或MAP。
另外的合適的無機(jī)助洗劑材料是層疊式的硅酸鹽，例如SKS-6(Hoechst)。SKS-6是由硅酸鈉(Na2Si2O5)組成的結(jié)晶態(tài)的層疊式硅酸鹽。
含有一個羧基的合適的聚羧酸鹽包括比利時專利號831,368,821,369和821,370所公開的乳酸、乙醇酸及其醚衍生物。含有兩個羧基的聚羧酸鹽包括琥珀酸、丙二酸、(亞乙二氧基)二乙酸、馬來酸、二乙醇酸、酒石酸，丙醇二酸和富馬酸的水溶性鹽類，以及德國公開說明書2,446,686，以及2,446,487，美國3,935,257中所描述的醚羧酸鹽以及比利時專利號840,623中所描述的亞磺酰羧酸鹽。含有三個羧基的聚羧酸鹽包括，尤其是，水溶性的檸檬酸鹽、順烏頭酸鹽(aconitrate)和檸康酸鹽以及琥珀酸鹽衍生物例如英國專利號1,379,241所描述的羧甲基氧琥珀酸鹽，荷蘭申請7205873所描述的乳氧琥珀酸鹽，以及英國專利號1,387,447中所描述的氧化聚羧酸鹽材料例如2-噁-1,1,3-丙烷三羧酸鹽。
含有四個羧基的聚羧酸鹽包括英國專利號1,261,829所公開的氧二琥珀酸鹽、1,1,2,2-乙烷四羧酸鹽，含磺基取代基的1,1,3,3-丙烷四羧酸鹽，包括英國專利號1,398,421和1,398,422和美國專利號3936,488所公開的磺基琥珀酸鹽衍生物，以及英國專利號1,082,179所描述的磺化的熱解的檸檬酸鹽，而英國專利號1,439,000中所公開的是含膦取代基的聚羧酸鹽。
脂族和雜環(huán)的聚羧酸鹽包括環(huán)戊烷-順，順-順-四羧酸鹽，環(huán)戊二烯五羧酸鹽(cyclopentadienide pentacarboxylates),2,3,4,5-四氫呋喃-順，順，順-四羧酸鹽，2,5-四氫-呋喃-順，順羧酸鹽(2,5-tetrahydro-furan-cis,discarboxylates),2,2,5,5-四氫呋喃-四羧酸鹽，1,2,3,4,5,6-己烷-六羧酸鹽和多元醇例如山梨醇、甘梨糖醇和木糖醇的羧甲基衍生物。英國專利號1,425,343中所公開的芳香族聚羧酸鹽包括苯六甲酸、1,2,4,5苯四酸以及苯二甲酸衍生物。
上述中，優(yōu)選的聚羧酸鹽是每分子含有多至三個羧基的羥基羧酸鹽，更具體的是檸檬酸鹽。
本發(fā)明優(yōu)選使用的優(yōu)選的助洗劑系統(tǒng)包括一種水溶性硅鋁酸鹽助洗劑例如沸石A或?qū)盈B硅酸鹽(SKS-6)與一種水溶性的羧酸螯合劑例如檸檬酸的混合物。
包括在本發(fā)明的去污劑組合物中的合適的螯合劑是乙二胺-N,N′-二琥珀酸(EDDS)或者是其堿金屬、堿土金屬，銨，或取代的銨鹽，或其混合物。優(yōu)選的EDDS化合物為游離酸形式，和其鈉或鎂鹽。這種優(yōu)選的EDDS的鈉鹽實(shí)例包括Na2EDDS和Na4EDDS。這種優(yōu)選的EDDS的鎂鹽實(shí)例包括MgEDDS和Mg2EDDS。根據(jù)本發(fā)明的組合物中最優(yōu)選是其鎂鹽。
優(yōu)選的助洗劑系統(tǒng)包括水不溶性鋁硅酸助洗劑例如沸石A與水溶性羧酸螯合劑例如檸檬酸的混合物。
能夠用于顆粒組合物中形成助洗劑系統(tǒng)部分的其它助洗劑物質(zhì)包括無機(jī)物質(zhì)例如堿金屬碳酸鹽，碳酸氫鹽、硅酸鹽，和有機(jī)物質(zhì)例如有機(jī)膦酸鹽、氨基聚亞烷磷酸鹽和氨基聚羧酸鹽。
其它合適的水溶性有機(jī)鹽是其均聚或共聚酸或其鹽，其中聚羧酸包括至少兩個羧基，它們由不超過兩個的碳原子分隔開。
這種類型的多聚物公開于GB-A-1,596,756中。這種鹽的實(shí)例為MW2000-5000的聚丙烯酸鹽及其與馬來酐的共聚體，這種共聚物的分子量從20,000到70,000，特別是約40,000。
洗滌劑助洗劑鹽一般包括的量是組合物重量的5％到80％。液體洗滌劑的助洗劑的優(yōu)選量從5％到30％。酶優(yōu)選的洗滌劑組合物除了本發(fā)明的酶制劑之外，還包括其它提供清潔效果和/或織物護(hù)理優(yōu)點(diǎn)的酶。
這類酶包括其它蛋白酶、脂酶、角質(zhì)酶(Cutinases)、淀粉酶、纖維素酶、過氧化物酶、氧化酶(例如漆酶)。蛋白酶任何適于在堿性溶液中使用的其它蛋白酶都可使用。合適的蛋白酶包括那些來源于動物、植物或微生物的。優(yōu)選來源于微生物的。包括化學(xué)或遺傳修飾后的突變體。該蛋白酶可以是絲氨酸蛋白酶，優(yōu)選堿性微生物蛋白酶或類胰蛋白酶的蛋白酶。堿性蛋白酶的實(shí)例是枯草蛋白酶、尤其是那些衍生自芽孢桿菌的，例如枯草蛋白酶Novo，枯草蛋白酶Carlsberg，枯草蛋白酶309，枯草蛋白酶147和枯草蛋白酶148(WO 89/06279有描述)。類糜蛋白酶的蛋白酶的實(shí)例是胰蛋白酶(例如來源于豬或牛)及WO89/06270中所述的鐮孢菌屬蛋白酶。
優(yōu)選的市場上可買到的蛋白酶包括那些以商品名Alcalase、Savinase、Primase、Durazym，和Esperase，由Novo Nordisk A/S(丹麥)出售，由Genencor Intemational以商品名Maxatase、Maxacal、Maxapem、Properase、Purafect和Purafect OXP，以及由Solvay Enzymes以商品名Opticlean和Optimase出售的?？砂ㄔ诒景l(fā)明的組合物范圍內(nèi)的蛋白酶占從0.00001％到2％的組合物重量的酶蛋白，優(yōu)選0.001％-1％組合物重量的酶蛋白，更優(yōu)選占該組合物重量0.001％到0.5％的酶蛋白，進(jìn)一步優(yōu)選占該組合物重量0.01％到0.2％的酶蛋白。脂肪酶任何適于在堿性溶液中使用的脂肪酶都可被使用。適合的脂肪酶包括那些來源于細(xì)菌或真菌的。包括化學(xué)或遺傳修飾的突變體。
有用的脂肪酶的實(shí)例包括Humicola lanuginosa脂酶，例如EP 258 068和EP 305 216中所描述，Rhizomucor miehei脂酶，例如EP 238,023中所描述，念珠菌屬脂酶，例如C.antarctica脂酶，例如EP 214 761中所述的C.antarctica脂酶A和B，假單胞菌屬脂酶如產(chǎn)堿假單胞菌和類產(chǎn)堿假單胞菌，例如EP 218 272中所述，洋蔥伯克霍爾德氏菌脂酶，例如EP 331 376中所述，施氏假單胞菌脂酶，例如GB 1,372,034所公開，熒光假單胞菌脂酶，芽孢桿菌脂酶，例如枯草芽孢桿菌脂酶(Dartois等，(1993),Biochemicaet Biophysia acta 1131,253-260)，嗜熱脂肪芽孢桿菌脂酶(JP 64/744992)及短小芽孢桿菌脂酶(WO 91/16422)。
而且，可以使用許多克隆的脂酶，包括Yamaguchi等(1991),Gene 103,61-67所描述的沙門氏柏干酪青霉脂酶，白地霉脂酶(Schimada,Y.等，(1989),J.Biochem.,106,383-388)，以及各種根霉脂酶例如德列馬青霉脂酶(Hass,M.J.等，(1991),Gene 109,117-113)，雪白根霉(Kugimiya等，(1992),Biosci,Biotech.Biochem.56,T16-719)和米根霉脂酶。
也可使用其它類型的脂解酶例如角質(zhì)酶，例如WO 88/09367所述的來源于門多茜娜假單胞菌的角質(zhì)酶，或者是來源于Fusarium solani pisi(例如WO 90/09446中所述)的角質(zhì)酶。
特別適合的脂酶是例如M1 LipaseTM、Luma fastTM和LipomaxTM(Genecor),LipolaseTM和Lipolase UltraTM(Novo Nordisk A/S)，以及Lipase P“Amano”(Amano Pharmaceutical Co.Ltd.)的脂酶。
這些脂酶在去污劑組合物中一般以該組合物重量的0.00001％到2％的酶蛋白的量存在，優(yōu)選為占該組合物重量的0.0001％到1％的酶蛋白，更優(yōu)選為占該組合物重量0.001％到0.5％的酶蛋白，進(jìn)一步優(yōu)選為占該組合物重量0.01％到0.2％的酶蛋白。
淀粉酶任何適于在堿性溶液中使用的淀粉酶(α和/或β)都可使用。合適的酶包括那些來源于細(xì)菌和真菌的。包括化學(xué)或遺傳修飾的突變體。淀粉酶包括，例如，來自于地衣芽孢桿菌的特定株的α-淀粉酶，其在GB1,296,839中有更詳細(xì)的描述。市場上可買到的淀粉酶為DuramylTM,TermamylTM，F(xiàn)ungammylTM和BANTM(來自于Novo Nordisk A/S)和RapidaseTM和Maxamyl PTM(來自于Genencor)。
在去污劑組合物中所包括的淀粉酶的量一般是占組合物重量為0.00001％到2％的酶蛋白，優(yōu)選為占該組合物重量0.0001％到1％的酶蛋白，更優(yōu)選為占該組合物重量0.001％到0.5％的酶蛋白，進(jìn)一步優(yōu)選為占該組合物重量為0.01％到0.2％的酶蛋白。纖維素酶可使用任何用于堿性溶液中的纖維素酶。合適的纖維素酶包括那些來源于細(xì)菌或真菌的。包括化學(xué)或遺傳修飾的突變體。合適的纖維素公開于美國4,435,307中，其公開了來自于Humicola insolens的真菌纖維素酶。尤其適合的纖維素酶是具有護(hù)色功能的纖維素酶。這種纖維素酶的實(shí)例是歐洲專利申請?zhí)? 495 257中所述的纖維素酶。
市場上可買到的纖維素酶包括CelluzymeTM，其產(chǎn)自Humicola insolens的一個菌株(Novo Nordisk A/S)，以及KAC-500(B)TM(Kao Corporation)。
洗滌劑組合物中的纖維素酶常以占該組合物重量的0.00001％到2％酶蛋白的量加入，優(yōu)選為占該組合物重量的0.0001％到1％酶蛋白，更優(yōu)選為占該組合物重量0.001％到0.5％的酶蛋白，進(jìn)一步優(yōu)選為占該組合物重量的0.01％到0.2％的酶蛋白。過氧化物酶/氧化酶過氧化物酶與過氧化氫或其來源一起使用(例如過碳酸鹽、過硼酸鹽或過硫酸鹽)。氧化酶與氧一起使用。兩種類型的酶都用于“溶液漂白”，即當(dāng)所說的織物在洗滌液中一起洗滌時防止織物染料從一種已染色的織物轉(zhuǎn)移到另一種織物上，優(yōu)選與例如WO 94/12621和WO 95/01426的增效劑一起使用。合適的過氧化氫酶/氧化酶包括來自于植物、細(xì)菌和真菌的。包括化學(xué)或遺傳修飾的突變體。
過氧化氫酶和/或氧化酶一般以占該組合物重量0.00001％到2％的酶蛋白的量加入到洗滌劑組合物中，優(yōu)選以占該組合物重量0.0001％到1％的酶蛋白的量，更優(yōu)選以占該組合物重量的0.001％到0.5％酶蛋白的量，進(jìn)一步優(yōu)選占該組合物重量的0.01％到0.2％的量。
本文包括上述的酶的混合物，優(yōu)其是蛋白酶、淀粉酶，脂酶和/或纖維素酶。
本發(fā)明的酶，或者加入到洗滌劑組合物中的任何其它酶一般都以占該洗滌劑組合物重量的0.00001％到2％的蛋白酶量加入，優(yōu)選以占該組合物重量的0.0001％到1％的酶蛋白的量，更優(yōu)選以占該組合物重量的0.001％到0.5％的酶蛋白的量，進(jìn)一步優(yōu)選以占該組合物重量的0.01％到0.2％的量。漂白劑額外的可選洗滌劑成分可以包括在本發(fā)明的洗滌劑組合物中的包括漂白劑例如PB1、PB4和具有顆粒大小為400-800微米的過碳酸鹽。這些漂白劑組分可包括一種或多種氧漂白劑以及，取決于所選漂白劑的一種或多種漂白活化劑。本氧漂白化合物將一般以約1％到約25％的量存在。一般而言，在非液體配方如粒狀去污劑中，漂白化合物是任選加入的成分。
此處所用的漂白劑可以是任何用于去污劑組合物中的漂白劑，包括氧漂白劑及其它本領(lǐng)域熟知的。
適用于本發(fā)明的漂白劑可以是活化或非活化的漂白劑。
可以使用的一類氧漂白劑包括過羧酸漂白劑及其鹽。該類型漂白劑的合適實(shí)例包括六水合單過氧鄰苯二甲酸鎂，間氯過苯甲酸、4-壬胺-4-氧代過氧丁酸和二過氧十二雙酸的鎂鹽。這類漂白劑公開于US 4,483,781,US740,446,EP 0 133 354和US 4,412,934中。高度優(yōu)選的漂白劑還包括6-壬胺-6-氧代過氧己酸，如US 4,634,551中有描述。
另一類可以使用的漂白劑包括鹵素漂白劑。hypohalite漂白劑的實(shí)例例如包括三氯異氰尿酸以及二氯異氰尿酸的鈉和鉀鹽，以及N-氯和N-溴烷基磺酰胺。這些材料一般以占終產(chǎn)品重量的0.5-10％加入，優(yōu)選以1-5％的重量。
可與漂白活化劑一起使用的過氧化氫釋放劑例如四乙酰乙二胺(TAED)，壬酰氧苯磺酸鹽(NOBS，描述于US 4,412,934),3,5-三甲基-己酰氧苯磺酸鹽(ISONOBS,EP 120591所述)或五乙酰葡萄糖(PAG)，其被全水解形成過酸作為活性漂白物，產(chǎn)生改進(jìn)的漂白效果。此外，非常適用的有漂白活化劑C8(6-辛酰氨-己酰)氧苯磺酸鹽，C9(6-壬酰氨-己酰)氧苯磺酸鹽和C10(6-癸酰氨己酰)氧苯磺酸鹽或其混合物。也適合的活化劑是酰化的檸檬酸酯，例如歐洲專利申請?zhí)?1870207.7中所公開的。
包括過酸及含有本發(fā)明的清洗組合物所用的漂白活化劑和過氧漂白化合物的漂白系統(tǒng)的有用的漂白劑描述于申請USSN 08/136,626中。
通過加入酶系統(tǒng)(即酶及其底物)也可以產(chǎn)生過氧化氫，該酶系統(tǒng)在洗滌和/或漂洗過程開始或進(jìn)行中能夠產(chǎn)生過氧化氫。這種酶系統(tǒng)公開于歐洲專利申請EP 0 537 381中。
除了氧漂白劑外的漂白劑也是本領(lǐng)域已知的而且可用于此處。特別感興趣的一種非氧漂白劑包括光活化的漂白劑例如磺化酞菁鋅和/或鋁。在洗滌過程中這些物質(zhì)可沉積到底物上。當(dāng)以光照射時，在有氧存在下，例如將衣物掛于日光下，磺化的酞菁鋅被活化，并因此使得底物被漂白。優(yōu)選的酞菁鋅和光活化的漂白過程描述于US 4,033,718中。一般地，去污劑組合物中將含占其重量約0.025％到約1.25％的磺化酞菁鋅。
漂白劑還可含有錳催化劑。該錳催化劑可例如是描述于“低溫漂白的有效的錳催化劑”Nature 369,1994，第637-639中的一種化合物。泡沫抑制劑另外一個可選的成分是泡沫抑制劑，其例子有硅氧烷和硅石-硅氧烷混合物。硅氧烷一般以烷基化的聚硅氧烷材料表示，而硅石常使用是精細(xì)分散的形式的，其例子是硅石氣凝膠和干凝膠以及各種類型的疏水二氧化硅。這些材料可作為粒子加入，其中的泡沫抑制劑有益可釋放地?fù)饺氲剿苄曰蛩蓴U(kuò)散性的，基本上是非表面活性去污劑可滲透的載體中?？苫Q地，泡沫抑制劑可溶于或分散于液態(tài)載體中，并通過噴灑而應(yīng)用于一種或多種其它組分上。
優(yōu)選的硅氧烷泡沫抑制劑公開于US 3,933,672中。其它特別有用的泡沫抑制劑為自身乳化硅氧烷泡沫抑制劑，描述于德國專利申請DTOS2,646,126中。這種化合物的一個實(shí)例是DC-544，市場上可買到的形式是Dow Corming，其為一種硅氧烷-甘醇共聚物。尤其優(yōu)選的泡沫控制劑是含有硅氧烷油和2-烷基-鏈烷醇的混合物的抑泡系統(tǒng)。合適的2-烷基-鏈烷醇是2-丁基-辛醇，其市場上可買到的是商品名ISofol 12R。
這種泡沫抑制劑系統(tǒng)描述于歐洲專利申請EP 0 593 841。
尤其優(yōu)選的硅氧烷泡沫抑制劑描述于歐洲專利申請?zhí)?2201649.8。所說的組合物可包含硅氧烷/二氧化硅混合物，其結(jié)合煙熏的非多孔性二氧化硅例如Aerosil_。
上面所描述的泡沫抑制劑使用時一般占本組合物重量的0.001％到20％，優(yōu)選從0.01％到1％。其它成分在去污劑組合物中使用的其它成分可有例如污垢懸浮劑、污垢釋放劑，熒光增白劑、研磨劑、殺菌劑、晦暗抑制劑、著色劑、和/或包膠或未包膠的香料。
尤其適用的包膠材料是水溶性的膠囊，其由多糖和多羥基的化合物組成，例如GB 1,464,616中所描述。
其它合適的水溶性包膠材料包括如US 3,455,838中所述的衍生自取代的二羧酸的未凝膠化的淀粉酸酯的糊精。這些酸性酯糊精優(yōu)選制備自這種淀粉例如含蠟玉米、含蠟高梁、西米、木薯和馬鈴薯。所說封裝材料的合適的例子包括由National Starch制造的N-Lok。N-Lok封裝材料由改良的玉米淀粉和葡萄糖組成。淀粉的改良通過加入單官能的取代基例如辛烯基琥珀酸酐。
此處適用的抗再沉洗劑和污垢懸浮劑包括纖維素衍生物例如甲基纖維素、羧甲基纖維素和羥乙基纖維素，以及均聚或共聚的聚羧酸或其鹽。這種類型的多聚物包括聚丙烯酸酯及前面提到過作為助洗劑的馬來酸酐-丙烯酸共聚物，以及馬來酸酐和乙烯，甲基乙烯基醚或異丁烯酸的共聚物，馬來酸酐至少構(gòu)成共聚物摩爾數(shù)的20％。這些材料一般用量是組合物重量的0.5％到10％，更優(yōu)選0.75％到8％，最優(yōu)選從1％到6％。
優(yōu)選的熒光增白劑是陰離子的，其例子有4,4′-二-(2-二乙醇氨-4-苯胺基-S-三嗪-6-基-氨基)芪-2:2′-二磺酸二鈉，4,-4′-=-(2-嗎啉代-4-苯胺基-S-三嗪-6-基氨基-芪-2:2′-二-磺酸二鈉，4,4′-二-(2,4-二-苯胺基-S-三嗪-6-基氨基)芪-2:2′-二磺酸二鈉，4′,4″-二-(2,4-二-苯胺基-S-三嗪-6-基氨基)芪-2-磺酸單鈉，4,4′-二-(2-苯胺基-4-(N-甲基-N-2-羥乙基氨基)-S-三嗪-6-基氨基)芪-2,2′-二磺酸二鈉，4,4′-二-(4-苯基-2,1,3-三唑-2-基)-芪-2,2′-二磺酸二鈉，4,4′二(2-苯胺基-4-(1-甲基-2-羥乙基氨基)-S-三嗪-6-基氨基)芪-2,2′-二磺酸二鈉，2(芪基-4″-(萘并-1′,2′:4,5-)-1,2,3-三唑-2″-磺酸鈉和4,4′-二(2-硫代苯乙烯基)二苯基。
其它有用的多聚體物質(zhì)為聚乙二醇，尤其是分子量為1000-10000，更尤其是2000到8000，最優(yōu)選為約4000。其用量為0.20％到5％重量，更優(yōu)選為0.25％到2.5％重量。這些多聚體和前面提到的均聚或共聚聚羧酸鹽在改進(jìn)的潔白保持、織物灰塵沉淀、以及在過渡金屬雜質(zhì)存在下對陶土，含蛋白質(zhì)及可氧化污垢的清潔效果方面是很有價值的。
在本發(fā)明的組合物中使用的污垢釋放劑一般是對苯二酸與乙二醇和/或丙二醇單位的以各種排列的共聚體或三元共聚物。這種多聚體的實(shí)例公開于US 4,116,885和4,771,730和EP 0 272 033中。根據(jù)EP 0 272 033的一個尤其優(yōu)選的多聚體具有通式(CH3(PEG)43)0.75(POH)0.25[T-PO]2.8(T-EG)0.4]T(POH)0.25((PEG)43CH3)0.75其中PEG為-(OC2H4)O-,PO為(OC3H6O),T是(POOC6H4CO)。
也很有用的是經(jīng)修飾的聚酯，其為二甲基對苯二酸、二甲基磺基異鄰苯二甲酸鹽、乙二醇和1,2-丙二醇的隨機(jī)共聚物，其末端基團(tuán)主要由硫代苯甲酸酯和次要的乙二醇和/1,2-丙二醇的單酯組成。目的是得到兩端都被加上了硫代苯甲酸基團(tuán)的帽子的多聚體，“主要”在本公開中此處所說的大多數(shù)共聚體將被硫代苯甲酸基加上末端帽子。然而，有些共聚體將有部分還未被全部加帽，因此其末端基團(tuán)可能由乙二醇和/或1,2-丙二醇的單酯所組成，因此由這些“次要”的物種。
此處所選的聚酯含有占重量46％的二甲基對苯二酸，占重量約為16％的1,2-丙二醇，占重量約為10％的乙二醇，約13％的二甲基硫代苯甲酸，以及約15％的磺基異鄰苯二甲酸，而分子量約為3,000。該聚酯及其制備方法的細(xì)節(jié)描述見EP 311 342。
柔順劑織物柔順劑也可包括在本發(fā)明的洗衣劑組合物中。這些劑可以是無機(jī)的也可以是有機(jī)的。無機(jī)柔順劑例如公開于GB-A-1 400898和US5,019,292中的綠土粘土。有機(jī)織物柔順劑包括GB-A1 514 276和EP 0 011340中公開的水不溶性的叔胺，以及EP-B-0 026 528中公開的其與單C12-C14季銨鹽的并用和EP 0 242 919中公開的二長鏈酰胺。其它有用的織物柔順劑系統(tǒng)的有機(jī)成分包括高分子量的聚環(huán)氧乙烷物質(zhì)，其公開于EP 0 299 575和0313146中。
綠土粘土的用量一般在5％到15％重量的范圍內(nèi)，更優(yōu)選占重量的8％到12％，該物質(zhì)作為干混合成分加到配方的剩余部分中。有機(jī)織物柔順劑例如水不溶性的叔胺或雙長鏈酰胺物質(zhì)以重量比為0.5％到5％的量摻入，一般從1％到3％，但高分子量的聚環(huán)氧乙烷物質(zhì)和水溶性的陽離子物質(zhì)物質(zhì)加入的量為重量比從0.1到2％，一般為0.15％到1.5％。這些物質(zhì)一般加到該組合物的噴霧干燥部分，雖然在有些情況下將其作為干燥混合顆粒加入可能是更方便的，或?qū)⑵渥鳛槿廴谝后w噴到該組合物的其它固體成分上。多聚染料-轉(zhuǎn)移抑制劑根據(jù)本發(fā)明的去污劑組合物也可含有從占重量比為0.001％到10％，優(yōu)選從0.01％到2％，更優(yōu)選從0.05％到1％的多聚染料-轉(zhuǎn)移抑制劑。所說的多聚染料-轉(zhuǎn)移抑制劑一般摻入到去污劑組合物中用以抑制染料從其所染的織物上轉(zhuǎn)染到一起洗滌的織物上。這些多聚物具有的能力可在染料有機(jī)會結(jié)合到洗滌中的其它衣物上之前將從染過的織物上洗滌下來的短效染料復(fù)合或吸收掉。
尤其適合的多聚染料-轉(zhuǎn)移抑制劑是聚胺N-氧化物聚合物，N-乙烯基-吡咯烷酮和N-乙烯基咪唑的共聚物，聚乙烯基吡咯烷酮多聚物，聚乙烯基噁唑烷酮聚乙烯咪唑或其混合物。
這些多聚物的加入也增強(qiáng)了本發(fā)明的酶的效果。
根據(jù)本發(fā)明的去污劑組合物可以是液體、糊狀，膠狀，條狀，或粒狀形式。
可生產(chǎn)非粉塵的顆粒，例如，US 4,106 991和4,661,452(二者均對NovoIndustri A/S)所公開并且可選地以本領(lǐng)域已知技術(shù)包被。蠟狀包被材料的實(shí)例有聚(環(huán)氧乙烷)產(chǎn)物(聚乙二醇，PEG)，平均分子量為1000到20000；具有16到50個環(huán)氧乙烷單位的乙氧化的壬基酚；其中有15到80個環(huán)氧乙烷單位的含12到20個碳原子的醇的乙氧化的脂肪醇；脂肪醇；脂肪酸；脂肪酸的單和二和三甘油酯。通過液床技術(shù)適于應(yīng)用的成膜包被材料的實(shí)例見于GB 1483591。
根據(jù)本發(fā)明的粒狀組合物也可以是“壓縮形式”，即其密度可相對高于傳統(tǒng)的粒狀去污劑，即550到950克/升；在這種情況下，根據(jù)本發(fā)明的粒狀去污劑相對于傳統(tǒng)的粒狀去污劑將含有較低量的“無機(jī)填充鹽”；典型的填充鹽為硫酸和氯化的堿土金屬鹽，典型的是硫酸鈉；“壓縮的”去污劑典型地含有不超過10％的填充鹽。本發(fā)明的液體組合物也可為濃縮形式的，在此情況下，根據(jù)本發(fā)明的液體組合物與傳統(tǒng)的液體去污劑而言將含有更低數(shù)量的水。典型地，濃縮的液體去污劑的含水量會低于去污劑重量的30％，更優(yōu)選低于20％，最優(yōu)選低于10％。
本發(fā)明的組合物可例如配成手洗或機(jī)洗的洗衣去污劑組合物，包括洗衣添加組合物和適用于染色的織物預(yù)處理的組合物。漂洗添加織物柔順組合物，以及適于一般家庭堅(jiān)硬表面清洗操作和洗碟操作的組合物。
下面的實(shí)施例意在說明本發(fā)明的組合物，但是并非意在限制或另外限定本發(fā)明的范圍。
在該去污劑組合物中，簡寫的組分具有下列意思。
LAS線性C12烷基苯磺酸鈉TAS牛脂烷基硫酸鈉XYASC1X-C1Y烷基硫酸鈉SS通式2-丁基辛酸的二級皂表面活性劑25EY與平均有Y摩爾環(huán)氧乙烷縮合的C12-C15的主要是線性的伯醇45EY與平均有Y摩爾環(huán)氧乙烷縮合的C14-C15的主要是線性的伯醇XYEZS與平均每摩爾有Z摩爾環(huán)氧乙烷縮合的C1x-C1y烷基硫酸鈉非離子的C13-C15混合的乙氧化/丙氧化的脂肪醇，其平均乙氧化程度為3.8而平均丙氧化程度為4.5，商品名為plurafax LF404，由BASF Gmbh出售CFAAC12-C14烷基N-甲基葡糖酰胺(glucamide)TFAAC16-C18烷基N-甲基葡糖胺硅酸鹽無定形的硅酸鈉(SiO2∶Na2O比率=2.0)
NaSK-6通式δ-Na2Si2O5結(jié)晶層化的硅酸鹽碳酸鹽無水碳酸鈉磷酸鹽三聚磷酸鈉MA/AA1∶4馬來酸/丙烯酸的共聚物，平均分子量約為80,000聚丙烯酸酯聚丙烯酸酯均聚物，平均分子量為8,000，由BASF Gmbn以商品名PA30出售沸石A通式Na12(AlO2SiO2)12·27H2O的水合硅鋁酸鈉，基本顆粒大小在1到10微米范圍內(nèi)檸檬酸鹽二水檸檬酸三鈉檸檬酸檸檬酸過硼酸鹽無水的單水合過硼酸鈉漂白，經(jīng)驗(yàn)式為NaBO2·H2O2PB4無水的四水合過硼酸鈉過碳酸鈉無水的過碳酸鈉漂白劑，經(jīng)驗(yàn)式為2Na2CO3·3H2O2TAED四乙酰乙二胺CMC羧甲基纖維素鈉DETPMP二亞乙基三胺五(亞甲基膦酸)，由Monsanto以商品名Dequest 2060出售PVP聚乙烯基吡咯烷酮多聚物EDDS乙二胺-N,N′-二琥珀酸，鈉鹽形式的[S,S]異構(gòu)體泡沫抑制劑25％石蠟(熔點(diǎn)50℃),17％疏水二氧化硅，58％石蠟油粒狀泡沫抑制劑12％硅氧烷/二氧化硅，18％十八烷醇，70％粒狀淀粉硫酸鹽無水硫酸鈉HMWPEO高分子量聚環(huán)氧乙烷TAE 25牛脂醇乙氧化物(25)去污劑實(shí)施例Ⅰ根據(jù)本發(fā)明的粒狀的織物清潔組合物可按下法配制線性C12烷基苯磺酸鈉 6.5硫酸鈉 15.0沸石A 26.0次氮基三乙酸鈉 5.0本發(fā)明的酶0.1PVP 0.5TAED 3.0硼酸 4.0過硼酸鹽 18.0苯酚磺酸鹽0.1次要成分 至100去污劑實(shí)施例Ⅱ根據(jù)本發(fā)明的壓縮粒狀織物清洗組合物(濃度800克/升)可如下制備45AS 8.025E3S 2.025E5 3.O25E3 3.0TFAA 2.5沸石A 17.0NaSKS-6 12.0檸檬酸3.0碳酸鹽7.0MA/AA 5.0CMC 0.4本發(fā)明的酶0.1TAED 6.0過碳酸鹽 22.0EDDS 0.3粒狀泡沫抑制劑3.5水/次要成分 至100％去污劑實(shí)施例Ⅲ尤其用于染過色的織物清洗的本發(fā)明的粒狀織物清洗組合物可如下配制LAS10.7 -TAS2.4-TFAA - 4.045AS 3.110.045E7 4.0-25E3S- 3.068E111.8-25E5 - 8.0檸檬酸鹽 15.0 7.0碳酸鹽 - 10檸檬酸 2.53.0沸石A32.1 25.0Na-SKS-6 - 9.0MA/AA5.05.0DETPMP 0.20.8本發(fā)明的酶 0.10 0.05硅酸鹽 2.5-硫酸鹽 5.23.0PVP 0.5-聚(4-乙烯基吡啶)-N-氧化物/乙烯基咪唑和乙烯- 0.2基吡咯烷酮的共聚物過硼酸鹽 1.0-苯酚磺酸鹽 0.2-水/次要成分 至100％去污劑實(shí)施例Ⅳ提供“通過洗滌柔順”的能力的本發(fā)明的粒狀織物清洗組合物可如下制備45AS- 10.0LAS 7.6 -68AS1.3 -45E74.0 -25E3- 5.0椰子-烷基-二甲基-羥基-1.4 1.0乙基氯化銨檸檬酸鹽 5.0 3.0Na-SKS-6 - 11.0沸石A 15.015.0MA/AA 4.0 4.0DETPMP0.4 0.4過硼酸鹽 15.0-過碳酸鹽 - 15.0TAED 5.0 5.0綠土粘土 10.010.0HMWPEO- 0.1本發(fā)明的酶0.100.05硅酸鹽3.0 5.0碳酸鹽10.010.0粒狀泡沫抑制劑1.0 4.0CMC 0.2 0.1水/次要成分 至100％去污劑實(shí)施例Ⅴ根據(jù)本發(fā)明的重級液體織物清洗組合物也可如下制備Ⅰ Ⅱ酸形式的LAS - 25.0檸檬酸5.02.0酸形式的25AS 8.0-酸形式的25AE2S3.0-25AE7 8.0-CFAA 5 -DETPMP1.01.0脂肪酸8 -油酸 - 1.0乙醇 4.06.0丙二醇 2.06.0本發(fā)明的酶 0.10 0.05椰子-烷基二甲基羥基- 3.0乙基氯化銨綠土粘土 - 5.0PVP2.0-水/次要成分至100％皮革工業(yè)應(yīng)用本發(fā)明的枯草酶可用于皮革工業(yè)，尤其用于皮的脫毛。
在所說的應(yīng)用中，本發(fā)明的枯草酶優(yōu)選用于進(jìn)一步包含其它蛋白酶的酶組合物。
對合適的其它蛋白酶的更具體的描述見去污劑組合物中所用的合適的酶的相關(guān)章節(jié)(上文)。羊毛工業(yè)應(yīng)用本發(fā)明的枯草酶可用于羊毛工業(yè)中，尤其是用于包括羊毛的衣物清洗上。
在所說的應(yīng)用中，本發(fā)明的枯草酶的優(yōu)選用于進(jìn)一步包括其它蛋白酶的酶組合物。
合適的其它蛋白酶的更具體的描述見去污劑組合物(上文)中的相關(guān)章節(jié)。
本發(fā)明還在下面的實(shí)施例中進(jìn)一步進(jìn)行了詳述，這些實(shí)施例不以任何方式來限制如權(quán)利要求所述的本發(fā)明的范圍。材料和方法菌株枯草芽孢桿菌DN 1885(Diderichsen等，1990)遲緩芽孢桿菌309和147是遲緩芽孢桿菌的特定株，保藏于NCIB，入藏號為NCIB 10309和10147，并于在本文中用作參考的US專利號3,723,250中有描述。
通過傳統(tǒng)方法將大腸桿菌MC 1000(M.J.Casadaban和S.N.Cohen(1980)；J.Mol.Biol 138 179-207)制備為r、m+，而這些方法也公開了美國專利申請順序號0 39,298。
質(zhì)粒PJS 3大腸桿菌-枯草芽孢桿菌穿梭載體，含有編碼枯草酶309的合成基因。(Jacob Schiφdt等描述，蛋白質(zhì)和肽通信3:39-44(1996))。
PSX222枯草芽孢桿菌表達(dá)載體(WO 96/34946描述)。常規(guī)分子生物學(xué)方法除非另有提及，DNA操作和轉(zhuǎn)化用常規(guī)的分子生物學(xué)方法(Sambrook等(1989)分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，冷泉港，NY；Ausubll,F.M.等(編者)“現(xiàn)代分子生物學(xué)方法”。John wiley & Sons,1995；Harwood,C.R.和Cutting,S.M.(編者)“芽孢桿菌的分子生物學(xué)方法”John Wiley &Sons,1990)。DNA操作中的酶的使用根據(jù)供應(yīng)商的說明書。
DNA操作中的酶除非另有說明，DNA操作中的所有酶，例如限制性內(nèi)切酶、連接酶等得自New England Biolabs公司。
蛋白酶解活性在本發(fā)明的上下文中，蛋白水解活性以Kilo Novo蛋白酶單位(KNPV)表達(dá)。該活性以相對于酶標(biāo)準(zhǔn)品(SAVINASEO)來測定，并且這種測定是根據(jù)二甲基酪蛋白(DMC)溶液在標(biāo)準(zhǔn)條件下通過蛋白酶的消化而來的，標(biāo)準(zhǔn)條件即50℃,pH8.3,9分鐘反應(yīng)時間，3分鐘測定時間。一個小冊子AF 220/1可按要求得自于Novo Nordisk A/S，丹麥，該小冊子在此處用作參考。
GU即甘氨酸單位，其定義為在標(biāo)準(zhǔn)條件下，在40℃下與作為底物的N-乙酰酪蛋白一起溫育15分鐘，產(chǎn)生了相當(dāng)于1毫摩爾甘氨酸的NH2基團(tuán)的量的蛋白酶活性。
酶活性也可用PNA試驗(yàn)來測定，其根據(jù)與可溶性的底物琥珀酰-丙氨酸-丙氨酸-脯氨酸-苯基-丙氨酸-對硝基苯酚的反應(yīng)，描述于Journalof American Oil Chemists Society,Rothgeb,T.M.,Goodlander,B.D.,Garrison,P.H.以及Smith,L.A.(1988)。
發(fā)酵枯草酶的發(fā)酵在30℃下在一個旋轉(zhuǎn)搖動臺(300r.p.m.)上在含100毫升BPX培養(yǎng)基的500毫升帶有障板的Erlenmeyer燒瓶中進(jìn)行5天。因此為了制備例如2升肉湯，將20個Erlenmeyer燒瓶進(jìn)行同時發(fā)酵。
培養(yǎng)基
BPX配方(每升)馬鈴薯淀粉100克磨過的大麥50克豆粉 20克Na2HPO4×12H2O 9克Pluronic 0.1克酪蛋白酸鈉10克培養(yǎng)基中的淀粉用α-淀粉酶液化，培養(yǎng)基在120℃加熱到45分鐘滅菌。滅菌后，培養(yǎng)基中加入NaHCO3到0.1M將pH調(diào)到9。實(shí)施例實(shí)施例1酶變體的構(gòu)建和表達(dá)定點(diǎn)誘變通過“單一位點(diǎn)去除(USE)”或“尿嘧啶-USE”技術(shù)來制備枯草酶309定點(diǎn)誘變的變體，這兩種技術(shù)分別描述于Deng等(Anal.Biochem 200:81-88(1992))及Markvardsen等(BioTechniques 18(3):371-372(1995))。
模板質(zhì)粒為PJS3，或者其含有枯草酶309的變體的類似物，例如在含有帶有目的在于導(dǎo)致最終的Y167A+R170L枯草酶309變體構(gòu)建體R170L變體的寡核苷酸的編碼Y167A變體的基因的PJS3類似物上進(jìn)行USE誘變。
該在PJS3中構(gòu)建的枯草酶309變體然后被亞克隆到枯草芽孢桿菌PSX222表達(dá)載體，所用的酶是限制酶KpnⅠ和MluⅠ。
局部的隨機(jī)誘變用于進(jìn)行局部隨機(jī)誘變的總體策略為合成相應(yīng)于除了相應(yīng)于要被誘變的氨基酸密碼外的待誘變的DNA序列部分的誘變引物(寡核苷酸)。
隨后，在PCR反應(yīng)中將所得的突變引物與合適的相反引物一起使用。純化和消化所得的PCR片段并克隆到大腸桿菌-枯草芽孢桿菌穿梭載體中。
可替換地，如果有必要，可將所得的PCR片段在第二次PCR反應(yīng)中用作引物，并同時使用第二個合適的相反引物，以將突變的區(qū)域消化并克隆到穿梭載體中。該P(yáng)CR反應(yīng)在常規(guī)條件下進(jìn)行。
根據(jù)這種策略，在SAVINASE中構(gòu)建于局部隨機(jī)文庫，其中Y167和R170都是完全隨機(jī)的。
在要被突變的氨基酸密碼子上第一和第二位堿基上用四種堿基(N)每各占25％合成一個寡核苷酸。密碼子中第三核苷酸(擺動堿基)以50％G/50％C(S)合成以避免三個終止密碼子中的兩個(TAA TGA)。
在一個PCR反應(yīng)中，使用突變引物(5′-GTT TGG ATC AGT AGC TCCGAC TGC CAT TGC GTT CGC ATA SNN CGC CGG SNN GCT GAT TGAGCC-3′(反義))，和合適的相反引物(例如5′GAA CTC GAT CCA GCG ATTTC′(有義))，并使用質(zhì)粒PJS 3為模板。利用限制酶Asp 718和BclⅠ將所得產(chǎn)物克隆到PJS 3穿梭載體中。
然后將在PJS 3中構(gòu)建的局部隨機(jī)文庫亞克隆到枯草芽孢桿菌pSX 222表達(dá)質(zhì)核中，所用的限制酶為KpnⅠ和MluⅠ。
所制備的文庫含約100,000個單獨(dú)克隆/文庫。
十個隨機(jī)選出的克隆被進(jìn)行測序以確證所設(shè)計(jì)的突變。
為了純化本發(fā)明的枯草酶變體，將含本發(fā)明的變體的枯草芽孢桿菌PSX 222表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到一個感受態(tài)枯草芽孢桿菌株中，并如上述在含10μg/ml氯霉素(CAM)的培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵。實(shí)施例2酶變體純化本法涉及純化2升量的枯草蛋白酶147酶、枯草蛋白酶309酶或其變體的發(fā)酵。
將約1.6升的發(fā)酵肉湯在1升的燒杯中在5000rpm下離心35分。上清用10％乙酸調(diào)至pH6.5，并在Seitz Supra S100濾板上進(jìn)行過濾。
用裝備有Amicon S1Y10 UF柱的Amicon CH2A UF裝置將濾液濃縮至約400毫升。將UF濃縮物離心并過濾，然后于室溫下在Bacitracin親和柱上在pH7下吸收。用調(diào)至pH7的含0.01二甲基戊二酸，0.1M硼酸和0.002M氯化鈣的緩沖溶液中的25％2-丙醇和1M氯化鈉于室溫下將蛋白酶從Bacitracin柱上洗脫下來。
將源于Bacitracin純化步驟的具蛋白酶活性的餾分合并并上到用調(diào)到pH6.5的含0.01二甲基戊二酸、0.2M硼酸和0.02M氯化鈣的緩沖液平衡的750ml Sephadex G25柱(5cm直徑)上。
來自于Sephadex G25柱上的具蛋白酶解活性的餾分合并并上到用調(diào)到pH6.5的含0.01M二甲基戊二酸、0.2M硼酸，以及0.002M氯化鈣的緩沖液平衡的150ml CM Sepharose CL6B陽離子交換柱(5cm直徑)上。
蛋白酶的洗脫使用在2升相同緩沖液(0～0.2M氯化鈉，對枯草蛋白酶147而言)中線性梯度的0～0.1M氯化鈉。
在最后的純化步驟中，將含有蛋白酶的從CM Sepharose柱上下來的餾分合并并在配有GR 81PP膜(來自Danish Sugar Factories公司)的Amicon超濾室中濃縮。
用實(shí)施例1中的技術(shù)進(jìn)行構(gòu)建及上述的分離方法，生產(chǎn)并分離了下面的枯草蛋白酶309變體。
Y167A+R170SY167A+R170LY167A+R170NY167PY167P+R170LY167V+R170TY167I+R170TY167V+R170QY167S+R170QY167T+R170NY167A+R170AY167TY167T+R170AY167P+R170SY167I+R170LY167F+R170TY167F+R170EY167F+R170HY167F+R170TY167F+R170L
Y167LR170HY167S實(shí)施例3含酶變體的去污劑組合物的洗滌效果下面的實(shí)施例提供了在所指定的條件下進(jìn)行的一些洗滌測試所得的結(jié)果。實(shí)驗(yàn)條件表Ⅳ評價枯草蛋白酶309變體的實(shí)驗(yàn)條件

隨后在水龍頭水下沖洗滌滌的衣物并進(jìn)行空氣干燥。
上述的類型去污劑是一種簡單的去污劑配方。其最典型的特征是將STP用作助洗劑并且陰離子表面活性劑(LAS)含量是相當(dāng)高的。而且pH被調(diào)至10.4，其位于粉末去污劑的正常范圍內(nèi)。
表Ⅴ該型洗滌劑的成分如下25％ STP(Na5P3O10)10％ 沸石(Wessalith P)10％ Na2SO4
10％ Na2CO325％ LAS(Nansa 80S)5％ NI(Dobanol 25-7)5％ Na2S2O50.5％ 羧甲基纖維素(CMC)9.5％ 水通過在去離子水中加入CaCl2和MgCl2來調(diào)節(jié)水的硬度。通過加入酸來將去污劑溶液的pH調(diào)到所需的值。
用Elrepho 2000光度計(jì)(無UV)于460nm測定試驗(yàn)物質(zhì)的反射率(R)?？讖?0mM在XnM的洗滌效果可計(jì)數(shù)為Px=RX-RORX,ref-RO]]>Rx:XnM酶的洗滌效果(以反射率單位表示)Ro:0nM酶的洗滌效果(空白值)表Ⅵ:SAVINASE_的變體和改進(jìn)因子

如同從表Ⅵ中可看出一樣，本發(fā)明的SAVINASE_變體表現(xiàn)出改進(jìn)的洗滌效果。
在一個相似的洗滌測試中，下面的SAVINASE_變體表現(xiàn)出了在變體Y167I+R170L和Y167A+R170S之間的洗滌效果值Y167PY167P+R170LY167V+R170TY167I+R170TY167V+R170Q
Y167S+R170QY167T+R170NY167A+R170AY167T+R170LY167T+R170AY167P+R170S實(shí)施例4含有酶變體的去污劑組合物的洗滌效果下面的實(shí)施例提供了來自于在指定條件下進(jìn)行的洗滌測試的結(jié)果。
實(shí)驗(yàn)條件表Ⅶ評價枯草蛋白酶309變體的實(shí)驗(yàn)條件

所用的去污劑為一簡單型配方。去污劑的pH調(diào)到10.5，其位于粉末去污劑的正常范圍內(nèi)。該型去污劑95的組成如下25％ STP(Na5P3O10)25％ Na2SO410％ Na2CO320％ LAS(Nansa 80S)5.0％ 非離子表面活性劑(Dobanol 25-7)5.0％ Na2Si2O50.5％ 羧甲基纖維素(CMC)9.5％ 水通過在去離子水中添加CaCl2和MgCl2(Ca2+∶Mg2+=2∶1)來調(diào)節(jié)水硬度(亦參見消費(fèi)品中的表面活性劑-理論，技術(shù)和應(yīng)用，Springr Verlag 1986)。通過添加HCl將去污劑溶液的pH調(diào)節(jié)至10.5。
用Macbeth ColorEye 7000光度計(jì)(Macbeth,Kollmorgen儀器公司分部，德國)在460nm下測定待測物質(zhì)的反射率(R)。根據(jù)產(chǎn)商方法進(jìn)行測定。
通過計(jì)算效果因子來評價枯草蛋白酶309變體的洗滌效果

P效果因子R變體以變體洗滌的待測物質(zhì)的反射率Rsavinase以Savinase_洗滌的待測物質(zhì)的反射率R空白沒有用酶洗滌的待測物質(zhì)的反射率與Savinase_相比，所要求的全部枯草蛋白酶均提高了洗滌效果，即P＞1。
將變體的改良進(jìn)行分級，并以大寫字母命名A級1＜P≤1.5B級1.5＜P≤2C組P＞2
表Ⅷ枯草蛋白酶309變體及改良級別

實(shí)施例5對結(jié)合有在第129、131、133和/或194位上的進(jìn)一步修飾的作為本發(fā)明主要方面的變體的對比性發(fā)酵實(shí)驗(yàn)將Savinase_變體Y167I+R170L+A194P在發(fā)酵中與無A194P取代的變體Y167I+R170L的對比。
將兩個變體都克隆到PSX 222表達(dá)載體背景中，并如上述在含10μg/mlCAM的100ml BPX培養(yǎng)基中發(fā)酵。
發(fā)酵5天后，將1.5ml的BPX發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行離心，并如上述將上清液用于測定蛋白酶解活性(KPNU)。
含Y167I+R170L+A194P變體的發(fā)酵培養(yǎng)基較之于含Y167I+R170L變體的發(fā)酵培養(yǎng)基具有更高的蛋白酶解活性。
兩種變體均具有相同的特異性活性。
用變體Y167A+R170S+A194P,Y167A+R170L+A194B以及Y167A+R170N+A194P與其相應(yīng)的無A194P突變的變體進(jìn)行比較都得到了類似的結(jié)果。
進(jìn)一步用變體A133P+Y167A+R120S、A133D+Y16AA+R170S,R129K+Y167A+R170S以及P131H+Y167A+R170S與其相應(yīng)的無A133P、A133D、P129K及P131H突變的變體相比也得到了類似的結(jié)果。
權(quán)利要求
1．在去污劑中具改良的洗滌效果的枯草酶變體，包括同在167和170位上具有修飾(以BASBPN編號)。
2．在去污劑中具改良的洗滌效果的枯草酶變體，包括選自下列的至少一個修飾(以BASBPN編號)。167{G,A,S，或T}+170{G,A,S，或T}167{G,A,S，或T}+170{L,I，或V}167{G,A,S，或T}+170{Q，或N}167P167P+170{L,I，或V}167{L,I，或V}+170{G,A,S，或T}167{L,I，或V}+170{Q，或N}167P+170{G,A,S，或T}167{L,I，或V}+170{L,I，或V}167{F,W或Y}+170{G,A,S，或T}167{F,W或Y}+170{E，或D}167{F,W或Y}+170{R,K，或H}167{F,W或Y}+170{L,I，或V}167{L,I，或V}170H167{G,A,S，或T}
3．根據(jù)權(quán)利要求2的枯草酶酶變體，其中的修飾選自下列組中(以BASBPN編號)167A+170S,167A+170L,167A+170N167P167P+170L167V+170T167I+170T167V+170Q167S+170Q167T+170N167A+170A167T+170L167T+170A167P+170S167I+170L167F+170T167F+170E167F+170H167F+170T167F+170L167L170H167S。
4．根據(jù)權(quán)利要求2的枯草酶酶變體，其中的修飾選自下列組中(以BASBPN編號)Y167{G,A,S，或T}+R170{G,A,S，或T}Y167{G,A,S，或T}+R170{L,I，或V}Y167{G,A,S，或T}+R170{Q，或N}Y167PY167P+R170{L,I，或V}Y167{L,I，或V}+R170{G,A,S，或T}Y167{L,I，或V}+R170{Q，或N}Y167P+R170{G,A,S，或T}Y167{L,I，或V}+R170{L,I，或V}Y167{F,W，或Y}+R170{G,A，S，或T}Y167{F,W，或Y}+R170{E，或D}Y167{F,W，或Y}+R170{R,K，或H}Y167{F,W，或Y}+R170{L,I，或V}Y167{L,I，或V}R170HY167{G,A,S，或T}
5．根據(jù)權(quán)利要求4的枯草酶酶變體，其中的修飾選自下列組(以BASBPN編號)Y167A+R170SY167A+R170LY167A+R170NY167PY167P+R170LY167V+R170TY167I+R170TY167V+R170QY167S+R170QY167T+R170NY167A+R170AY167TY167T+R170AY167P+R170SY167I+R170LY167F+R170TY167F+R170EY167F+R170HY167F+R170TY167F+R170LY167LR170HY167S。
6．權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)的變體，其中的親本枯草酶選自I-S1亞群。
7．權(quán)利要求6的變體，其中親本枯草酶選自ABSS 168、BASBPN、BSSDY和BLSCAR或其保留了I-S1亞群的特征的功能性變體。
8．權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)的變體，其中的親本枯草酶選自I-S2亞群。
9．權(quán)利要求8的變體，其中親本枯草酶選自BLS 147、BLS 309、BAPB 92、TVTHER和BYSYAB或保留了I-S2亞群的特征的功能性變體。
10．上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的變體，其中所說的修飾結(jié)合了一個或多個任何其它位置上的修飾。
11．權(quán)利要求10的變體，其中所說的修飾結(jié)合了27、36、57、76、87、97、101、104、120、123、206、218、222、224、235和274位中的一個或多個位置上修飾。
12．權(quán)利要求11的變體，其中所說的枯草酶屬于I-S2亞群并且所說的進(jìn)一步的改變選自K27R、*36D、S57P、N76D、S87N、G97N、S101G、V104A、V104N、V104Y、H120D、N123S、Q206E、N218S、M222S、M222A、T224S、K235L和T274A。
13．權(quán)利要求11的變體，包括S101G+V104N,S87N+S101G+V104N,K27R+V104Y+N123S+T274A，或N76D+V104A的任何變體，或者這些突變(V104N,S101G,K27R,V104Y,N123S,T274A,N76D,V104A)的其它組合的變體，并帶有權(quán)利要求1到12中任一項(xiàng)所提到的任何一個或多個取代、缺失和/或插入。
14．前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的枯草酶變體，其中所說的修飾與第129、131、133和194位上的一個或多個修飾相結(jié)合。
15．權(quán)利要求14的變體，其中所說的枯草酶屬于I-S2亞群而且所說的進(jìn)一步修飾選自P129K、R131H、A133P、A133D和A194P。
16．根據(jù)權(quán)利要求15的變體，其中所說的修飾選自Y167A+R170S+A194PY167A+R170L+A194PY167A+R170N+A194PY167A+R170S+P129KY167A+R170L+P129KY167A+R170N+P129KY167A+R170S+P131HY167A+R170L+P131HY167A+R170N+P131HY167A+R170S+A133PY167A+R170L+A133PY167A+R170N+A133PY167A+R170S+A133DY167A+R170L+A133DY167A+R170N+A133D
17．編碼權(quán)利要求1到16中任一項(xiàng)的枯草酶變體的分離的DNA序列。
18．含有權(quán)利要求17的分離的DNA序列的表達(dá)載體。
19．以權(quán)利要求18的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的微生物宿主細(xì)胞。
20．權(quán)利要求19的微生物宿主，其為細(xì)菌，優(yōu)選芽孢桿菌，尤其是遲緩芽孢桿菌。
21．權(quán)利要求19的微生物宿主，其為真菌或酵母，優(yōu)選為絲狀真菌，尤其是曲霉屬。
22．產(chǎn)生權(quán)利要求1到16中任一項(xiàng)的變體的方法，其中將權(quán)利要求19到21中任一項(xiàng)的宿主在有助于所說變體表達(dá)和分泌的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，并回收該變體。
23．含有根據(jù)權(quán)利要求1到16中任一項(xiàng)的枯草酶變體的組合物。
24．根據(jù)權(quán)利要求23的組合物，其另外含有纖維素、脂酶、角質(zhì)酶、氧化還原酶、其它蛋白酶，或淀粉酶。
25．根據(jù)權(quán)利要求23或24的組合物，其中的組合物是去污劑組合物。
26．根據(jù)權(quán)利要求1到16中任一項(xiàng)的枯草酶變體或者根據(jù)權(quán)利要求23到25中任一項(xiàng)的酶組合物在洗衣和/或洗碟去污劑中的用途。
27．鑒別在去污劑中表現(xiàn)出改良的洗滌效果的蛋白酶變體的方法，其包括在編號枯草酶或其前蛋白酶或前蛋白酶原的DNA中于相應(yīng)于下列氨基酸(以BASBPN編號)的一個或多個位置上產(chǎn)生突變Y167A+R170SY167A+R170LY167A+R170NY167PY167P+R170LY167V+R170TY167I+R170TY167V+R170QY167S+R170QY167T+R170NY167A+R170AY167TY167T+R170AY167P+R170SY167I+R170LY167F+R170TY167F+R170EY167F+R170HY167F+R170TY167F+R170LY167LR170HY167S；或包括在上述任何變體中的一個或多個保守性修飾的變體；用所說的突變DNA轉(zhuǎn)化芽孢桿菌菌株；產(chǎn)生這種蛋白酶變體的菌株選擇發(fā)酵或培養(yǎng)這種菌株；回收所說的蛋白酶變體，以及測試在去污劑中的改良的洗滌效果。
全文摘要
提供了在第167和170位上對一些枯草酶基因進(jìn)行突變及在合適宿主中表達(dá)該突變基因所產(chǎn)生的酶。與其野生型親本酶相比,這些酶在任何去污劑中均表現(xiàn)出改良的洗滌效果。
文檔編號C12R1/07GK1235638SQ9719943
公開日1999年11月17日 申請日期1997年10月31日 優(yōu)先權(quán)日1996年11月4日
發(fā)明者彼得·K·漢森, 克勞斯·馮德奧斯藤, 彼得·鮑蒂茨 申請人:諾沃諾爾蒂斯克公司 被以下專利引用 (2),