專利名稱：利用芽孢桿菌進(jìn)行纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(cbd)的細(xì)胞外表達(dá)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種能表達(dá)纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域多肽的轉(zhuǎn)化芽孢桿菌宿主，一種芽孢桿菌表達(dá)載體，以及在芽孢桿菌宿主細(xì)胞內(nèi)生產(chǎn)纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的方法。
背景技術(shù)：
對(duì)CBD作為一種功能性結(jié)構(gòu)域的研究涉及到以單一結(jié)構(gòu)域分子合成該結(jié)構(gòu)域。最早的純CBD之一是通過自動(dòng)固相合成法合成的(KraulisP.等(1989))。
已示CBD能以功能性的單一結(jié)構(gòu)域形式在大腸桿菌中表達(dá)，參見例如Ong E.等(1993)，其中公布，采用大腸桿菌進(jìn)行的表達(dá)在細(xì)胞外圍胞質(zhì)中每升培養(yǎng)液的CBD產(chǎn)量為33mg。
最近，在大腸桿菌中也成功地表達(dá)了真菌CBD二體(二聚體)，見Linder M.等(1996)。
然而，CBD在大腸桿菌內(nèi)的表達(dá)并不是真正的細(xì)胞外表達(dá)，并且產(chǎn)量也不盡如人意，對(duì)于CBD的工業(yè)水平生產(chǎn)來說該產(chǎn)量有些太低。
US5525195,US5536655,WO 91/17244和WO 91/10732公開了具有可操作地連接了纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的催化活性結(jié)構(gòu)域的內(nèi)切葡聚糖酶在芽孢桿菌宿主細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)。
據(jù)此，本發(fā)明的目的是提供一種以高產(chǎn)率生產(chǎn)CBD的方法，該方法優(yōu)選采用涉及CBD的細(xì)胞外生產(chǎn)的常規(guī)發(fā)酵技術(shù)，這樣使得CBD在工業(yè)上的應(yīng)用更為經(jīng)濟(jì)可行。
發(fā)明概述本發(fā)明人現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)可通過在芽孢桿菌宿主中表達(dá)而生產(chǎn)纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CBD)。
在本發(fā)明之前，在芽孢桿菌中表達(dá)CBD是非常不如人意的，因?yàn)?，首先，已知纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域含有二硫橋，其次，纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域?qū)τ裳挎邨U菌宿主產(chǎn)生的蛋白酶的降解可能比較敏感。
據(jù)此，本發(fā)明的第一個(gè)方面涉及轉(zhuǎn)化了包含編碼纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域之DNA序列的載體、并且能夠表達(dá)該DNA序列的芽孢桿菌宿主。
在第二方面，本發(fā)明涉及一種芽孢桿菌表達(dá)載體，所述載體攜帶有編碼纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的一段插入的DNA序列。
另外，在第三方面，本發(fā)明涉及在芽孢桿菌宿主細(xì)胞內(nèi)生產(chǎn)纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域多肽的方法，該方法包括以下步驟--在營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中，可以過量生產(chǎn)纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的條件下，培養(yǎng)芽孢桿菌宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞已轉(zhuǎn)化了包含可操作性地連接在一起的以下諸成分的表達(dá)盒a)轉(zhuǎn)錄和翻譯起始調(diào)控區(qū)，b)編碼纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域多肽的DNA序列c)轉(zhuǎn)錄和翻譯終止調(diào)控區(qū)，其中所述調(diào)控區(qū)在該宿主中具有功能，和d)用于選擇已轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的選擇標(biāo)記基因；和--回收纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域多肽。發(fā)明詳述纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CBD)是一種可結(jié)合纖維素和幾丁質(zhì)的水不溶性形式(包括晶態(tài)形式)或與它們有高親合力的多肽。
已發(fā)現(xiàn)CBD是由2個(gè)或多個(gè)不同多肽結(jié)構(gòu)域組成的大蛋白質(zhì)復(fù)合物的整合部分，例如存在于水解酶中，所述水解酶通常包含一個(gè)含有用于底物水解的活性位點(diǎn)的催化結(jié)構(gòu)域和一個(gè)用于與不溶性基質(zhì)結(jié)合的糖類結(jié)合結(jié)構(gòu)域或纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CBD)。這樣的酶可以包含一個(gè)以上的催化結(jié)構(gòu)域和一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)CBD，還可選擇性地包含一個(gè)或多個(gè)將CBD與所述催化結(jié)構(gòu)域連接起來的多肽區(qū)，后一類型的區(qū)域通常被稱為“接頭”。包含CBD的水解酶的例子有纖維素酶，木聚糖酶，甘露聚糖酶，阿拉伯呋喃糖苷酶，乙酰酯酶和幾丁質(zhì)酶。也已經(jīng)在藻類中，例如在紅藻Porphyra purpurea中發(fā)現(xiàn)了非水解性多糖結(jié)合蛋白形式的CBD(參見Peter Tomme等人(1996))。但是，大多數(shù)已知的CBD來源于纖維素酶和木聚糖酶。
在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域”與Tomme等人(出處同前)中的含義相同。其中將120種以上的纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域劃分為10個(gè)家族(Ⅰ-Ⅹ)，它們可能在底物結(jié)合機(jī)理方面具有不同的功能或作用。然而，在進(jìn)行本發(fā)明的工作中，已發(fā)現(xiàn)了一種迄今為止尚無人知曉的CBD家族，參見下述的實(shí)施例8；估計(jì)在將來還會(huì)出現(xiàn)新的家族代表和其它CBD家族。
在蛋白質(zhì)復(fù)合物(通常是水解酶)中，CBD位于N或C末端或位于內(nèi)部。
CBD單體通常由約30個(gè)以上且約250個(gè)以下的氨基酸殘基組成。例如，歸類為家族Ⅰ的CBD由33-37個(gè)氨基酸殘基組成，歸類為家族Ⅱa的CBD由95-108個(gè)氨基酸殘基組成，歸類為家族Ⅵ的CBD由85-92個(gè)氨基酸殘基組成。因此，CBD單體的分子量通常約4kD-40kD，并且通常低于約35kD。
CBD可作為單一結(jié)構(gòu)域多肽使用，或作為二聚體、三聚體或多聚體使用，或作為蛋白質(zhì)雜合體的一部分使用。嵌合蛋白雜合體嵌合蛋白雜合體在現(xiàn)有技術(shù)中是已知的，參見例如WO 90/00609，WO 94/24158和WO 95/16782，其包含源于其他來源的纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CBD)，優(yōu)選是源于其他微生物來源的纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CBD)，而不是源于其中CBD以蛋白質(zhì)整合部分存在的嵌合蛋白質(zhì)。通常，嵌合蛋白雜合體是酶雜合體，即含有催化結(jié)構(gòu)域和所述結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
嵌合蛋白質(zhì)雜合體和酶雜合體可通過轉(zhuǎn)化一種DNA構(gòu)建體至宿主細(xì)胞中并培養(yǎng)宿主細(xì)胞以表達(dá)融合基因而得以制備，其中所述DNA構(gòu)建體包含編碼纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CBD)的至少一個(gè)DNA片段，該DNA片段通過或不通過接頭而與編碼所述蛋白質(zhì)或酶的DNA序列相連接。重組融合蛋白或酶雜合體可用下式描述CBD-MR-X其中，CBD是對(duì)應(yīng)于至少是纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列的N-末端或C-末端區(qū)；MR是中間區(qū)(接頭)，它可以是一個(gè)鍵、或優(yōu)選具有2至100個(gè)碳原子、更優(yōu)選具有2至40個(gè)碳原子的短連接基團(tuán)，或者優(yōu)選是具有約2-100個(gè)氨基酸、更優(yōu)選具有2至40個(gè)氨基酸；X是由編碼該蛋白質(zhì)或酶的DNA序列所編碼的多肽的N末端或C末端區(qū)。
然而，也包括具有內(nèi)部CBD的重組融合蛋白或酶雜合體。
編碼源自給定生物體的CBD的DNA序列通?？刹捎肞CR技術(shù)獲得，并且，基于現(xiàn)有知識(shí)，也可以從其他生物體找到同源序列。
估計(jì)通過克隆纖維素酶、木聚糖酶或其他植物細(xì)胞壁降解酶并測(cè)量它們對(duì)纖維素的結(jié)合，可發(fā)現(xiàn)新的CBD。如果酶活性在以下所述的標(biāo)準(zhǔn)條件下與Avicel結(jié)合，那么可推定該基因的一部分編碼結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
獲得編碼CBD的DNA片段后，將該DNA基因插入于適合在芽孢桿菌內(nèi)進(jìn)行表達(dá)的載體中。
例如，纖維素親合性可采用在500ml緩沖的漿液(緩沖液0.1磷酸鈉，pH7.5)中的10g Avicel進(jìn)行測(cè)量，所述漿液用一小勺緩慢攪拌并且在室溫下放30分鐘讓其溶脹。然后以1份纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域比150份Avicel的比例加入酶。在冰上進(jìn)行操作，這樣在5至10分鐘內(nèi)可達(dá)到最佳結(jié)合。然后可洗滌Avicel，并對(duì)其直接進(jìn)行SDS-PAGE以觀察已結(jié)合的蛋白質(zhì)(由于使用了SDS并進(jìn)行了熱煮，這樣會(huì)將已結(jié)合的蛋白質(zhì)釋放下來)。另一種方法是將漿液裝入柱內(nèi)并洗滌。用離子化水或高pH緩沖液如三乙胺(pH11.2,1％溶液)洗脫已結(jié)合的蛋白質(zhì)，經(jīng)pH洗脫下來的蛋白質(zhì)立即調(diào)節(jié)到中性。
在大腸桿菌中已表達(dá)了一些CBD。然而，尚無從芽孢桿菌中表達(dá)并分泌CBD的報(bào)道。大腸桿菌作為異源蛋白質(zhì)的表達(dá)宿主相比于芽孢桿菌來說有一些優(yōu)點(diǎn)，主要是由于大腸桿菌有壁膜間隙，異源表達(dá)的基因產(chǎn)物有可能在其中進(jìn)行正確折疊(綜述見例如Hockney,R.C.(1994))。特別是，當(dāng)表達(dá)功能性依靠正確排列的雙硫橋時(shí)，就需要在外圍胞質(zhì)中有氧化電位且存在二硫鍵氧化還原酶(Emmanuel Brun等，1995)。歐洲生化雜志，231,142-148，和Ong等(1993)中公開了Erwiniachrysanthemi分泌的內(nèi)切葡聚糖酶EGZ的纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的過量表達(dá)、純化和鑒定。有二硫鍵的CBD的其它例子有熒光假單胞菌纖維素亞種(NCIMB 10462)CelB的N-末端CBD[見Tomme P.等(出處同前)中的序列對(duì)比]，以及糞肥纖維單胞菌(ATCC 484)CenA的N末端CBD(N.R.Gilkes等，1991)。
此外，大腸桿菌的外圍胞質(zhì)也起著保護(hù)異源表達(dá)的蛋白質(zhì)免受上清以及胞漿中存在的蛋白酶的作用。
也已知，當(dāng)在枯草芽孢桿菌中表達(dá)含有二硫橋的分泌蛋白時(shí)，表達(dá)水平顯著下降(Van den Berg等(1993))。
異源表達(dá)的另一個(gè)問題是已表達(dá)蛋白質(zhì)的蛋白水解降解作用。已知枯草芽孢桿菌表達(dá)至少7種不同的胞外蛋白酶(A.L.Sonenshein等編(1993))。
特別是對(duì)于CBD這樣一種高度疏水的蛋白質(zhì)，當(dāng)在枯草芽孢桿菌中表達(dá)時(shí)，該蛋白質(zhì)的運(yùn)輸可能嚴(yán)重受阻，而若該蛋白質(zhì)由于其疏水性而錨定于細(xì)胞膜上，將會(huì)因其有害效果而甚至引起細(xì)胞死亡。
在第一方面，本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)化了包含編碼CBD之DNA序列的載體、并且能表達(dá)該序列的芽孢桿菌宿主。顯而易見，所表達(dá)的多肽基本上由一個(gè)或多個(gè)非催化性的結(jié)構(gòu)域組成，即該多肽不包含任何催化活性結(jié)構(gòu)域。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所表達(dá)的CBD或含CBD之多肽的分子量等于或高于約4kD。優(yōu)選地，其分子量等于或低于35kD，較優(yōu)選地約32kD，甚至更優(yōu)選地約30kD，尤其是約25kD。
可以單一結(jié)構(gòu)域多肽(即包含一個(gè)CBD的多肽)的形式表達(dá)CBD?；蛘?，可以二聚體或三聚體甚或多聚體形式(即包含兩個(gè)、三個(gè)甚或三個(gè)以上相同CBD“單元”的多肽或蛋白質(zhì)形式)表達(dá)CBD。
也可以作為多結(jié)構(gòu)域多肽的一部分而表達(dá)CBD，這種多肽的非CBD部分可以是例如一個(gè)、兩個(gè)、甚或多個(gè)沒有催化活性的結(jié)構(gòu)域。部分可以是例如一個(gè)、兩個(gè)、甚或多個(gè)沒有催化活性的結(jié)構(gòu)域。
可以相信，按照本發(fā)明，即通過已轉(zhuǎn)化的芽孢桿菌宿主的途徑，幾乎可以表達(dá)任何一種CBD。優(yōu)選地，可表達(dá)的CBD是可得自微生物或植物的CBD，更優(yōu)選是可得自細(xì)菌或真菌的CBD。
來自細(xì)菌的CBD的實(shí)例包括可從下列各屬之一的種內(nèi)得到的CBD丁酸弧菌屬、纖維單胞菌屬、梭菌屬、小雙孢菌屬、小單孢菌屬、假單胞菌屬、鏈霉菌屬、高溫單孢菌屬、芽孢桿菌屬、Caldocellum、歐文氏菌屬、粘球菌屬、纖維弧菌屬、熱厭氧桿菌屬和棲熱袍菌屬。
源自真菌的CBD的實(shí)例包括可從下列各屬之一的種內(nèi)獲得的CBD蘑茹屬、網(wǎng)柄菌屬、鐮孢屬、腐質(zhì)霉屬、Neocallimastix，脈孢菌屬，Limulus，青霉屬，Phanerochaete和木霉屬。
可得自植物的CBD的實(shí)例是來自蘋果青霉素的CBD。
本發(fā)明的芽孢桿菌宿主是嗜中性的、嗜堿性的、嗜中溫的或嗜熱的宿主。
本發(fā)明中有用的宿主的實(shí)例是來自枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌的宿主。然而，估計(jì)其他芽孢桿菌種類也可以用作表達(dá)CBD的宿主。
如下詳述，用包含編碼CBD之DNA序列的載體轉(zhuǎn)化本發(fā)明的宿主。優(yōu)選地，所述載體整合到了宿主的基因組中，更優(yōu)選地，其在基因組中已得到了擴(kuò)增。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選實(shí)施方案中，所述載體為表達(dá)質(zhì)粒，優(yōu)選地為多挎貝質(zhì)粒。
在第二方面，本發(fā)明涉及帶有插入的編碼CBD之DNA序列的一種芽孢桿菌表達(dá)載體。優(yōu)選地，該載體的表達(dá)盒包含來自芽孢桿菌的調(diào)控區(qū)，更優(yōu)選地，這類調(diào)控區(qū)是該宿主的內(nèi)源區(qū)域。
在第三方面，本發(fā)明涉及生產(chǎn)CBD多肽的方法，該方法包括以下步驟--在營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中，過量表達(dá)纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的條件下，培養(yǎng)芽孢桿菌宿主細(xì)胞，所述細(xì)胞已用包含以下可操作性地連接在一起的諸成分a)轉(zhuǎn)錄和翻譯起始調(diào)控區(qū)，b)編碼纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的DNA序列，c)轉(zhuǎn)錄和翻譯終止調(diào)控區(qū)，其中該調(diào)控區(qū)在宿主中是有功能的，和d)用于選擇已轉(zhuǎn)化的宿主的選擇標(biāo)記基因；并且--回收纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域多肽。
在第四方面，本發(fā)明涉及優(yōu)化CBD在芽孢桿菌宿主中的表達(dá)的一種方法，該方法包括在宿主中表達(dá)與報(bào)道分子融合的CBD的諸步驟；以及通過測(cè)量報(bào)道分子的內(nèi)在性質(zhì)而監(jiān)測(cè)發(fā)酵宿主的上清中已表達(dá)的CBD的濃度。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述報(bào)道分子是綠色熒光蛋白，其內(nèi)在性質(zhì)是發(fā)射熒光。
在第五與第六方面，本發(fā)明涉及一種基本上由與綠色熒光蛋白融合的一個(gè)或多個(gè)纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域組成的多肽雜合體，以及通過在芽孢桿菌宿主中表達(dá)而生產(chǎn)這種雜合體的方法，所述方法包括在一定條件下培養(yǎng)已轉(zhuǎn)化的宿主，從而使已轉(zhuǎn)化的培養(yǎng)物基本上無未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞；在營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)已轉(zhuǎn)化的培養(yǎng)物以使所述雜合體過量產(chǎn)生；以及回收該雜合體。CBD的表達(dá)重組表達(dá)載體包含編碼本發(fā)明CBD的DNA構(gòu)建體的重組載體可以是可方便用于重組DNA操作的任何載體，載體的選擇常常取決于其將被導(dǎo)入的宿主細(xì)胞。導(dǎo)入載體的宿主細(xì)胞通常是指已轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。這樣的轉(zhuǎn)化表示采用例如原生質(zhì)體、天然的感受態(tài)細(xì)胞、轉(zhuǎn)染、接合、電穿孔或任何相當(dāng)?shù)姆椒▽NA導(dǎo)入宿主細(xì)胞。因此，載體可以是自主復(fù)制型載體，即作為染色體外實(shí)體存在的載體，其復(fù)制獨(dú)立于染色體的復(fù)制，例如質(zhì)粒?；蛘?，載體可以是這樣一種載體，當(dāng)將其導(dǎo)入宿主細(xì)胞時(shí)，能部分或全部整合到宿主細(xì)胞基因組中并隨其整合入的染色體一起復(fù)制。
載體優(yōu)選地是一種表達(dá)載體，其內(nèi)編碼本發(fā)明CBD的DNA序列可操作地與該DNA轉(zhuǎn)錄所需的附加區(qū)段相連接。通常，表達(dá)載體是從質(zhì)粒或病毒DNA衍生而來的，或者同時(shí)含有二者的元件。術(shù)語(yǔ)“可操作地連接”是指所述區(qū)段的排列方式使得它們能夠協(xié)調(diào)地發(fā)揮作用而達(dá)到預(yù)期目的，例如由啟動(dòng)子起始轉(zhuǎn)錄并穿過編碼CBD的DNA序列進(jìn)行下去。
該啟動(dòng)子可以是在選定的宿主細(xì)胞中有轉(zhuǎn)錄活性的任何DNA序列，其可以衍生自編碼宿主細(xì)胞的同源或異源蛋白質(zhì)的基因。
可用于細(xì)菌宿主細(xì)胞的合適的啟動(dòng)子的實(shí)例包括嗜熱脂肪芽孢桿菌麥芽原淀粉酶基因的啟動(dòng)子，地衣芽孢桿菌α-淀粉酶基因的啟動(dòng)子，解淀粉芽孢桿菌α-淀粉酶基因的啟動(dòng)子，枯草芽孢桿菌堿性蛋白酶基因的啟動(dòng)子，或短小芽孢桿菌木糖苷酶基因的啟動(dòng)子，或者λ噬菌體PR或PL啟動(dòng)子，或者大腸桿菌lac,trp或tac啟動(dòng)子?；蛘?，可以設(shè)計(jì)整合載體，使得僅在其正確整合至宿主細(xì)胞基因組中(如旁側(cè)啟動(dòng)子的下游)，方可有效地表達(dá)編碼CBD的DNA。
必要時(shí)，編碼本發(fā)明CBD的DNA序列也可以可操作性地連接一種合適的終止子。
本發(fā)明的重組載體還可包含可使所述載體在選用的宿主細(xì)胞中復(fù)制的DNA序列。
載體還可以包含一種選擇性標(biāo)記，例如，其產(chǎn)物可彌補(bǔ)宿主細(xì)胞內(nèi)一個(gè)缺陷的基因，或者，編碼對(duì)諸如卡那霉素、氯霉素、紅霉素、四環(huán)素、鏈霉素等抗生素的抗性或?qū)χ亟饘倩虺輨┑目剐缘幕颉?br> 為了將本發(fā)明的CBD引入宿主細(xì)胞的分泌途徑，可以在重組載體中提供一種分泌信號(hào)序列(也已知為前導(dǎo)序列、前原序列或前序列)。該分泌信號(hào)序列是以正確的閱讀框架與編碼所述CBD的DNA序列連接在一起的。分泌信號(hào)序列通常位于編碼CBD的DNA序列的5′端。該分泌信號(hào)序列可以是通常與CBD有關(guān)的分泌信號(hào)序列，也可以來自編碼另一種分泌蛋白質(zhì)的基因。
本領(lǐng)域熟知用來分別連接編碼本發(fā)明CBD的DNA序列、啟動(dòng)子和任選的終止子和/或分泌信號(hào)序列或用來通過合適的PCR擴(kuò)增方案組裝這些序列，并將它們插入含有復(fù)制或整合所需信息的合適載體中的方法(參見例如Sambrook等，出處同前)綠色熒光蛋白(GFP)已廣泛用作監(jiān)控基因表達(dá)的報(bào)道分子，細(xì)胞系的示蹤物以及蛋白質(zhì)的融合標(biāo)記(Crameri等(1996)；Cubitt等(1995)；國(guó)際專利申請(qǐng)PCT/DK96/00051)。
GFP可與CBD融合而產(chǎn)生具有纖維素結(jié)合性質(zhì)以及發(fā)熒光性質(zhì)的融合蛋白?？衫眠@一融合蛋白的表達(dá)來監(jiān)控CBD在芽孢桿菌各種中的表達(dá)情況，因此可用于優(yōu)化給定CBD的表達(dá)水平。
實(shí)施例材料與方法菌株Bacillus agaradherens NCIMB No.40482包含實(shí)施例8中的編碼內(nèi)切葡聚糖酶的DNA序列。
大腸桿菌SJ2(Diderichsen,B.等(1990))利用Bio-Rad GenePu lserTM，按照生產(chǎn)商的推薦方法制備電感受態(tài)細(xì)胞和進(jìn)行轉(zhuǎn)化。
枯草芽孢桿菌PL2306該菌株為枯草芽孢桿菌DN1885(Diderichsen,B.等(1990))在已知的枯草芽孢桿菌纖維素酶基因的轉(zhuǎn)錄單位中發(fā)生破壞而產(chǎn)生的纖維素酶陰性細(xì)胞。此外，該菌株的aprE和nprE基因(aprE:Stahl和Ferrari(1984)；nprE:Yang等(1984))也已被破壞。這種破壞基本上按照Sonenshein等編(1993),P618中所述進(jìn)行。
枯草芽孢桿菌PL2304。該菌株為枯草芽孢桿菌DN1885(Diderichsen B.，出處同前)在已知的枯草芽孢桿菌纖維素酶基因的轉(zhuǎn)錄單位中發(fā)生破壞而產(chǎn)生的纖維素酶陰性細(xì)胞。這一破壞基本上按照A.L.Sonenshein(編)(出處同前)中所述進(jìn)行。質(zhì)粒pMB100，它是pDN1528(S.Jφrgensen等(1991))的衍生物。該質(zhì)?；旧吓cpDN1528相同，只是為了進(jìn)行克隆，前者在amyL基因的終止密碼子和終止子之間導(dǎo)入了一個(gè)SacⅠ位點(diǎn)。
pDN1981(P.L.Jφrgensen等(1990))溶液/培養(yǎng)基TY和LB瓊脂(如Ausubel,F.M.等(1995)所述)SB在無菌水中混合32g蛋白胨，20g酵母提取物，5g NaCl和5ml 1N NaOH至終體積為1升。該溶液在121℃下，高壓蒸氣滅菌20分鐘。
10％Avicel將100g Avicel(FLUKA，瑞士)與無菌水混合至終體積為1升。此10％Avicel在121℃下高壓蒸氣滅菌20分鐘。
Congo紅(SIGMA，美國(guó))貯存液1％于離子化水中。
緩沖液0.1M磷酸鉀，pH7.5。普通分子生物學(xué)方法利用分子生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)方法(Sambrook等(1989)，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，冷泉港，NY；Ausubel F.M.等，1995；Harwood和Cutting,1990)進(jìn)行DNA操作和轉(zhuǎn)化。
按照供應(yīng)商的詳細(xì)說明使用DNA操作中的酶。實(shí)施例1-3基因組DNA的分離在TY中，于30℃,250rpm下培養(yǎng)糞肥纖維單胞菌24小時(shí)，通過離心收獲細(xì)胞。
60℃下，在國(guó)家工業(yè)和海洋細(xì)菌保藏有限公司(蘇格蘭)推薦的特殊培養(yǎng)基中厭氧地培養(yǎng)糞堆梭菌NCIMB 11754。通過離心收獲細(xì)胞。
30℃下，在TY瓊脂板上培養(yǎng)熒光假單胞菌纖維素亞種NCIMB1046224小時(shí)。刮下細(xì)胞用于分離基因組DNA。
按照Pitcher等(1989)中描述的方法分離上述提及的任一種的基因組DNA。鑒定糖基水解酶中存在的纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域根據(jù)其氨基酸序列，將纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域劃分為10個(gè)家族，見Tommel等(出處同前)?；谠摼C述文章的公開內(nèi)容，選擇三種潛在不同的CBD序列作為旨在研究枯草芽孢桿菌中表達(dá)情況的模型從家族Ⅱa中選出糞肥纖維單胞菌(ATCC 484)纖維素酶CenA(GenBank和SWISS-PROT Accession No.M15823)的CBD和熒光假單胞菌(NCIMB 10462)CelB(GenBank和SWISS-PROT Accession No.X52615)的CBD。
從家族Ⅵ中選出糞堆梭菌(NCIMB 11754)XynA(GenBank和SWISS-PROT Accession No.13325)的CBD二聚體。
所得到的SWISS-PROT數(shù)據(jù)中描述了推定的纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的位置，利用該信息來特異性地設(shè)計(jì)PCR引物以用于從這三種不同的細(xì)菌中得到編碼CBD的DNA片段。
同時(shí)，設(shè)計(jì)PCR引物使其添加上相應(yīng)于amyL之信號(hào)序列的氨基酸的額外密碼子，該序列用于引導(dǎo)CBD至枯草芽孢桿菌細(xì)胞的外部。糞肥纖維單胞菌(ATCC 484)纖維素酶CenA的CBD的體外擴(kuò)增在包含每種dNTP各200μM,1.5％DMSO(SIGMA，美國(guó))，2.5單位的AmpliTaq聚合酶(Perkin-Elmer,Cetus美國(guó))和各100pmol的下述引物CELFIM01U,5′-CTG CCT CAT TCT GCA GCA GCG GCG GCA AAT CTT AAT GCT CCC GGCTGC CGC GTC GAC TAC -3′CELFIM01D,5′-CTG CCT CAT TGC ATG CAG AGC TCC TAC TAC ACG GTG CCC GTG CAGGTG GTG -3′劃線處為PstⅠ和SacⅠ限制性位點(diǎn)的PCR緩沖液(10mM Tris-HCl,pH8.3,50mM KCl,1.5mM MgCl2,0.01％(w/v)明膠)中對(duì)大約100-200ng基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
在DNA熱循環(huán)儀(Landgraf，德國(guó))進(jìn)行PCR反應(yīng)。先在94℃下保溫5分鐘，接著按下述循環(huán)方案進(jìn)行PCR 30個(gè)循環(huán)94℃變性1分鐘，65℃退火1分鐘以及72℃延伸1分鐘。通過在1.5％瓊脂糖凝膠(Nasieve,FMC)上進(jìn)行電泳，并以ReadyLoad 100bp DNA梯度(GibcoBRL,Denmark)作為分子量標(biāo)記，對(duì)10μl的擴(kuò)增產(chǎn)物等分試樣進(jìn)行分析。熒光假單胞菌(NCIMB 10462)CelB的CBD的體外擴(kuò)增在添加了每種dNTP各200μM、2.6單位HiFidelityTMExpand酶混合物和各300pmol的下述引物PSUPPER,5′-CGT CCT CAT TCT GCA GCA GCG GCG GCA AAT CTT AAT GCA GCA GTGTGT GAA TAT CGG G-3′PSLOWER,5′-CTG CCT CAT TGC ATG CAG AGC TCC TAC TAT TGT CCA CCG CAA ATCGCC-3′劃線處為PstⅠ和SacⅠ限制性位點(diǎn)的HiFidelityTMPCR緩沖液(Boehringer Mannheim，德國(guó))中對(duì)大約100-200ng基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
在DNA熱循環(huán)儀(Landgraf，德國(guó))中進(jìn)行PCR反應(yīng)。首先是94℃下2分鐘，60℃下30秒和72℃下45秒溫育一個(gè)循環(huán)，接著按照下述循環(huán)方案進(jìn)行PCR 10個(gè)循環(huán)94℃變性30秒，60℃退火30秒和72℃延伸45秒，再按下述方案進(jìn)行20個(gè)循環(huán)94℃下30秒，60℃下30秒和72℃下45秒(在此延伸步驟中每一循環(huán)均增加20秒)。通過在1.5％的瓊脂糖凝膠(Nusieve,FMC)上電泳，以ReadyLoad 100bp DNA梯度(GibcoBRL,Denmark)作為分子量標(biāo)記，對(duì)10μl擴(kuò)增產(chǎn)物等分試樣進(jìn)行分析。糞堆梭菌(NCIMB 11754)XynA)的CBD二聚體的體外擴(kuò)增在補(bǔ)充了每種dNTP各200μM,2.6單位的HiFidelityTMExpand酶混合物和各300pmol的下述引物CLOST03U,5′-CTG CCT CAT TCTGCA GCA GCG GCG GCA AAT CTT AAT CCA ACT CCTGCC CCA TCT CAA AGC-3′CLOST03D2,5′-CTG CCT CAT TGC ATG CAG AGC TCC TAC TAC CAG TCA ACA TTA ACAGGA CCT GAG-3′劃線處為PstⅠ和SacⅠ限制性位點(diǎn)的HiFidelityTMPCR緩沖液(Boehringer Mannbeim，德國(guó))中對(duì)大約100-200ng基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
在DNA熱循環(huán)儀(Landgraf，德國(guó))中進(jìn)行PCR反應(yīng)。首先是94℃下2分鐘，60℃30秒和72℃下45秒進(jìn)行一次溫育，接著按下列循環(huán)方案進(jìn)行10個(gè)PCR循環(huán)94℃變性30秒，60℃退火30秒和72℃延伸45秒，再按以下循環(huán)方案進(jìn)行20個(gè)循環(huán)94℃下變性30秒，60℃下30秒，72℃下45秒(在此延伸步驟中每個(gè)循環(huán)均增加20秒)。通過在1.5％的瓊脂糖凝膠(NuSieve,FMC)上電泳，并以ReadyLoad 100bpDNA梯度(GibcoBRL,Denmark)作為分子量標(biāo)記，對(duì)10μl擴(kuò)增產(chǎn)物等分試樣進(jìn)行分析。通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)進(jìn)行克隆PCR片段的亞克隆用QIAquick PCR純化試劑盒(Qiagen,USA)，按照生產(chǎn)商說明純化上述產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物40μl等分試樣。用50μl 10mM Tris-HCl,pH8.5洗脫已純化的DNA。用SacⅠ和PstⅠ消化25μl已純化的PCR片段，在1.5％低融點(diǎn)瓊脂糖(SeaPlaque GTG,FMC)凝膠上電泳，從膠上切下相關(guān)的片段，并用QIA quick凝膠抽提試劑盒(Qiagen，美國(guó))按照生產(chǎn)商說明進(jìn)行純化。然后將已分離的DNA片段連接到經(jīng)PstⅠ、SacⅠ消化的pMB100上，用該連接混合物轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌PL2306。陽(yáng)性克隆的鑒別和鑒定細(xì)胞鋪于含有氯霉素(6μg/ml),0.4％葡萄糖和10mM磷酸氫鉀的LB瓊脂平板上，并在37℃下培養(yǎng)過夜。第二天，將菌落再劃線到新鮮的LBPG氯霉素瓊脂板上，并在37℃下培養(yǎng)過夜。一天后將每一克隆的單菌落轉(zhuǎn)移到含氯霉素(6μg/ml)的液體LB培養(yǎng)基中，于37℃以250rpm振蕩培養(yǎng)過夜。
用QIAgen質(zhì)粒純化小試劑盒(Qiagen，美國(guó))，按照生產(chǎn)商說明，從液體培養(yǎng)物中提取質(zhì)粒，與說明書不同的是，在于37℃裂解細(xì)胞15分鐘前，在重懸緩沖液中補(bǔ)充了1mg/ml的雞蛋白溶菌酶(SIGMA，美國(guó))。用PstⅠ和SacⅠ消化5μl質(zhì)粒樣品。消化產(chǎn)物經(jīng)1.5％瓊脂糖凝膠(NuSieve,FMC)電泳進(jìn)行檢測(cè)。出現(xiàn)一個(gè)大小與PCR擴(kuò)增產(chǎn)物相同的DNA片段表明為陽(yáng)性克隆。選出三個(gè)克隆，它們分別代表上述提及的來自三種不同細(xì)菌的CBD:MB144(表達(dá)糞肥纖維單胞菌CenA-CBD)、MB203(表達(dá)糞堆梭菌XynA二聚體CBD)和MB207(表達(dá)熒光纖維單胞菌纖維素亞種CelB-CBD)。已克隆DNA片段的核苷酸測(cè)序使用以上用過的同樣引物和Taq雙脫氧末端循環(huán)測(cè)序試劑盒(Perkin Elmer,USA)，采用Applied Biosystems 373A自動(dòng)測(cè)序儀，按照生產(chǎn)商說明，對(duì)經(jīng)Qiagen純化的質(zhì)粒DNA進(jìn)行測(cè)序。克隆CBD的表達(dá)、分泌和功能分析克隆MB144(表達(dá)糞肥纖維單胞菌CenA-CBD),MB203(表達(dá)糞堆梭菌XynA二聚體CBD)和MB207(表達(dá)熒光假單胞菌纖維素亞種CelB-CBD)均在SB培養(yǎng)基中于37℃,250rpm培養(yǎng)20小時(shí)。將1ml無細(xì)胞的上清液與200μl 10％Avicel混合。將該混合物置于0℃1小時(shí)。在CBD和Avicel結(jié)合后，將有CBD的Avicel于5000g離心5分鐘。將沉淀物重懸浮于100μl SDS-PAGE緩沖液中，在95℃煮5分鐘，以5000g離心5分鐘，再取25μl上樣到18％Laemmli Tris-甘氨酸，SDS-PAGENOVEX凝膠(Novex，美國(guó))上。按照生產(chǎn)商推薦的方法在XcellTM微槽(NOVEX，美國(guó))中電泳，按照生產(chǎn)商所述進(jìn)行凝膠的所有后續(xù)操作，包括用考馬斯染色、脫色和干燥。
出現(xiàn)預(yù)期大小的蛋白質(zhì)條帶(MB144蛋白質(zhì)條帶大約是12kDa,MB203蛋白質(zhì)條帶約是35kDa,MB207蛋白質(zhì)條帶約是12kDa)表明在枯草芽孢桿菌中表達(dá)了有功能性的CBD。實(shí)施例4由糞堆梭菌克隆的CBD二聚體的表達(dá)和純化用分離自MB203的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化另一種枯草芽孢桿菌TOC46，這樣獲得了一種表達(dá)CBD二聚體的新克隆MB206。用這株菌作為CBD二聚體的表達(dá)宿主，在含有SB培養(yǎng)基(氯霉素6μg/ml)的搖瓶中于37℃并以250rpm振搖培養(yǎng)該克隆20小時(shí)。
在冰浴上冷卻1400ml的培養(yǎng)液上清。用Whatman玻璃過濾器F過濾，再通過0.45微米的Millipore HVLP型濾器過濾除菌。
在室溫下，將50g Avicel懸浮在0.1M磷酸鈉緩沖液，pH7.5中30分鐘。去除上清并將Avicel懸浮液冷卻至4℃。將清亮上清與Avicel懸浮液在4℃混合30分鐘。
使Avicel靜置10分鐘，然后除去上清。將Avicel蛋白質(zhì)復(fù)合物裝入柱中并用0.1M磷酸鈉緩沖液洗滌，接著用含有0.5M氯化鈉的緩沖液洗。最后，用去離子水洗脫CBD。
含有CBD的洗脫液總體積為78ml。加入固體氯化鈉至終濃度為0.5M后，在有攔截8kD分子的R8lP膜的Amicon槽中濃縮CBD。
已濃縮的CBD溶液(30ml)在280nm的吸收值為1.2。MB206的克分子消光系數(shù)為42000，對(duì)應(yīng)于蛋白質(zhì)濃度為0.82，這樣可得出高度純化的雙CBD的總量為25mg。根據(jù)SDS-PAGE，起始材料每毫升有0.1mg的29kD蛋白質(zhì)。最終的純化產(chǎn)物在SDS-PAGE上僅顯示一條帶。實(shí)施例5在枯草芽孢桿菌中克隆和表達(dá)的二聚化真菌CBD的鑒定通過融合由Humicola insolens EGII的DNA序列編碼的CBD與由源于Humicola insolens的所述43kDa的DNA序列所編碼的CBD而構(gòu)建出一種真菌起源的CBD二聚體。
利用特異于CBD區(qū)的引物，從攜有EGⅡ(又稱為CMC3)(Dalbφge和Heldt Hansen,1994)的cDNA的質(zhì)粒中PCR擴(kuò)增出編碼Humicolainsolens EGⅡCBD和接頭的DNA序列，此外，將反義引物設(shè)計(jì)成使所得PCR片段具有與編碼前一CBD的DNA片段相同的突出，所述CBD由詳述于EP-B-0531372和US5457046中的H.insolens之43kDa內(nèi)切葡聚糖酶基因所編碼。從EP-B-0531372中所述的Humicolainsulens的基因組DNA中PCR擴(kuò)增編碼此CBD的DNA。
用下述引物#228575′-CTG CCT CAT TCT GCA GCA GCG GCG GCA AAT CTT AAT CAG GGC GGTGCA TGG CAG CAG-3′#206225′-CTG CCT CAT TGC ATG CAG AGC TCC TAC TAC AGG CAC TGA TGG TACCAG TC-3′通過SOE-PCR(Higuchi等(1988))將所述兩片段組合起來。
將此PCR片段作為PstⅠ-SacⅠ片段連接至pMB100中，用連接混合物轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌PL2306。
主要編碼CBD二聚體的克隆DNA可在序列CBD-EGⅡ-CZ(327bp):GCAAATCTTA ATCAGGGCGG TGCATGGCAG CAGTGTGGTG GCGTTGGCTTCTCGGGCTCT ACGTCCTGTG TGTCCGGTTA CACGTGCGTG TACTTGAACG ACTGGTA-CAG CCAATGCCAG CCGCAGCCGA CGACGTTACG GACAACAACA ACGCCAGGGGCAACATCGAC AACAAGGTCA GCCCCGGCTG CCACTTCAAC CACTCCGGCCGGCTGCACTG CTGAGAGGTG GGCTCAGTGC GGCGGCAATG GCTGGAGCGG CTGCAC-CACC TGCGTCGCTG GCAGCACTTG CACGAAGATTAATGACTGGT ACCATCAGTG CCTGTAG和相應(yīng)的氨基酸序列(108個(gè)氨基酸殘基)ANLNQGGAWQ QCGGVGFSGS TSCVSGYTCV YLNDWYSQCQ PQPTTLRTTTTPGATSTTRS APAATSTTPA GCTAERWAQC GGNGWSGCTT CVAGSTCTKI NDWYHQCL中找到。
如上所述進(jìn)行CBD的表達(dá)、分泌和功能性分析。實(shí)施例6構(gòu)建GFP-CBD融合體以用于優(yōu)化CBD的表達(dá)在含有每種dNTP各200μM,1.5％DMSO(SIGMA,USA),2.5單位的AmpliTaq聚合酶(Perkin-Elmer,Cetus，美國(guó))和各100pmol下述引物C-融合體1:5′-GTC AGT GAA TTC GCA TGC GTC CTT CTT TGT GCT TG-3′C-融合體2:5′-CTC ATA AAG CTT ACG GTG CCC GTG CAG GTG GTG-3′下劃線處為EcoRⅠ和HindⅢ限制性位點(diǎn)的PCR緩沖液(10mM Tris-HCl,pH8.3,50mM KCl,1.5mM MgCl2,0.01％(w/v)明膠)中，PCR擴(kuò)增按上述方法分離的100ng質(zhì)粒DNApMB144。
在DNA熱循環(huán)儀(Landgraf，德國(guó))中進(jìn)行PCR反應(yīng)。首先在94℃溫育5分鐘，接著按下述循環(huán)方案進(jìn)行三十個(gè)循環(huán)的PCR:94℃變性1分鐘，60℃退火1分鐘和72℃延伸1分鐘。通過在0.7％的瓊脂糖凝膠(NuSieve,FMC)中電泳，并以Readload 100bp DNA梯度(GibcoBRL,Denmark)作為分子量標(biāo)記，對(duì)10μl擴(kuò)增產(chǎn)物等分試樣進(jìn)行分析。
對(duì)該片段進(jìn)行純化、EcoRⅠ和HindⅢ消化以及凝膠純化，并連接至載體pBR322(Bolivar等(1977)，基因，2,95-113)中。
用連接混合物轉(zhuǎn)化SJ2電感受態(tài)大腸桿菌。陽(yáng)性克隆的鑒定和表征將轉(zhuǎn)化細(xì)胞平鋪于含有氨芐青霉素(200μg/ml)的LB瓊脂平板上并在37℃下培養(yǎng)過夜。一天后將菌落重新劃線至新鮮的LB-氨芐青霉素瓊脂平板上，在37℃下培養(yǎng)過夜。第二天將每個(gè)克隆的單菌落轉(zhuǎn)移至含有氨芐青霉素(200μg/ml)的LB液體培養(yǎng)基中，在37℃下以250rpm振搖培養(yǎng)過夜。
用QIAgen質(zhì)粒純化小型試劑盒(Qiagen，美國(guó))，按照生產(chǎn)商說明從液體培養(yǎng)物中提取質(zhì)粒。用HindⅢ和EcoRⅠ消化5μl質(zhì)粒樣品。通過在0.7％瓊脂糖凝膠(NuSieve,FMC)上凝膠電泳而檢測(cè)消化產(chǎn)物。
從按照國(guó)際專利申請(qǐng)PCT/DK96/00051中所述構(gòu)建的突變體F64L-S65T-GFP的DNA構(gòu)建物中克隆獲得GFP的衍生物。
將編碼此F64L-S65T-GFP的DNA片斷作為BamHⅠ-HindⅢ片斷，與已克隆至pBR322中的CBD編碼DNA讀框一致地克隆?；旧习瓷鲜龇椒ㄟM(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化和陽(yáng)性克隆的鑒定。
將此融合構(gòu)建物以EcoRⅠ-BamHⅠ片段形成從大腸桿菌載體中轉(zhuǎn)換至pUB110載體(Gryczan等(1978))中。轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌PL2306，通過其發(fā)光能力以及可結(jié)合Avicel的F64L-S657-GFB CBD融合多肽的存在來鑒定陽(yáng)性克隆。
用于激發(fā)本研究中F64L-S65T-GFP的光波長(zhǎng)為488nm，其激活F64L-S65T-GFP，從而發(fā)出510-530nm的光。
通過熒光分光術(shù)測(cè)量上清中的熒光，并與同AVicel共溫育后的上清的熒光進(jìn)行比較。此外，通過使融合蛋白結(jié)合至AVicel，去除多余的上清，并將Avicel移至比色杯中用于在熒光分光光度計(jì)中檢測(cè)熒光，即可以肉眼觀察到帶有CBD的發(fā)光分子。
通過制備結(jié)合于或未結(jié)合于Avicel的融合蛋白的系列稀釋度，可以確定表達(dá)水平，這樣就可以鑒定出以相對(duì)較高水平表達(dá)CBD的芽孢桿菌克隆。實(shí)施例7用CMC-CongoRed篩選可通過CBD表達(dá)水平的分析篩選出能表達(dá)CBD的重組芽孢桿菌克隆。
為了找到表達(dá)給定CBD的最佳芽孢桿菌菌株，在合適培養(yǎng)基(例如上述的TY)中，適當(dāng)?shù)纳L(zhǎng)條件下培養(yǎng)目的克隆24小時(shí)。將諸克隆的上清轉(zhuǎn)移至挖有孔洞的瓊脂糖-CMC-CongoRed平板上，使具有CBD的上清與CMC在37℃下結(jié)合5小時(shí)。當(dāng)用2％NaCl溶液洗15分鐘時(shí)，即可看到作為一個(gè)清晰區(qū)域的CBD活性。
平板分析可按以下方法進(jìn)行。
用于CBD平板分析的凝膠的制備用96％乙醇潤(rùn)濕CMC(CMC羧甲基纖維素，7LF，來自Hercules)和瓊脂糖(Litex HSA/HSB)而制備0.5％CMC和0.7％瓊脂糖。加入0.1M磷酸鉀pH7.5緩沖液，加熱混合物至100℃直至完全溶解。將溶液冷卻至60℃。加入Congo Red貯存液至終濃度5％，倒平板，每個(gè)直徑9cm的Petri平皿中倒入15ml。
用打孔器制作裝樣品的孔。實(shí)施例8定義一種新CBD家族的新CBD的鑒定通過在SB培養(yǎng)基中，于37℃下，250rpm振搖培養(yǎng)克隆20小時(shí)，從而表達(dá)下述的克隆于枯草芽孢桿菌中的堿性纖維素酶。由于其具有與Avicel特異性結(jié)合的能力，顯示所表達(dá)的纖維素酶含有CBD。
當(dāng)繼續(xù)培養(yǎng)20小時(shí)時(shí)，該纖維素酶發(fā)生蛋白水解性切割，在SDS-PAGE上可看到兩條特異的蛋白質(zhì)條帶，其中一條相當(dāng)于纖維素酶催化部分，其分子量(MW)為大約35kD，另一條相當(dāng)于預(yù)計(jì)的接頭和CBD，分子量約8kD。
已發(fā)現(xiàn)該CBD位于該纖維素酶的C-末端部分，并且該CBD與以前描述的任何CBD家族都不相符(Tomme等，1995，第142-161頁(yè))。據(jù)此，這個(gè)CBD是一個(gè)新家族的首位成員。從Bacillus agaradherens克隆堿性纖維素酶并在枯草芽孢桿菌中表達(dá)堿性內(nèi)切葡聚糖酶通過PCR克隆編碼Bacillus agaradherers(保藏號(hào)NCIMB 40482)堿性纖維素酶的核苷酸序列，以用于插入到表達(dá)質(zhì)粒pDN1981中。
基本上如上述對(duì)500ng基因組DNA進(jìn)行PCR，其中使用含NdeⅠ和KpnⅠ限制位點(diǎn)的下述兩個(gè)引物引物5:(#20887)5′-GTA GGC TCA GTC ATA TGT TAC ACA TTG AAA GGG GAG GAG AAT CATGAA AAA GAT AAC TAC TAT TTT TGT CG-3′引物6:(#21318)5′-GTA CCT CGC GGG TAC CAA GCG GCC GCT TAA TTG AGT GGT TCC CACGGA CCG-3′所述NdeⅠ和KpnⅠ位點(diǎn)用于將編碼內(nèi)切葡聚糖酶的DNA序列導(dǎo)入pDN1981中以便進(jìn)行表達(dá)。
在PCR后，用QIAquick PCR柱試劑盒(Qiagen，美國(guó))按照生產(chǎn)商說明純化PCR片斷。將純化的DNA在50μl 10mM Tris-HCl pH8.5中洗脫。經(jīng)NdeⅠ和KpnⅠ消化，進(jìn)行純化，再連接至已消化的pDN1981中。用連接混合物轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌PL2304。制備感受態(tài)細(xì)胞并按照Yasbin等(1975)所述進(jìn)行轉(zhuǎn)化。枯草芽孢桿菌轉(zhuǎn)化體的分離和檢測(cè)將已轉(zhuǎn)化細(xì)胞平鋪于含有10mg/ml卡那霉素，0.4％葡萄糖，10mMKH2PO4和0.1％AZCL HE纖維素(Megazyme，澳大利亞)的LB瓊脂平板上，在37℃下培養(yǎng)18小時(shí)。周圍有藍(lán)暈的克隆被鑒定為內(nèi)切葡聚糖酶陽(yáng)性克隆。
將每一陽(yáng)性轉(zhuǎn)化體接種在10ml含有10mg/ml卡那霉素的TY培養(yǎng)基中。經(jīng)37℃、250rpm培養(yǎng)一天后，取出50ml上清。通過將50ml上清加到在含有0.1％AZCL HE-纖維素的LB瓊脂平板上所挖的孔中而鑒定內(nèi)切葡聚糖酶活性。
在37℃下培養(yǎng)16小時(shí)后，周圍有藍(lán)暈的孔表示枯草芽孢桿菌中有內(nèi)切葡聚糖酶的表達(dá)。實(shí)施例9選擇CBD的方法制備磷酸溶脹的纖維素(PASC)用水濕潤(rùn)5g Avicel，加入到150ml冰冷的85％磷酸中，在冰浴中輕微地?cái)嚢?小時(shí)。然后邊攪拌邊加入500ml冷丙酮。用玻璃過濾漏斗過濾已溶脹的Avicel(PASC)，并用100ml冰冷的丙酮洗3次，隨后用500ml水洗兩次。然后將PASC懸浮在500ml水中，并用UltraThorax勻漿器混合均勻。將PASC冷藏。CBD與磷酸溶脹的纖維素(PASC)的結(jié)合一-CBD的選擇將Eppendorf管中溶解于50mM磷酸鈉pH7的400ml 10mg/mlPASC(按照上述制備，并經(jīng)50mM磷酸鈉pH清洗)與稀釋于50mM磷酸鈉，pH7中的400ml纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(Cel5A CBD或MB206雙CBD)混合。改變CBD的濃度，例如，從0mM至約8mM的Cel5A CBD。設(shè)計(jì)一個(gè)沒有PASC的對(duì)照組。將樣品在室溫下溫育1小時(shí)，然后在14000g離心4分鐘。將500μl上清稀釋成2ml水。在Perkin-Elmer LS50分光光度計(jì)(激發(fā)光為280nm，發(fā)射光為340nm)中，通過色氨酸熒光光度術(shù)測(cè)定上清中存在的CBD(游離CBD)量，其中使用不加入PASC的樣品的熒光密度作為參照(標(biāo)準(zhǔn)曲線)。然后可按照總CBD(未加PASC)-游離CBD計(jì)算出已結(jié)合的CBD量。這樣，將每克PASC結(jié)合CBD的量作為溶液中游離CBD(以mM表示)的函數(shù)作圖，即可得到結(jié)合等溫線見

圖1和圖2。數(shù)據(jù)可用簡(jiǎn)單的Langmuir結(jié)合模式(Bothwell等，(1995)進(jìn)行調(diào)整E(結(jié)合)=(A最大值×E(游離)/(Kd+E(游離))，其中E(結(jié)合)是以mmol/gPASC表示的已結(jié)合的CBD量，E(游離)是以mM表示的游離CBD量，A最大值是可與PASC結(jié)合的CBD的最大量，Kd是平衡E(結(jié)合)《E(游離)的平衡常數(shù)。這樣，Kd(解離常數(shù))越低，結(jié)合就越強(qiáng)。將數(shù)據(jù)用GraphPad Prizm中的算法調(diào)整成該模式，即可獲得這些常數(shù)。Cel5ACBD和MB206雙CBD的解離常數(shù)分別是0.42和0.76mM(參見圖1和圖2)。
本發(fā)明CBD的解離常數(shù)低于1mM，更優(yōu)選為低于0.1mM，最優(yōu)選為低于10mM。
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1．一種芽孢桿菌宿主，其轉(zhuǎn)化了包含編碼纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CBD)的DNA序列的載體并能表達(dá)該序列，所表達(dá)的多肽基本上由一個(gè)或多個(gè)非催化性結(jié)構(gòu)域組成。
2．根據(jù)權(quán)利要求1的宿主，其中所述DNA序列是另一種來源而非芽孢桿菌。
3．根據(jù)權(quán)利要求1或2的宿主，其能以單一多肽結(jié)構(gòu)域形式表達(dá)該纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
4．根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)的宿主，其中所述纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的分子量為4kD-35kD。
5．根據(jù)權(quán)利要求4的宿主，其中所述纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的分子量不高于30kD，優(yōu)選不高于28kD，更優(yōu)選不高于25kD。
6．根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的宿主，其中所述載體包含編碼單一纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的DNA序列。
7．根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的宿主，其中所述載體包含編碼二聚體或三聚體纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的DNA序列。
8．根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的宿主，其中所述載體包含編碼連有至少一個(gè)其他非催化活性結(jié)構(gòu)域的纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的DNA序列。
9．根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的宿主，其中所述纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域可得自微生物或植物，優(yōu)選得自細(xì)菌或真菌。
10．根據(jù)權(quán)利要求9的宿主，其中所述細(xì)菌選自由以下各屬組成的組丁酸弧菌屬、纖維單胞菌屬、梭菌屬、小雙孢菌屬、小單孢菌屬、假單胞菌屬、鏈霉菌屬、高溫單孢菌屬、芽孢桿菌屬、Caldocellum、歐文氏菌屬、粘球菌屬、纖維弧菌屬、熱厭氧桿菌屬和棲熱袍菌屬。
11．根據(jù)權(quán)利要求9的宿主，其中所述真菌選自由以下各屬組成的組蘑茹屬、網(wǎng)柄菌屬、鐮孢屬、腐質(zhì)霉屬、Neocallimastix，脈孢菌屬，Limulus，青霉屬，Phanerochaete和木霉屬。
12．根據(jù)權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)的芽孢桿菌宿主，其為嗜中性的、嗜堿性的、嗜溫性的或嗜熱性的。
13．根據(jù)權(quán)利要求12的芽孢桿菌宿主，其選自由下列各種組成的組枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌。
14．根據(jù)權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)的宿主，其中所述載體整合至未轉(zhuǎn)化宿主的基因組中。
15．根據(jù)權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)的宿主，其中所述載體以表達(dá)質(zhì)粒形式存在。
16．根據(jù)權(quán)利要求1-15中任一項(xiàng)的宿主，其中所述載體已在基因組內(nèi)發(fā)生了擴(kuò)增，或者所述表達(dá)質(zhì)粒為多拷貝質(zhì)粒。
17．一種芽孢桿菌表達(dá)載體，其攜有插入的編碼纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的DNA序列。
18．根據(jù)權(quán)利要求17的載體，其內(nèi)表達(dá)盒包含源自芽孢桿菌的調(diào)控區(qū)。
19．根據(jù)權(quán)利要求18的載體，其中所述芽孢桿菌調(diào)控區(qū)對(duì)該宿主是內(nèi)源的。
20．在芽孢桿菌宿主細(xì)胞中生產(chǎn)纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域多肽的方法，該方法包括以下步驟--在營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中，過量生產(chǎn)纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的條件下培養(yǎng)芽孢桿菌宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞已轉(zhuǎn)化了包含可操作性地連接在一起的下述元件的表達(dá)盒a)轉(zhuǎn)錄和翻譯起始調(diào)控區(qū)，b)編碼纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域多肽的DNA序列，c)轉(zhuǎn)錄和翻譯終止調(diào)控區(qū)，其中所述調(diào)控區(qū)在該宿主中是有功能的，和d)用于選擇已轉(zhuǎn)化的宿主的選擇性標(biāo)記基因；和--回收纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域多肽。
21．根據(jù)權(quán)利要求20的方法，其中生產(chǎn)的纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域多肽的分子量為4kD-35kD。
22．一種優(yōu)化芽孢桿菌宿主中CBD表達(dá)的方法，該方法包括以下步驟a．在宿主中表達(dá)融合于報(bào)道分子的CBD，b．通過測(cè)定報(bào)道分子的內(nèi)在性質(zhì)，鑒測(cè)已發(fā)酵宿主的上清中已表達(dá)CBD的濃度。
23．根據(jù)權(quán)利要求22的方法，其中所述報(bào)道分子是綠色熒光蛋白，所述內(nèi)在性質(zhì)為發(fā)射熒光。
24．基本上由與綠色熒光蛋白融合的一個(gè)或多個(gè)纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域組成的多肽雜合體。
25．生產(chǎn)權(quán)利要求24的雜合體的方法，其中所述雜合體是在芽孢桿菌宿主中表達(dá)的，即在一定條件下培養(yǎng)已轉(zhuǎn)化的宿主，從而使轉(zhuǎn)化培養(yǎng)物中基本上無未轉(zhuǎn)化細(xì)胞；將已轉(zhuǎn)化的培養(yǎng)物接種于營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中，從而使所述雜合體得到過量表達(dá)；并且回收該雜合體。
全文摘要
轉(zhuǎn)化了包含編碼纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CBD)之DNA序列的載體的芽胞桿菌宿主。該宿主能表達(dá)所述序列,所表達(dá)的多肽蛋白質(zhì)基本上由一個(gè)或多個(gè)非催化性結(jié)構(gòu)域組成;纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的分子量為4kD—35kD,并且得自于微生物或植物,優(yōu)選地來自細(xì)菌或真菌;芽孢桿菌宿主例如可以是以下諸種之一:枯草芽孢桿菌,地衣芽孢桿菌,巨大芽孢桿菌,嗜熱脂肪芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌;攜有編碼纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的DNA序列的芽孢桿菌表達(dá)載體;一種在芽孢桿菌宿主細(xì)胞中生產(chǎn)纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域多肽的方法。
文檔編號(hào)C12N15/09GK1235635SQ9719919
公開日1999年11月17日 申請(qǐng)日期1997年10月28日 優(yōu)先權(quán)日1996年10月28日
發(fā)明者M·E·布蘭瓦德, M·舒賴恩, P·L·喬根森 申請(qǐng)人:諾沃挪第克公司