專利名稱：含可變肽表位的免疫原制劑及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種免疫原制劑及其制備方法，尤其涉及基于所選氨基酸制備免疫原肽混合物的方法，所述氨基酸選自蛋白表位的可變殘基處出現(xiàn)的氨基酸。
背景技術(shù)：
很多病原體，包括病毒，如HIV-1和HIV-2、流感、肝炎A/B/C、人類乳頭狀瘤(HPV)、和登革熱，以及寄生蟲，如瘧疾和旋毛蟲，都易于改變尤其是蛋白表位中的氨基酸序列。鑒于這種行為以及其它目的，越來越多地探索將合成肽疫苗作為減活或滅活疫苗的可供選擇物。選擇具有有效免疫力的表位，而對(duì)于產(chǎn)生有害免疫應(yīng)答的表位，如促進(jìn)疾病形成或抑制T-細(xì)胞，都應(yīng)該被排除在候選疫苗范圍以外。此外，由于合成肽疫苗是通過化學(xué)設(shè)計(jì)，不含任何感染性物質(zhì)，對(duì)身體危害很小。最后，減活疫苗需要在限定的冷卻溫度下運(yùn)輸和儲(chǔ)存，與活的減活疫苗不同，合成肽疫苗相對(duì)穩(wěn)定，且無須冷凍，因此更易于分配，成本也低。
通常，合成肽疫苗具有抗細(xì)菌、抗寄生蟲和抗病毒疫苗。細(xì)菌表位疫苗包括直接抗霍亂和Shigella的疫苗?？够魜y的合成疫苗已經(jīng)進(jìn)行了人類I期和II期臨床實(shí)驗(yàn)。流感和乙肝病毒代表兩個(gè)病毒體系，其中合成疫苗看起來更具前景，最近人們又對(duì)抗人類免疫缺陷病毒(HIV)的合成疫苗產(chǎn)生了興趣。
盡管目前進(jìn)展很快，但合成肽疫苗還是不能跟上包膜蛋白或表面蛋白的變異速度。之前，有幾個(gè)研究小組采用了幾種方法試圖克服表位變異。Tam在U.S.Patent number 5,229,490(July 20，1993)中描述了一種克服表位變異的方法。該方法涉及利用賴氨酸功能基和甘氨酸連接體將幾個(gè)相似或不同的表位聚合成一種免疫原核(稱為樹枝狀聚合物)。該方法被稱為多抗原肽體系(MAPS)。然而高免疫原的、基于HIV的MAPS沒有證明能誘導(dǎo)產(chǎn)生能識(shí)別各種病毒株的廣泛反應(yīng)性抗體(Nardelli et al.(1992)J Immunol 148914-920)。
另一種早期方法涉及識(shí)別模擬簇(mimotopes)，隨機(jī)產(chǎn)生模擬抗原表位的序列(Lenstra et al.(1992)J Immunol Methods 152149-157)。利用該方法，退化的寡核苷酸被嵌入細(xì)菌的表達(dá)載體上，導(dǎo)致形成長為6-8個(gè)氨基酸的隨機(jī)肽庫。利用感染了相應(yīng)病原體的動(dòng)物或人的血清(含有抗體)鑒定模仿抗原表位的肽。這種方法的確已經(jīng)用于鑒定被感染了HCV的個(gè)體的血清所識(shí)別出的模擬簇(Prezzi et al.(1996)J Immunol 1564504-4513)。然而，這些肽是被隨機(jī)選出的，因此，有必要獲得并分析感染主體的血清，以制備模擬簇組合物。
現(xiàn)有技術(shù)的方法的另一個(gè)缺點(diǎn)是，需要來自感染個(gè)體的血清，而很多感染個(gè)體并沒有產(chǎn)生適宜的抗病原抗體。因此，利用患者血清來選擇肽，很有可能會(huì)由于感染個(gè)體沒能產(chǎn)生免疫應(yīng)答，而導(dǎo)致漏掉重要的模擬表位抗原肽。
利用SIV感染人類HIV的恒河短尾猴模型，已經(jīng)描述了SIV包膜糖蛋白B細(xì)胞neutralization以及T細(xì)胞表位，并且基于高可變性和高抗原性表位SIVMACL42包膜糖蛋白(GPL30)設(shè)計(jì)并合成了合成免疫原(Anderson et al.(1994)Vaccine 12736-740)。該合成免疫原由肽的混合物組成，這些肽體現(xiàn)了SIV包膜基因序列中發(fā)現(xiàn)的氨基酸替代物的變異體。因此，合成免疫原綜合表達(dá)了所發(fā)現(xiàn)的該具體表位的所有體內(nèi)變化。通過測定該合成免疫原的免疫性，其顯示了能誘導(dǎo)接受免疫的恒河短尾猴體內(nèi)與天然SIV結(jié)合的抗體數(shù)量的增加。而且，該合成免疫原還促進(jìn)對(duì)多種表位類似物的免疫反應(yīng)性。在此文獻(xiàn)以及以后的文獻(xiàn)中都揭示了這種方法能夠適應(yīng)表位的可變性(Meyer et al(1998)AIDS Res Human Retro 14751-760)。
最近的研究漸漸澄清了T細(xì)胞識(shí)別肽抗原的能力顯得退化了。該發(fā)現(xiàn)使得人們更加注意一些外來抗原的肽能夠模擬一些自身抗原并導(dǎo)致自身反應(yīng)性T細(xì)胞的反應(yīng)和自身免疫性疾病的形成。隨后，就存在用隨機(jī)合成肽的混合物免疫動(dòng)物或人類而引起自身免疫性疾病的危險(xiǎn)。模擬簇方法(LENSTRA et al.(1992)J Immunol Methods 152149-157)利用被感染動(dòng)物或人的血清從隨機(jī)合成的肽混合物中選擇一亞類肽，因此降低自身免疫性疾病發(fā)生的危險(xiǎn)。然而，盡管合成免疫原制劑如現(xiàn)有技術(shù)中所描述的那些，可以包含超過8000個(gè)不同的肽抗原，但上述合成免疫原制劑(Anderson et al.(1994)Vaccine 12736-740；Meyer et al(1998)AIDS Res Human Retro 14751-760)并不包括全部隨機(jī)肽混合物，因?yàn)檫@些肽是基于僅在部分合成反應(yīng)步驟中加入一些約20個(gè)氨基酸的肽而合成。該方法獲得的免疫原會(huì)激起大范圍的免疫反應(yīng)性，這種制劑過于復(fù)雜以致難于進(jìn)行生化或免疫性定性，對(duì)人類進(jìn)行免疫后會(huì)承受引起免疫性疾病的嚴(yán)重風(fēng)險(xiǎn)。而且，沒有完全的組成分析，混合的肽組合物也不會(huì)得到管理部門的認(rèn)可。對(duì)于含有成千上百種肽的混合肽組成，進(jìn)行完全分析將是一個(gè)耗時(shí)、高成本的工作。
很多前述的合成免疫原制劑，是由上萬種肽所組成的。如果T細(xì)胞識(shí)別外來抗原的能力退化，則混合肽就會(huì)導(dǎo)致含有模擬自身抗原的肽的危險(xiǎn)，這將會(huì)誘導(dǎo)產(chǎn)生病原性自身免疫性應(yīng)答。而且，即使不是沒有進(jìn)行化學(xué)定義和定性分析的可能，但前述合成路線的復(fù)雜性會(huì)使得對(duì)相同組成的多個(gè)制劑的定義和定性工作帶來困難。
基于上述原因，需要一種涉及免疫原肽混合物的新方法，該方法會(huì)產(chǎn)生比現(xiàn)有技術(shù)所描述的復(fù)合制劑成份更簡單的制劑，但仍保留最佳的免疫原性。利用這種方法，使制備的混合物能夠進(jìn)行分析以便人類使用。而且，還需要一種用于分析該制劑的檢測方法，以保證合成反應(yīng)中形成的混合物的統(tǒng)一性和抗原性。
發(fā)明簡述本發(fā)明的目的之一是減少或消除先前免疫原制劑或制備該制劑的方法的至少一種缺陷。
本發(fā)明提供了一種制備肽混合物的方法，所述肽混合物體現(xiàn)了蛋白表位體內(nèi)序列變體。由該方法所制備的肽混合物能激起廣泛免疫反應(yīng)性，該肽混合物可用于制備抗病原性微生物如病毒和寄生蟲的疫苗、治療劑和診斷試劑盒。該方法可被應(yīng)用于病原微生物的多種表位中。
本發(fā)明提供了一種制備肽混合物的方法，該肽混合物被稱為高可變表位構(gòu)建體(HEC)，所得肽混合物綜合體現(xiàn)了免疫原表位中體內(nèi)可見的可變性，但組成簡單足以能進(jìn)行分析。該混合物表現(xiàn)了表位中氨基酸替代的變化。用該肽混合物對(duì)人體進(jìn)行免疫，T細(xì)胞和B細(xì)胞應(yīng)答減弱，導(dǎo)致抗體的高滴度，該抗體與遠(yuǎn)相關(guān)的天然病原蛋白的結(jié)合增強(qiáng)。此外，這些抗體能夠中和HEC所基于的多種病原株的感染。
本發(fā)明的一個(gè)方案提供了一種制備免疫原肽混合物的方法，其包括步驟獲得病原體免疫原表位序列，該免疫原表位序列具有共同的殘基區(qū)域，和至少一種各序列互不相同的可變殘基；測定在免疫原表位序列的可變殘基處出現(xiàn)的不同氨基酸的頻率；合成肽混合物，其包括至多約100個(gè)不同肽，每種肽都具有共同的殘基區(qū)域和一種可變殘基位點(diǎn)上的氨基酸，該氨基酸選自出現(xiàn)頻率大于約10％-約30％閾頻率的免疫原表位序列中可變殘基處的氨基酸。
本發(fā)明還提供一種制備免疫原肽混合物的方法，其包括步驟獲得病原體免疫原表位序列，該免疫原表位序列具有共同的殘基區(qū)域，和至少一種各序列互不相同的可變殘基；測定在免疫原表位序列的可變殘基處出現(xiàn)的不同氨基酸的頻率；將出現(xiàn)在可變殘基處的氨基酸頻率進(jìn)行舍入至其最接近的25％；合成肽混合物，其包括至多約100個(gè)不同肽，每種肽都具有共同的殘基區(qū)域和一種可變殘基位點(diǎn)上的氨基酸，該氨基酸選自在免疫原表位序列的可變殘基處出現(xiàn)頻率最高的氨基酸，條件是該氨基酸的舍入頻率不等于零；其中可變殘基位點(diǎn)選自兩個(gè)至四個(gè)不同氨基酸，其中每個(gè)氨基酸在肽混合物中的比例相當(dāng)于其舍入頻率。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種對(duì)病原體產(chǎn)生免疫性的肽混合物，該混合物包括至多約100個(gè)不同肽，每種肽具有一共同氨基區(qū)域和可變殘基位點(diǎn)；不同肽的共同殘基區(qū)域是病原體的免疫原表位序列的不變氨基酸，與其相鄰的是一種免疫原表位序列的可變殘基；可變殘基位點(diǎn)被一種氨基酸所占據(jù)，該氨基酸選自免疫原表位序列的可變殘基處出現(xiàn)頻率最多的氨基酸，條件是(a)在肽混合物的不同肽中的可變殘基位點(diǎn)處的氨基酸不超過4種；和(b)不同肽的可變殘基位點(diǎn)處的氨基酸在免疫原表位序列的可變殘基處出現(xiàn)的頻率大于約10％-約30％的閾頻率。
本發(fā)明不同于從前制備免疫原組合物的方法在于其為了使該方法適用于人體的疫苗設(shè)計(jì)中所進(jìn)行的改進(jìn)，組合物被限于含有種類少的肽，這些肽充分體現(xiàn)了天然免疫原表位序列的可變性。
本發(fā)明提供了一種制備包含被稱為高可變表位構(gòu)建體的混合肽的免疫原制劑的簡便方法。該方法的肽合成部分可以被簡化為本領(lǐng)域熟知的化學(xué)合成方法，“一步”法。
有利地，本發(fā)明提供了基于不同病毒表位的各種HECs，從而采用本發(fā)明的方法用最少的合成步驟制備出大量的肽庫。制備的不同肽的種類采用這樣一種方法進(jìn)行控制，即免疫原制劑的全部組成都能夠通過分析而被預(yù)知和證實(shí)。所發(fā)明的HEC能夠與衍生出該肽的蛋白發(fā)生大范圍免疫原反應(yīng)。
有利地，用HEC進(jìn)行免疫后，誘導(dǎo)產(chǎn)生與各種病原體株的廣泛免疫反應(yīng)，從而導(dǎo)致對(duì)病原體感染的抑制。
本發(fā)明的HEC能夠克服主要的組織相容性限制，這是世界范圍內(nèi)開發(fā)人類疫苗的共同障礙。而且，HEC能夠被改進(jìn)用以誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞(CTL)免疫應(yīng)答。除了應(yīng)用于疫苗，HECs還可以被用于診斷試劑盒中。
通過結(jié)合附圖對(duì)以下具體實(shí)施方案的描述，使本發(fā)明的其它方案和特征對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員而言是顯而易見的。


本發(fā)明的實(shí)施方案通過實(shí)施例并參照附圖進(jìn)行描述。
圖1是本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例中合成HEC的簡化示意圖。
圖2是本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例制備肽混合物的步驟略圖。
圖3圖示了本發(fā)明基于人類I型免疫缺陷病毒使用選擇的氨基酸進(jìn)行5種HECs的合成。
圖4圖示了對(duì)非人類的靈長目(猴子)進(jìn)行HIV-1 HECs免疫而誘導(dǎo)T輔助性細(xì)胞的應(yīng)答。
圖5圖示了通過對(duì)猴子進(jìn)行HIV-1 HECs 1至5的免疫，誘導(dǎo)體內(nèi)產(chǎn)生有效的抗體滴度。
圖6顯示了通過HIV-1 HECs免疫誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體與來自不同HIV-1株的表位結(jié)合。
圖7顯示了用HIV-1 HECs1-5對(duì)猴子免疫后產(chǎn)生的抗體中和了由不同HIV-1引起的人類外周血管淋巴細(xì)胞(PBLs)的感染。
圖8顯示了來自感染不同HIV-1亞型A，B，C，D，E和F的患者的陽性血清中的抗體識(shí)別基于HIV-1的HECs 1-5。
圖9顯示了基于丙型肝炎病毒(HCV)的兩個(gè)HECs的設(shè)計(jì)。
圖10顯示了基于在流感A的紅血球凝聚素包膜蛋白上發(fā)現(xiàn)的抗原遷移聯(lián)合位點(diǎn)設(shè)計(jì)4種HECs。
圖11顯示了用圖10的流感HECs進(jìn)行免疫的小鼠的T輔助細(xì)胞應(yīng)答。
圖12顯示了用圖10的流感HECs進(jìn)行免疫的小鼠的抗體應(yīng)答與非相關(guān)肽的比較。
圖13顯示了用SIV-衍生的HEC免疫后的Balb/c小鼠的免疫應(yīng)答。該圖說明了Balb/c小鼠不能激發(fā)對(duì)單純SIV-衍生的表位產(chǎn)生免疫應(yīng)答，這是由于它們主要的組織相容性基因型而造成，基于相同表位的HEC進(jìn)行的免疫才能導(dǎo)致免疫應(yīng)答。
圖14顯示了進(jìn)行SIV免疫的小鼠的抗體結(jié)合性。該數(shù)據(jù)表明用SIV HEC對(duì)無應(yīng)答品系的小鼠進(jìn)行免疫激發(fā)的抗體能夠結(jié)合HEC所基于的病毒。
圖15顯示了將HECs結(jié)合到脂質(zhì)部分上可以誘導(dǎo)細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞(CTL)應(yīng)答。
圖16顯示了本發(fā)明的5種肽混合物的組合物，其包含了已測定的一系列肽。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供了一種用于制備免疫原肽混合物或高可變表位構(gòu)建體(HEC)的方法。
在一個(gè)實(shí)施例中，制備免疫原肽混合物的方法包括以下步驟。獲得病原體免疫原表位序列，該序列具有一共同殘基區(qū)域和至少一個(gè)序列之間互不相同的可變殘基。測定免疫原表位序列的可變殘基處出現(xiàn)的不同氨基酸的頻率。然后合成混合肽，該混合肽包括至多約100種不同的肽，每種肽具有共同的殘基區(qū)域以及在可變殘基位點(diǎn)的一種氨基酸，該氨基酸選自在免疫原表位序列的可變殘基處出現(xiàn)頻率大于閾頻率的氨基酸，該閾頻率約為10％-約30％，如20％。根據(jù)該實(shí)施例，肽混合物包括一種位于可變殘基處的氨基酸的序列，該氨基酸選自免疫原表位序列的可變殘基處最頻繁出現(xiàn)的氨基酸，任選的限制條件是肽混合物中不同肽的可變殘基處出現(xiàn)的不同氨基酸種類不超過4種。
在合成肽混合物的步驟中，使肽的可變殘基位點(diǎn)處的不同氨基酸的出現(xiàn)頻率與免疫原表位序列的可變殘基處的不同氨基酸的頻率相當(dāng)?？勺儦埢稽c(diǎn)的氨基酸出現(xiàn)頻率可以被舍入計(jì)算到其最接近的25％，肽混合物中的各種肽的可變殘基位點(diǎn)處的氨基酸只能選擇舍入頻率值非零的氨基酸。在這種情況下，肽混合物中的肽可以被賦予一氨基酸，其在可變殘基位點(diǎn)出的頻率與其舍入計(jì)算的頻率值相當(dāng)。
任選地，當(dāng)計(jì)算頻率時(shí)，可以累計(jì)可變殘基處出現(xiàn)的相似氨基酸的頻率，然后將累計(jì)后的頻率賦予給最頻繁出現(xiàn)的相似氨基酸。這種任選情況的限制條件是，只有相似氨基酸單獨(dú)出現(xiàn)的頻率低于閾頻率時(shí)，才可以累積可變殘基處出現(xiàn)的相似氨基酸的頻率。在舍入計(jì)算每種相似氨基酸的頻率至其最接近的25％時(shí)，沒有相似氨基酸具有25％或更高的頻率，相似氨基酸頻率值才可以被累計(jì)。
本發(fā)明的“相似”氨基酸選自共同組群中的氨基酸，其選自芳香族氨基酸、脂肪族氨基酸、帶羥基側(cè)鏈的脂肪族氨基酸、堿性氨基酸、酸性氨基酸、含酰胺氨基酸和含硫氨基酸。
本發(fā)明的合成步驟可以采用氨基酸的偶合，其中可變殘基位點(diǎn)處的偶合可以采用加入相當(dāng)于舍入計(jì)算頻率的氨基酸而進(jìn)行。本發(fā)明也可以包括一個(gè)或多個(gè)采用生物信息方法學(xué)的步驟。
任選地，免疫原表位序列包括2至7個(gè)可變殘基，其會(huì)使肽混合物包含2至約64個(gè)不同肽。
本發(fā)明還涉及免疫原肽混合物的方法，其包括略微不同的幾個(gè)步驟，尤其是以下步驟。獲得病原體免疫原表位序列，該序列具有一共同殘基區(qū)域以及至少一種使序列各不相同的可變殘基。測定免疫原表位序列的可變殘基處出現(xiàn)的不同氨基酸的頻率，舍入至其最接近的25％。然后合成一種肽混合物，其包括至多約100種不同的肽，每種肽具有共同的殘基區(qū)域以及在可變殘基位點(diǎn)處具有一種選自免疫原表位序列的可變殘基處出現(xiàn)頻率最高的氨基酸，條件是舍入頻率值是非零。根據(jù)該步驟，可變殘基位點(diǎn)選自2至4種不同氨基酸，其中每種氨基酸在肽混合物中的量相當(dāng)于其舍入計(jì)算的頻率值。
該步驟還可以包括將相似氨基酸的頻率累計(jì)的步驟，所述頻率舍入值低于25％；將該累計(jì)后的頻率賦予給出現(xiàn)頻率最多的相似氨基酸；舍入該累計(jì)頻率至其最接近的25％，且用于累計(jì)的氨基酸是非零舍入頻率的氨基酸，包括在肽混合物的合成步驟中最頻繁出現(xiàn)的相似氨基酸。
本發(fā)明還涉及一種針對(duì)病原體的肽混合物免疫原。該混合物包括至多約100種不同的肽，每種具有一共同殘基區(qū)域和一可變殘基位點(diǎn)。不同肽的共同殘基區(qū)域由病原體的免疫原表位序列的非可變氨基酸組成，與其相鄰的是免疫原表位序列的可變殘基。該可變殘基位點(diǎn)被一氨基酸占據(jù)，該氨基酸選自免疫原表位序列的可變殘?zhí)幾铑l繁出現(xiàn)的氨基酸，條件是(a)肽混合物中的不同肽的可變殘基位點(diǎn)處的氨基酸不超過4種不同的氨基酸；和(b)不同肽的可變殘基位點(diǎn)處出現(xiàn)的一種氨基酸在免疫原表位序列的可變殘基處出現(xiàn)的頻率高于約10％至約30％的閾頻率?？勺儦埢稽c(diǎn)處出現(xiàn)的氨基酸頻率可以根據(jù)以下方案進(jìn)行測定免疫原表位序列的可變殘基處出現(xiàn)的氨基酸的頻率被舍入為其最接近的25％，且具有非零舍入頻率的氨基酸在不同肽中的可變殘基位點(diǎn)處的頻率相當(dāng)于舍入頻率。
舍入頻率低于25％的可變殘基位點(diǎn)處出現(xiàn)的相似氨基酸可以通過累計(jì)相似氨基酸的頻率并將該累計(jì)值舍入至其最接近的25％而進(jìn)行測定。對(duì)于非零舍入頻率，將該舍入頻率賦予于最頻繁出現(xiàn)的相似氨基酸。根據(jù)該實(shí)施例，不同肽中的可變殘基位點(diǎn)處最頻繁出現(xiàn)的相似氨基酸的頻率與舍入頻率相當(dāng)。
本發(fā)明的結(jié)合的肽組合物的構(gòu)成包括將本發(fā)明的肽混合物結(jié)合到脂質(zhì)部分或結(jié)合到載體蛋白部分上。
本發(fā)明的免疫原組合物可以包括多個(gè)由本發(fā)明的方法制備所得的肽混合物，其中每個(gè)肽混合物的免疫性都針對(duì)同一種病原體。任選地，本發(fā)明的免疫原組合物可以包括多個(gè)針對(duì)相同病原體的不同免疫原表位的肽混合物，這些不同的免疫原表位可以在病原體表面上的緊鄰區(qū)域上。
根據(jù)本發(fā)明可以構(gòu)成能激發(fā)對(duì)一種病原體產(chǎn)生免疫原應(yīng)答的疫苗。該疫苗包括本發(fā)明的肽混合物與可藥用載體的混合物。因此，本發(fā)明的疫苗對(duì)抗病原性疾病的方法包括給主體施用有效量的疫苗。
主體感染病原體的診斷方法也是本發(fā)明的保護(hù)范圍。該方法包括步驟從主體體內(nèi)獲得含有抗體的生物樣品；將該生物樣品與基于該病原體的免疫原表位序列的本發(fā)明免疫原肽混合物相接觸；評(píng)價(jià)樣品與肽混合物的免疫原應(yīng)答。檢測主體感染病原體的診斷試劑盒包括基于該病原體的免疫原表位序列的本發(fā)明免疫原肽混合物，以及評(píng)價(jià)來自主體的含有抗體的生物樣品對(duì)免疫原肽混合物的免疫應(yīng)答的說明書。
此外，本發(fā)明提供了一種分離對(duì)病原體具有免疫原性抗體的方法，其包括步驟給主體施用本發(fā)明的肽混合物；從主體獲得抗體，或與病原體反應(yīng)的一部分抗體，所述抗體通過施用肽混合物而誘導(dǎo)產(chǎn)生。
本發(fā)明的進(jìn)一步方案是提供一種用于分離編碼對(duì)病原體具有免疫原性的抗體的基因的方法。該方法包括步驟給主體施用本發(fā)明的肽混合物；從主體獲得由施用肽混合物而誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體；分離編碼該抗體的基因。相似地，本發(fā)明還包括提供一種分離編碼對(duì)病原體具有免疫原性的抗體的一部分基因或基因物質(zhì)的方法，其包括步驟給主體施用本發(fā)明的肽混合物；從主體獲得由施用肽混合物而誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體；分離編碼該抗體的一部分基因或基因物質(zhì)。因此，通過施用由該方法獲得的一部分基因或基因物質(zhì)而編碼的肽或蛋白質(zhì)，可以開發(fā)出抗病原體的免疫療法。
本發(fā)明的制備免疫原混合物的方法從分析天然存在的一種病原體的序列開始，這些病原體已經(jīng)在科學(xué)性數(shù)據(jù)庫或同行們閱讀的科學(xué)性期刊上被報(bào)導(dǎo)。這項(xiàng)工作是用于減少合成過程中產(chǎn)生的不同肽的數(shù)量。所加入的氨基酸以及在哪一步合成反應(yīng)中加入都是根據(jù)特定步驟事先確定的，即在第一次校準(zhǔn)包含已知T輔助性細(xì)胞和B細(xì)胞中和表位的序列之后進(jìn)行的。得到的肽混合物，被稱為高可變表位構(gòu)建體(HEC)，體現(xiàn)了單一肽合成中所形成的表位序列的變異，這是通過加入統(tǒng)計(jì)學(xué)重量的氨基酸混合物使其與初鏈上的在先裝配的氨基酸相連接而實(shí)現(xiàn)的。因此，與模擬簇不同，HEC中的肽不完全是隨機(jī)形成的，其可以呈現(xiàn)抗原性表位的作用。基于該原因，沒有必要采用受感染的動(dòng)物或患者的血清以分離重要表位。HECs能夠用于檢測其與作為活性對(duì)照的感染病原體個(gè)體的血清的反應(yīng)性，以此確保肽合成反應(yīng)的正常進(jìn)行。無需使用患者血清選擇HEC所包含的各種肽，而這正是與現(xiàn)有技術(shù)的模擬簇方法的根本不同之處。
本發(fā)明呈現(xiàn)了一種簡便的方法，其已可用于彌補(bǔ)表位的可變性。在固相肽合成中，在每一循環(huán)中，一種氨基酸被“偶合”或被加入到樹脂珠上以逐漸構(gòu)成肽鏈。某一特定循環(huán)所加入的氨基酸百分比是基于表位中某特定位點(diǎn)上該氨基酸出現(xiàn)的頻率計(jì)算所得。該信息是基于序列的信息，其來自直接的實(shí)驗(yàn)室氨基酸測序獲得的數(shù)據(jù)，或來自序列數(shù)據(jù)庫和/或來自同行閱讀的科學(xué)性期刊所獲得的體內(nèi)序列數(shù)據(jù)。本發(fā)明的免疫原肽混合物或HEC，由蛋白表位中發(fā)現(xiàn)的氨基酸替代物的變異性肽混合物組成。
圖1表示了制備HEC的方法示意圖。簡言之，在步驟1中，獲得了病原體的免疫原表位序列。該表位至少具有一種可變殘基，其代表了不同的已知序列中的不同氨基酸。每種不同氨基酸在表位序列的可變位點(diǎn)處出現(xiàn)的頻率在步驟2中測定，并與在先測定的閾頻率相比較。設(shè)定閾頻率以使表位序列中低于閾頻率的較小數(shù)量的氨基酸不會(huì)在所合成的肽混合物中出現(xiàn)。那些接近閾頻率的氨基酸才是步驟3的肽合成中在可變殘基位點(diǎn)處添加的氨基酸。低于閾頻率的氨基酸是不會(huì)在肽合成中用于可變氨基位點(diǎn)處的。最終，肽混合物的合成可采用能使上述高于閾頻率的氨基酸以相當(dāng)于免疫原表位中出現(xiàn)的頻率的數(shù)量而添加到可變殘基位點(diǎn)處的任何肽合成路線。閾頻率的范圍為10％至30％，且合成的肽混合物不應(yīng)該太復(fù)雜而超過約100種不同的序列。
圖2表示了一種制備HEC的方法的可選示意圖。簡言之，在步驟1中，來自適宜來源如數(shù)據(jù)庫或同行閱讀的期刊的病原體的體內(nèi)分離物獲得蛋白序列。對(duì)蛋白序列進(jìn)行校準(zhǔn)，如果存在，則尤其對(duì)于含有免疫原B細(xì)胞中和、CTL或輔助性表位的序列校準(zhǔn)。注意，無需鑒定用于本發(fā)明的某一蛋白序列中的特定免疫原B細(xì)胞中和、CTL或輔助性表位。盡管表位代表了已選擇作為免疫系統(tǒng)靶點(diǎn)的蛋白某區(qū)域，但無需對(duì)于該免疫系統(tǒng)的作用機(jī)理進(jìn)行鑒定。
步驟2中，測定表位中每個(gè)位點(diǎn)的氨基酸的出現(xiàn)頻率。對(duì)于超過一個(gè)氨基酸出現(xiàn)的位點(diǎn)，根據(jù)步驟3至6所描述的方法將這些氨基酸包含在肽混合物中。尤其是，將可變殘基位點(diǎn)處出現(xiàn)的每種氨基酸的頻率舍入到其最接近的25％(步驟3)。例如，12％的頻率被舍為0％，而13％的頻率被入為25％。
步驟4中，將可變殘基處出現(xiàn)的相似氨基酸，其舍入頻率不足25％的頻率進(jìn)行累計(jì)，再將該累計(jì)頻率賦予于最頻繁出現(xiàn)的相似氨基酸。然后將該數(shù)值進(jìn)行舍入至最接近的25％。
相似氨基酸是那些具有相似化學(xué)結(jié)構(gòu)或性質(zhì)的可進(jìn)行保守性變換的氨基酸。相似氨基酸的實(shí)例為脂肪族氨基酸((Gly，Ala，Val，Leu，Ile，和Pro)，含有脂肪羥基側(cè)鏈的氨基酸(Ser，Thr)，含硫氨基酸(Cys，Met)，芳香族氨基酸(Phe，Tyr，和Trp)，堿性氨基酸(Lys，Arg，和His)，酸性氨基酸(Asp，Glu)，和含有酰胺的氨基酸(Asn，GLN)。
作為該步驟的一個(gè)實(shí)例，如果蛋氨酸的出現(xiàn)頻率為10％，半胱氨酸的出現(xiàn)頻率為8％，兩種氨基酸都不能舍入為25％。然而，由于蛋氨酸和半胱氨酸是相似氨基酸(二者都為含硫氨基酸)，將二者頻率相加得到累計(jì)頻率18％，然后舍入為25％，再將該頻率賦予于蛋氨酸，因其比半胱氨酸在可變殘基處出現(xiàn)得更頻繁。
步驟5中，在肽合成過程中，以舍入頻率相當(dāng)?shù)臄?shù)量添加可變殘基處非零舍入頻率(如頻率為25％、50％、75％或100％)的氨基酸。如果舍入頻率的總和沒有達(dá)到100％，則將舍入頻率的總和作為除數(shù)，尤其取出每個(gè)舍入頻率以得到所加入的可變殘基處的氨基酸的所需百分?jǐn)?shù)。例如，如果可變殘基處的第一種氨基酸的出現(xiàn)頻率為60％，第二種氨基酸出現(xiàn)頻率為30％，沒有其它氨基酸或累計(jì)組合的氨基酸用于舍入到非零頻率。因此，第一種氨基酸被舍為50％，而第二種氨基酸被舍為25％。由于第一和第二氨基酸的舍入頻率總和為75％，每種氨基酸加入到合成中的比例應(yīng)為各自舍入頻率除以總和75％所得的比值。因此，第一種氨基酸所加入的量為50％除以75％(66.7％)，第二種氨基酸所添加的量為25％除以75％(33.3％)。
步驟4還涉及的一個(gè)限制條件是可變殘基處不超過4種氨基酸。例如，一個(gè)可變殘基位點(diǎn)處出現(xiàn)了5種氨基酸，其頻率大約都為20％，則每種氨基酸的舍入頻率為25％。那么，所有非零舍入頻率總和將為125％。然而，由于該步驟中可添加的最多氨基酸是4種，而需在5種氨基酸中選擇最頻繁出現(xiàn)的4種氨基酸，則非零舍入頻率的總和為100％。在這種情況下，這4種最頻繁出現(xiàn)的氨基酸中的每一種將被以25％的數(shù)量添加在可變殘基處。
步驟6是合成肽混合物，其包括步驟5中選擇的氨基酸。該步驟可采用任何可接受的肽合成方法，其使得氨基酸在具體殘基處被選擇性置入其中?？梢圆捎靡阎碾暮铣煞椒ǎ鏔moc化學(xué)法。該步驟的限制性條件是所形成的肽混合物不超過約100種不同的肽?？梢允褂孟铝蟹匠淌接?jì)算混合物總的不同肽的數(shù)目。
測定每種肽的可變殘基的不同氨基酸的數(shù)目。將這些數(shù)目相乘即得到步驟6所形成的不同種肽的可能數(shù)目。
例如，合成出含有3個(gè)可變殘基位點(diǎn)的11-mer肽。3個(gè)可變位點(diǎn)中的第一個(gè)具有4個(gè)不同氨基酸選擇，而其余2個(gè)可變位點(diǎn)中的每一個(gè)都只具有2個(gè)不同的氨基酸選擇。合成肽中的所有可能的不同肽數(shù)目為4×2×2＝16。對(duì)于不可變殘基(11-mer中的其余8個(gè)氨基酸)，只能使用一種氨基酸。因此，非可變氨基酸不會(huì)引起可變性。
步驟6的另一個(gè)實(shí)例是，合成了具16個(gè)殘基表位的肽混合物，其具有6個(gè)可變殘基和10個(gè)非可變殘基。每個(gè)可變殘基具有2種氨基酸的選擇。步驟6中合成的不同種肽的總數(shù)為2×2×2×2×2×2(或26)＝64。
步驟7中，采用任何可接受的方法，將步驟6形成的肽混合物進(jìn)行純化。例如，可采用凍干法和滲析法，并根據(jù)需要重復(fù)多次以確保肽的純度。也可以采用硅膠純化或其它肽分離的方法。
步驟8涉及確定肽混合物的組合物。這是一個(gè)質(zhì)量控制步驟，當(dāng)所得肽混合物是一種新的肽混合物，還沒有開發(fā)出常規(guī)純化方法時(shí)，該步驟顯得更為重要。當(dāng)整個(gè)程序都完成，對(duì)某一具體的疫原性肽混合物進(jìn)行精制時(shí)，可選擇該步驟?？蛇M(jìn)行氨基酸分析以確保所需基酸包含在HEC中。而且，可以采用HEC的SDS聚酰胺凝膠電泳(PAGE)來確認(rèn)HEC中是否包含預(yù)定分子量范圍的肽。
步驟9用以確定肽混合物的免疫性。再一次，如果合成的HEC是第一次得到，則采用該步驟是有利的。然而，當(dāng)HEC的免疫性已知后，則無需再次確認(rèn)每次合成物的有效性。為了測試免疫性，將純化的HEC與適宜的藥用載體以及適于人類使用的佐劑相混合。將該組合物施用于小鼠和/或恒河短尾猴以確定免疫性，如果構(gòu)成了多個(gè)不同的HEC，則用以鑒定免疫原HEC組合物。在這個(gè)意義上，需要獲得感染病源體主體的血清，然后測試血清中抗HECs的反應(yīng)性以保證HECs的抗原性。
通常，制備HEC的方法源于這樣的原理，即發(fā)現(xiàn)一種病源體的體內(nèi)分離物中具有很多種蛋白，其相當(dāng)于免疫原表位(如，那些激發(fā)T輔助性、CTL、和/或抗體應(yīng)答的蛋白)。這些序列可以從數(shù)據(jù)庫和/或同行閱讀的科學(xué)性出版物中獲得，然后校準(zhǔn)?？勺儼被嵛稽c(diǎn)被鑒定為可變殘基，以及占據(jù)每個(gè)可變殘基位點(diǎn)的不同氨基酸。在天然存在的20種氨基酸中，可變位點(diǎn)通常只被幾個(gè)不同的氨基酸所占據(jù)。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，采用固相肽合成和Fmoc化學(xué)，根據(jù)以下原則確定加入到特定步驟的氨基酸(1)合成中偶合步驟中使用的氨基酸混合物不超過4種氨基酸，(2)任一偶合步驟中使用的每種氨基酸數(shù)量是基于出現(xiàn)在可變殘基位點(diǎn)的每種氨基酸的頻率確定的，該頻率被舍入到最接近25％的數(shù)值，(3)如果兩種或更多種氨基酸出現(xiàn)在一位點(diǎn)的頻率低于25％，且這些氨基酸是化學(xué)結(jié)構(gòu)或性質(zhì)相似的，那么這些氨基酸的頻率將被累計(jì)，再舍入到最接近其值的25％，只添加這些氨基酸中出現(xiàn)頻率最高的氨基酸，以及(4)通過數(shù)學(xué)計(jì)算估計(jì)混合物中包含100種或更少的表位變體。
在每一個(gè)可變位點(diǎn)處，通過加入計(jì)算重量的氨基酸混合物，使加入的氨基酸與初鏈上的在先氨基酸相鏈接。加入比例通過測定體內(nèi)已知序列而確定。因此，一種合成方法可以合成出全部的可變表位。為了證明HEC中的混合肽確實(shí)代表了所有的變體，對(duì)全部肽進(jìn)行氨基酸測序以確證所需氨基酸的存在。
除了用于制備抗病疫苗以外，基于某一病源體的高可變表位的HECs還可用于診斷不易被常規(guī)血清檢測法診斷出的病源體感染。當(dāng)缺乏“廣泛性”抗原時(shí)，就可能發(fā)生上述不易被檢測的情況，所述的“廣泛性”抗原是指其能夠被所有感染個(gè)體的抗血清所識(shí)別而無需考慮個(gè)體所感染的病原體的菌株類型。
本發(fā)明還能用于制備組合物(或疫苗)，該組合物被用于免疫主體，如人類、靈長目、或其它動(dòng)物，并能夠在主體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生預(yù)防性抗體。將編碼這些抗體的基因鑒定并分離出，基因產(chǎn)品能夠依次被用作治療劑，用于治療組合物所針對(duì)的病原體感染的生物體。
HEC可以與各種免疫調(diào)節(jié)劑一同組成，以激發(fā)免疫系統(tǒng)的各種效應(yīng)器，如CTL應(yīng)答或粘膜免疫應(yīng)答。
本發(fā)明涉及一種制備HEC的方法，該HEC體現(xiàn)了體內(nèi)蛋白表位變體的序列。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，一種病原體的體內(nèi)分離物的蛋白序列可從文獻(xiàn)和/或數(shù)據(jù)庫中獲得。校準(zhǔn)該序列，尤其是校準(zhǔn)包含免疫原表位的蛋白區(qū)域。對(duì)目標(biāo)表位的每一個(gè)位點(diǎn)出現(xiàn)的氨基酸的頻率進(jìn)行計(jì)算，使混合物只包含出現(xiàn)頻率高于閾頻率的氨基酸。該閾頻率典型為約10至約30。無論高于上述閾頻率的氨基酸的數(shù)目有多少，在合成的偶合步驟中使用的氨基酸不超過4種氨基酸。
偶合步驟所加入的氨基酸頻率可以是舍入后的頻率或是其本來頻率。如果是舍入頻率，該頻率取其最接近的5％、10％或25％，以方便計(jì)算。如果一個(gè)位點(diǎn)上的兩種或更多種氨基酸出現(xiàn)的頻率都低于25％，而它們?cè)诨瘜W(xué)結(jié)構(gòu)或性質(zhì)上屬于相似氨基酸，這些氨基酸的頻率可被累計(jì)并可進(jìn)行舍入。這種情況下，只能加入這些氨基酸中最頻繁出現(xiàn)的氨基酸，其加入比例與累計(jì)頻率相當(dāng)。計(jì)算出的合成后的肽混合物具有約100或更少的不同種肽。
混合物的合成是通過將出現(xiàn)頻率(或舍入頻率)高于閾頻率的氨基酸以其頻率相當(dāng)?shù)牧吭诿總€(gè)氨基酸偶合步驟中進(jìn)行偶合而實(shí)現(xiàn)。以該方法，肽混合物的制備采用的是單一合成路徑。對(duì)該混合物進(jìn)行分析以確保組合物、抗原性和免疫原性。對(duì)用于衍生肽的蛋白質(zhì)，該混合物能夠產(chǎn)生與所衍生肽的蛋白質(zhì)的廣泛免疫反應(yīng)，混合物中的每種肽都具有一序列，該序列相應(yīng)于替代混合物所基于的表位的氨基酸變體。
本發(fā)明的肽混合物可以通過肽之間的交聯(lián)而構(gòu)成?；蛘?，混合物中的肽可以被聯(lián)于支撐聚合物上，該聚合物可以是合成的或天然的聚合材料，如載體蛋白。支撐聚合物的范例為衍生肽混合物的蛋白。有利地，將肽或肽混合物與支撐聚合物交聯(lián)或結(jié)合有利于吸引免疫系統(tǒng)對(duì)肽混合物的注意，由此增強(qiáng)肽混合物的免疫性。這種方法還有利于肽混合物自身不足以產(chǎn)生免疫性的情況，通過結(jié)合或交聯(lián)可以增強(qiáng)免疫性而達(dá)到有效水平。本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)方法可被用于制備交聯(lián)劑或?qū)㈦呐c該載體結(jié)合。
本發(fā)明的診斷試劑盒包含有效量的HEC，其能與感染HEC所針對(duì)的病原體的生物體內(nèi)的抗體產(chǎn)生免疫反應(yīng)。肽混合物中的每種肽具有一序列，該序列相當(dāng)于替代與病原體所衍生的一種蛋白質(zhì)相同的免疫原表位的氨基酸變體。
本發(fā)明的治療用免疫原組合物的制備可以通過制備HEC，用HEC對(duì)動(dòng)物，如靈長目進(jìn)行免疫，獲得抗體和基因而完成，該基因用于表達(dá)被誘導(dǎo)產(chǎn)生的所述抗體。這樣的免疫原組合物或編碼由免疫產(chǎn)生的抗體的基因信息可被施用于主體中。
本發(fā)明所使用的蛋白表位可以是來自人類1型或2型免疫缺陷病毒(HIV-1/2)、流感、人類乳頭狀瘤(HPV)、瘧疾、登革熱或旋毛蟲中的一種蛋白表位。也可以是其它病原體的蛋白表位。
HEC或肽混合物可被懸浮于任何藥用載體中。例如，HEC可被懸浮于鹽水中。HEC還可與佐劑混合。
本發(fā)明涉及一種疫苗，其具有兩種或多種HECs，該HECs是基于來自一種病原體的一種或多種蛋白而制得，所述病原體包含一種或多種表位，所述肽混合物就是以這些表位而衍生的。HECs的量可以是等摩爾的。等摩爾的所述肽混合物被交聯(lián)或連接到支撐聚合物上。
在所述混合物的位點(diǎn)上添加氨基酸的頻率只由該位點(diǎn)氨基酸的頻率決定，而與蛋白序列或分離物的結(jié)構(gòu)或長度無關(guān)。例如，如果一表位具有10個(gè)序列，其長度各自完全不同，決定在混合物的某一位點(diǎn)出添加氨基酸的頻率只由該肽混合物所基于的表位中該位點(diǎn)上的不同氨基酸的全部數(shù)目來決定。一旦序列被校準(zhǔn)后，無論這10個(gè)序列的長度如何，如果這10個(gè)序列的第二個(gè)位點(diǎn)上都具有同一氨基酸，那么100％的該氨基酸將被用于肽混合物的合成中。
當(dāng)頻率被四舍五入到其最接近的25％(或5％、10％或其它所選數(shù)值)時(shí)，本領(lǐng)域技術(shù)人員傳統(tǒng)上的認(rèn)識(shí)是任何兩個(gè)整數(shù)的中間值都會(huì)被入到其上限值，而任何低于該中間值的數(shù)值都會(huì)被舍為其下限值。例如，出現(xiàn)在蛋白表位第三位點(diǎn)處的氨基酸占所有位點(diǎn)校準(zhǔn)序列的30％，則其在該位點(diǎn)的舍入頻率為25％。如果以38％的頻率出現(xiàn)在表位的校準(zhǔn)序列中，則其在肽混合物中該位點(diǎn)處的頻率為50％。將出現(xiàn)頻率為12％的氨基酸舍入最接近25％的數(shù)值時(shí)，其應(yīng)被舍至0％，如果沒有其它相似氨基酸可將該頻率12％進(jìn)行累計(jì)的話，該氨基酸將因此不會(huì)被包含在混合物中。
雖然，如實(shí)施例所描述的，本發(fā)明所設(shè)計(jì)的HECs是用于抗HIV-1、HCV和流感，但本發(fā)明還可用于制備抵抗由任何具有表位變體的人類或動(dòng)物病原體所導(dǎo)致疾病的疫苗。本發(fā)明尤其利于用于抵抗由于多種表位變體而導(dǎo)致的難于診斷并防御的病原體。這些病原體包括，但不限于HIV-2、HPV、瘧疾、登革熱和錐蟲病。
本發(fā)明的上述實(shí)施例只是用于舉例而已。在不超出本發(fā)明的范圍下，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠進(jìn)行有效變換，如利用可選擇方案、修改和變換方式，但本發(fā)明的保護(hù)范圍只由所附權(quán)利要求而限定。
總方法以下方法被用于本發(fā)明，尤其參照下述實(shí)施例進(jìn)行說明。
肽的合成通過9-芴甲氧羰基(Fmoc)化學(xué)，利用高容量(0.7mmol/g)Knorr樹脂與1％二乙烯基苯交聯(lián)劑，進(jìn)行肽混合物的合成。該樹脂用50％(v/v)哌啶N′，N′-二甲基甲酰胺(DMF)溶液中和兩次。隨后用DMF和甲醇洗滌。加入由頻率計(jì)算所得的適宜摩爾量的氨基酸。室溫下進(jìn)行偶合2個(gè)小時(shí)。再次用DMF和甲醇洗滌樹脂。為了用于以后確認(rèn)偶合，用DMF洗滌，用50％(v/v)哌啶DMF進(jìn)行9分鐘的脫保護(hù)。當(dāng)最后的氨基酸偶合之后，用DMF和甲醇洗滌該樹脂。加入90％三氟乙酸(TFA)，5％1，2-乙二醇(EDT)，5％水溶液至樹脂中，以切除肽混合物并脫保護(hù)。在室溫下放置樹脂6-12個(gè)小時(shí)。然后用TFA和甲醇洗滌樹脂。收集含有肽的TFA洗滌液。
用冷乙醚提取肽混合物。氮?dú)夥諊聺饪s肽/TFA溶液(約1ml)。將乙醚(25倍體積)加入到肽溶液中并混合。在干冰上放置5分鐘，在1000Xg下離心樣品5分鐘，除去乙醚。提取過程重復(fù)三次。隨后，用乙酸乙酯∶乙醚(v/v)(1.5∶1)提取肽混合物三次，提取方式與用乙醚提取方式相同。最后一次用薏米提取，殘余物在氮?dú)夥諊聺饪s，再次將肽混合物懸浮于水中，并凍干。
HECs與載體蛋白的結(jié)合合成之后，將一些HECs結(jié)合到載體蛋白上以增強(qiáng)其免疫性。結(jié)合時(shí)采用HEC∶載體蛋白＝100摩爾∶1摩爾。將蛋白和HECs溶于0.5M N-甲基-咪唑中，pH為6.0，濃度為lmg/ml。蛋白和HEC溶液相結(jié)合，加入50摩爾的1-乙基-3-(二甲胺丙基)碳二亞胺(EDC)/摩爾的HEC/蛋白溶液。在20℃下，攪拌混合物30分鐘，然后在5％的乙酸緩沖液中進(jìn)行透析(取舍值為10kDa)。隨后在蒸餾兩次的蒸餾水中透析，凍干疫苗，在20℃下，真空儲(chǔ)存。
動(dòng)物的免疫小鼠選自杰克遜實(shí)驗(yàn)室(Bar Harbor，ME)。用100μg與KLH結(jié)合的單一序列肽(SSP)或HEC，或使用200μg不與載體結(jié)合的肽，對(duì)小鼠進(jìn)行免疫。將免疫原溶解于無菌PBS中使用。初次免疫經(jīng)鼠尾底部下進(jìn)行，第二次免疫是在兩個(gè)星期后以相同方式進(jìn)行。
用HECs或HEC/載體蛋白復(fù)合物對(duì)恒河短尾猴免疫兩次。每次免疫，每只猴子接受溶于250μlPBS和250μl Montanide ISA-51的500μgHECs或HEC/載體蛋白。充分振搖后，將乳液肌內(nèi)注射至三角肌內(nèi)。在初次免疫后的8周后出現(xiàn)反應(yīng)。
ELISA檢測通過標(biāo)準(zhǔn)方法固相酶聯(lián)免疫吸附檢測(ELISA)進(jìn)行HEC的應(yīng)答測試。簡言之，將HECs、肽或蛋白質(zhì)溶于0.05M碳酸氫鈉緩沖液中，其pH為9.5，然后置入平底微滴定板(Coming，NY)中。滴定板中，病毒的量為500ng/孔，蛋白質(zhì)為1μg/孔。然后與待檢血清混合，放置，用標(biāo)記堿性磷酸酶的二級(jí)抗體(抗-小鼠或抗-猴子)(Fisher，Pittsburgh，PA)檢測結(jié)合抗原的初級(jí)抗體。用自動(dòng)板讀取器(BioRad 3550)讀取405nm處的光密度。
病毒感染的中和在美國典型培養(yǎng)物中心(ATCC，Rockville，MD)提供的CEMx174細(xì)胞中生長病毒株。HIV-1分離物由NIH，NIAID儲(chǔ)存庫提供。利用該細(xì)胞系測定病毒滴度，并在中和檢測中體現(xiàn)病毒感染性。將血清樣品進(jìn)行系列稀釋(1∶20至1∶2560)，然后加入到96孔板中，一式三份。采用NIH儲(chǔ)存庫提供的HIV-1中和抗體的熱滅活血清作為陽性對(duì)照。陰性對(duì)照包括未經(jīng)試驗(yàn)用的猴子以及經(jīng)免疫的所有試驗(yàn)動(dòng)物的血清。加入50TCID50(50％組織培養(yǎng)物的感染劑量)病毒，將板放置1個(gè)小時(shí)。然后將CEMx174細(xì)胞以1×105細(xì)胞/孔的濃度加入到對(duì)照孔中(只有細(xì)胞)和病毒/抗體孔中。將培養(yǎng)板置入37℃的CO2培育箱中，每天檢測合胞體的形成。8天時(shí)，檢測一部分上清液的逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)活性以測定血清的中和能力，10天時(shí)，使細(xì)胞與XTT，即2，3-雙[2-甲氧基-4-硝基-5-磺苯基]-2H-四唑-5-羧苯胺(5-carboxanilide)(Sigma，St.Louis，MO)接觸以檢測細(xì)胞的存活率。預(yù)先免疫的血清沒有引起RT活性。經(jīng)檢測，RT活性減弱超過50％的最高稀釋度的血清具有強(qiáng)的中和抗體滴度。RT活性減弱30-50％的最高稀釋度的血清具有弱的中和滴度。
T細(xì)胞增生應(yīng)答將抗原和促細(xì)胞分裂劑(PHA-P，Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)，以1至10μg/孔的濃度加入到96孔圓底培養(yǎng)板中，一式三份。取免疫后的猴子血液，用PBS稀釋，比例為1∶2，鋪于在Ficoll梯度(LSM，Organon Teknika Corp.，Durham，NC)上，并在室溫下以200Xg離心30分鐘。收集淋巴細(xì)胞，洗滌，計(jì)數(shù)，然后在包含10％FCS、L-谷氨酸和抗生素的RPMI-1640介質(zhì)中，配成濃度為1×106個(gè)活細(xì)胞/ml。將0.1ml的淋巴細(xì)胞懸浮液加入到含有抗原的96孔板中的每個(gè)孔中。將培養(yǎng)板置入37℃、CO2環(huán)境中。與促細(xì)胞分裂劑一同培養(yǎng)3天或與抗原培養(yǎng)6天，與1μCi的3H-胸苷培養(yǎng)16-18個(gè)小時(shí)，然后立即用WallacTM收集器收集到玻璃纖維過濾紙上。加入閃爍水溶液(Scintisafe，F(xiàn)isher Scientific)，在LKB Wallac 1209Rackβ液體閃爍計(jì)數(shù)器中測量與3H-胸苷一同培養(yǎng)的放射活性。用平均刺激指數(shù)(SI)表示結(jié)果，其是通過計(jì)算多于對(duì)照平均cpm的試驗(yàn)樣品(抗原或促細(xì)胞分裂劑)的每分鐘平均數(shù)量(CPM)而得到。平均SI值高于2的就屬于具顯著性。
CTL檢測將脾細(xì)胞懸浮于RPMI 1640組織培養(yǎng)介質(zhì)中。為了進(jìn)行特異性再刺激，將3×107應(yīng)答細(xì)胞與1.5×106同源的、受抗原脈沖式作用的脾細(xì)胞(以20,000rad進(jìn)行照射)，在25ml組織培養(yǎng)瓶中，于37℃，潮濕CO2氛圍中，10ml介質(zhì)中共同培養(yǎng)5天。對(duì)于非特異性再刺激，應(yīng)答細(xì)胞在含有白介素-2(IL-2)的10IU/ml介質(zhì)中培養(yǎng)過夜。5天后收集受抗原特異性和非特異性刺激的脾細(xì)胞，用介質(zhì)洗滌2次；將這些細(xì)胞作為效應(yīng)器細(xì)胞。用2×10351Cr-標(biāo)記的靶細(xì)胞(被抗原脈沖式作用4個(gè)小時(shí)的同源性脾細(xì)胞)在96圓底孔板中的200μl介質(zhì)中稀釋效應(yīng)器細(xì)胞，然后測試效應(yīng)器的特異性細(xì)胞溶活性。收集100μl上清液，用γ計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)。特異性溶解的細(xì)胞數(shù)計(jì)算如下 用沒有加入效應(yīng)細(xì)胞的靶細(xì)胞中獲得的數(shù)值表示自發(fā)釋放數(shù)。全部釋放數(shù)是洗滌溶液溶解標(biāo)記的靶細(xì)胞后所測定的數(shù)值。
實(shí)施例實(shí)施例1基于HIV-1的HECs由人類逆轉(zhuǎn)錄病毒和AIDS數(shù)據(jù)庫(Los Alamos，1998)提供表位蛋白序列?；谠撔蛄袛?shù)據(jù)，將的HIV-1包膜糖蛋白(gp120)的5個(gè)區(qū)域作為可識(shí)別的高可變區(qū)域。這5個(gè)高可變區(qū)域包括抗體中和、CTL、和/或T輔助細(xì)胞表位(HIV分子免疫數(shù)據(jù)庫，1998)。
中和表位上的每個(gè)位點(diǎn)的可能氨基酸由HIV-1進(jìn)化枝B株的體內(nèi)分離物的序列構(gòu)成而測定，對(duì)每個(gè)表位的序列構(gòu)成進(jìn)行校準(zhǔn)并進(jìn)行評(píng)價(jià)。隨后，使上述獲得的序列數(shù)據(jù)所測定的適宜氨基酸的混合物進(jìn)行合成中和表位的氨基酸偶合步驟。在合成中的每個(gè)氨基酸偶合步驟中重復(fù)該步驟。因此，在一次合成中，制備出一肽混合物，其表現(xiàn)了所有測得的中和表位的體內(nèi)變體。
圖3圖示了本發(fā)明制備的HECs集合的典范示例，其顯示出合成5個(gè)HIV-1HECs時(shí)，加入用于不變和可變殘基的氨基酸。該HECs是基于HIV的包膜糖蛋白(gp120)的高可變區(qū)域的表位序列中所觀察到的可變性。用于人類抗HIV-1疫苗的HECs合成集合包括5個(gè)不同的HIV-1 HECs。每個(gè)HECs包括100個(gè)以下的不同肽。對(duì)于5個(gè)表位中的每一個(gè)，都將HIV-1分化枝B株的gp120序列進(jìn)行校準(zhǔn)以測定可變性的模式和性質(zhì)。將最經(jīng)常觀察到的高可變區(qū)域上的各位點(diǎn)處氨基酸加入肽合成中，其加入應(yīng)遵守本發(fā)明的整體因素。更具體而言，利用Fmoc化學(xué)進(jìn)行合成，其中某特定氨基酸的加入量是被舍入到其最接近的25％，且氨基酸偶合步驟中添加的氨基酸不超過4種。此外，HEC合成中得到的肽的數(shù)目不能超過100個(gè)不同肽。例如，所計(jì)算的這5個(gè)HIV-1 HEC中不同肽的數(shù)目分別為64，32，64，6，和4。
圖3表示了所述肽混合物是指″HIV-1 HEC 1″，其在3，7，12，13，16，和18的氨基酸位點(diǎn)的氨基酸為兩種氨基酸的混合物，而在其它位點(diǎn)都為一個(gè)氨基酸。二項(xiàng)式混合顯示該肽混合物包含共64種不同肽。這是從含有單一氨基酸的每個(gè)位點(diǎn)的因子為1，而6個(gè)可變殘基的每個(gè)因子為2的混合所得出。該表位的長度受到限制，其含有的不同肽不能超過100個(gè)。例如，如果任何附加的氨基酸位點(diǎn)包含超過一種氨基酸，則HIV-1 HEC 1不能進(jìn)一步延伸，因?yàn)槿魏我蜃哟笥?的64種混合，都會(huì)導(dǎo)致肽混合物包含大于100個(gè)不同肽。
用HECs與適于人類使用的佐劑對(duì)兩只恒河短尾猴(Macaca mulatta)進(jìn)行免疫，對(duì)靈長目中的HIV-1 HECs的免疫性進(jìn)行檢測。在先前用5種HIV-1HECs進(jìn)行動(dòng)物免疫76周后，獲取外周血淋巴細(xì)胞。當(dāng)用HECs及代表HIV-1不同株的表位肽進(jìn)行體外刺激時(shí)，PBLs大量增殖，如圖4所示。圖4還顯示了用HIV-1 HECs對(duì)靈長目進(jìn)行免疫，而誘導(dǎo)繁殖出應(yīng)答HIV-1的不同亞型(進(jìn)化枝A-E)的高可變V3環(huán)序列的T細(xì)胞。這些數(shù)據(jù)顯示了強(qiáng)而持久、大范圍反應(yīng)的T輔助細(xì)胞記憶應(yīng)答可以在用HIV-1 HECs對(duì)靈長目免疫后而誘導(dǎo)產(chǎn)生。
圖5顯示了用HIV-1 HECs免疫導(dǎo)致抗5種HECs混合及抗5種HECs單體的持久抗體應(yīng)答。誘導(dǎo)產(chǎn)生直接抗HIV-1不同株gp120表位的廣泛反應(yīng)的T輔助細(xì)胞與結(jié)合HIV-1不同表位的廣泛反應(yīng)性抗體相關(guān)。在第一次免疫后，猴子產(chǎn)生了抗HIV-1 HEC1、HEC3、HEC4和HEC5的抗體，在第二次免疫后，產(chǎn)生了抗所有HECs的抗體。因此，立即用所有HECs進(jìn)行免疫并不能阻止誘導(dǎo)產(chǎn)生對(duì)每種HECs的免疫應(yīng)答。HIV-1 HEC 3是在第一次免疫后的兩周內(nèi)誘導(dǎo)應(yīng)答產(chǎn)生，是所有5個(gè)HECs中產(chǎn)生抗體應(yīng)答最強(qiáng)的。加強(qiáng)免疫后，抗體滴度增加到1∶40,000以上，盡管顯示有緩慢降低趨勢(shì)，其仍保持了22個(gè)月的高滴度。免疫后的猴子的健康狀況評(píng)價(jià)良好，血液生化指標(biāo)也正常。沒有對(duì)間接的或行為方面的癥狀進(jìn)行觀察。利用分化枝B HIV-1株MN、RF和SF2的gp120超變量區(qū)域(V1-V5)中的表位檢測經(jīng)過免疫的猴子血清(包含抗體)中是否存在廣泛反應(yīng)性抗體。圖6表示了用HIV-1 HECs進(jìn)行第二次免疫的兩周后，觀察到抗所有類似物的抗體反應(yīng)。兩只猴子(25705和25598)的血清與所有3種HIV-1分離物中的肽類似物強(qiáng)結(jié)合。更重要的，兩只猴子的抗體能夠識(shí)別并結(jié)合到純化的HIV-1 SF2重組gp120蛋白上。
圖7顯示了對(duì)免疫后的猴子產(chǎn)生的抗體進(jìn)行抗不同HIV-1試驗(yàn)株和靈長目分離物的中和活性的檢測。兩只猴子產(chǎn)生的抗體能夠中和靈長目HIV-1分離物89.6和HIV-1的HIV-1IIIB試驗(yàn)株。將已知的中和抗體血清作為陽性對(duì)照。數(shù)據(jù)顯示用HIV-1 HECs對(duì)靈長目進(jìn)行免疫可誘導(dǎo)產(chǎn)生T輔助細(xì)胞和抗各種HIV-1株的廣泛反應(yīng)性抗體應(yīng)答。圖8還顯示了感染各種HIV-1株(分化枝)的個(gè)體都具有識(shí)別HIV-1 HECs的抗體。
圖4-6的說明表明基于HIV-1包膜蛋白的肽混合物具有免疫原性。圖8顯示了其免疫原性，圖7顯示了其體外抗病毒復(fù)制的預(yù)防作用。
實(shí)施例2基于丙型肝炎病毒表位的HECs本發(fā)明設(shè)計(jì)了抗丙型肝炎病毒(HCV)的兩個(gè)高可變區(qū)域的兩種HECs。病毒體內(nèi)分離物的序列由數(shù)據(jù)庫和同行閱讀的科學(xué)文獻(xiàn)獲得，對(duì)這些表位進(jìn)行校準(zhǔn)。根據(jù)本發(fā)明建立的原則，測定可變殘基礎(chǔ)所包含的氨基酸時(shí)，將氨基酸頻率舍入至其最接近的25％，然后確定偶合步驟中所加入的氨基酸的比例。圖9表示肽混合物中不同位點(diǎn)出現(xiàn)的氨基酸。用標(biāo)準(zhǔn)的Fmoc化學(xué)合成混合物。
尤其是，圖9中的HCV HEC-1構(gòu)成了24-mer，其在殘基4位具有等量的酪氨酸(Y)和組氨酸(H)，在位點(diǎn)17具有等量的亮氨酸(L)和苯丙氨酸(F)，在位點(diǎn)18具有等量的丙氨酸(A)和(T)，在位點(diǎn)19具有等量的絲氨酸(S)和天冬氨酸(N)。不同肽的數(shù)目通過計(jì)算為2×2×2×2(或24)＝16。
實(shí)施例3基于流感病毒表位的HECs對(duì)于流感的多年研究，獲得了重要信息，使得設(shè)計(jì)基于多變流感病毒的HECs成為可能。這些數(shù)據(jù)包括常規(guī)程序，如WHO和CDC這樣的組織先鑒定所預(yù)測的第二年出現(xiàn)的流感病毒變體。簡言之，從全球各種宿主體內(nèi)獲得野生分離物。在對(duì)病毒進(jìn)行類型(A或B)鑒定后，用抗雪貂抗流感抗血清篩選出具交叉反應(yīng)的病毒株，然后將其作為流感疫苗的作用對(duì)象。用一系列雪貂抗血清對(duì)這些病毒株作進(jìn)一步篩選，以確定反應(yīng)類型是否相同。這樣確保不會(huì)發(fā)生變異。每年，大部分流感株的抗原性相同。但總有一些少數(shù)病毒株，產(chǎn)生獨(dú)特的反應(yīng)類型，對(duì)于這些株要進(jìn)行詳細(xì)研究，因?yàn)樗鼈冊(cè)趯硪矔?huì)成為主要病毒株。對(duì)這些獨(dú)特的流感病毒株進(jìn)行氨基酸排序。
圖10描述了本發(fā)明制備的4種流感HECs，它們聯(lián)合呈現(xiàn)了流感A的血凝素包膜蛋白上的抗原遷移結(jié)合位點(diǎn)。這些HECs與其它先前描述的HECs略有不同，其特征在于它們體現(xiàn)了流感包膜蛋白不連續(xù)表位所構(gòu)成的高可變表位。設(shè)計(jì)每種流感HECs所選擇的氨基酸并不是來自病毒表面蛋白上的一段連續(xù)的高可變氨基酸，而是，每種氨基酸都選自病毒蛋白的線性氨基酸序列的不同部分上的氨基酸，這些氨基酸從三維結(jié)構(gòu)的角度考慮其位置是緊鄰的。氨基酸在合成中的百分比來自于基因庫和瑞士蛋白數(shù)據(jù)庫所提供的流感A(包括5種豬流感A序列)的約61種人體分離物的基礎(chǔ)上所獲得的各個(gè)位點(diǎn)上的氨基酸。
與用HIV-1 HECs對(duì)猴子免疫后所獲得的結(jié)果相同，用4種流感HECs誘導(dǎo)產(chǎn)生有效的T輔助細(xì)胞和抗體應(yīng)答(圖11和12)。更重要的，用HECs免疫誘導(dǎo)產(chǎn)生的T輔助細(xì)胞對(duì)所有失活的流感A病毒的體外刺激產(chǎn)生了應(yīng)答(圖11)。
一種呈現(xiàn)了表位的很多略微變化的HEC，能夠有利于確保MHC分子高度多樣性的遠(yuǎn)交種群中形成一種HEC，其包含有能夠結(jié)合任何個(gè)體中代表免疫系統(tǒng)的MHC分子。因此，基于HEC的疫苗克服了MHC的限制。確實(shí)，圖13和14顯示了這一原理。圖13顯示了用一種代表猿免疫缺陷病毒(SIV)表位414-434的序列肽(SSP)對(duì)近交Balb/c小鼠進(jìn)行免疫，導(dǎo)致產(chǎn)生與該肽結(jié)合的抗體。相反，用不同的MHC限制型對(duì)不同基因型的小鼠株(C57b1)進(jìn)行免疫，卻不能產(chǎn)生與該肽結(jié)合的抗體。然而，用基于該肽的HEC對(duì)無應(yīng)答的小鼠(C57b1)和產(chǎn)生應(yīng)答的小鼠Balb/c進(jìn)行免疫，會(huì)導(dǎo)致抗體的產(chǎn)生，該抗體與病毒結(jié)合并與包含該表位的病毒蛋白結(jié)合(圖14)。
實(shí)施例4由SIV衍生的HEC與脂質(zhì)部分的結(jié)合除了能誘導(dǎo)產(chǎn)生有效T細(xì)胞和抗體應(yīng)答以外，將HECs與脂質(zhì)部分結(jié)合后，HECs還能誘導(dǎo)細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞(CTL)的應(yīng)答。用于誘導(dǎo)CTLs的脂質(zhì)-HECs是通過將Pam結(jié)合到與樹脂結(jié)合的基于SIV的HECs上而制得。這是制備脂質(zhì)-肽的標(biāo)準(zhǔn)方法。用脂質(zhì)-HEC和佐劑(脂質(zhì)-HEC)或用PBS和佐劑(A-PBS)對(duì)小鼠進(jìn)行免疫，分離上述小鼠以及未經(jīng)試驗(yàn)用小鼠的脾細(xì)胞，通過與HECs一起培養(yǎng)，而測試抗靶細(xì)胞的CTL活性。圖15中顯示的數(shù)據(jù)體現(xiàn)了減去非特異性裂解后的特異性裂解百分比。所觀察到的特異性裂解來自只接受了兩次免疫的動(dòng)物。僅進(jìn)行一次免疫，觀察不到裂解現(xiàn)象(數(shù)據(jù)未顯示)。圖15表示用脂質(zhì)-HECs免疫誘導(dǎo)產(chǎn)生明顯的CTL活性。
脂質(zhì)-HECs還可利用將棕櫚酸的一種酯與未結(jié)合樹脂的肽結(jié)合的方法進(jìn)行制備。兩種類型的脂質(zhì)-HEC結(jié)合物在誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的作用相同，可以得出結(jié)論，即結(jié)合物的制備方法并不明顯影響脂質(zhì)-HECs的免疫原性。
實(shí)施例5基于HIV1包膜糖蛋白制備組合物圖16顯示了本發(fā)明制備的5種肽混合物(或組合物)的序列。這些序列是基于HIV-1包膜糖蛋白(gp120)的5個(gè)高可變區(qū)域。更具體而言，混合物對(duì)應(yīng)于包含以下氨基酸序列的表位，以HIV-1株B.US.SF2為例gp120-1，氨基酸130-155；gp120-2，氨基酸159-193；gp120-3，氨基酸307-333；gp120-4，氨基酸387-410；以及gp120-5，氨基酸456-471。在可變殘基處，存在的兩個(gè)或更多氨基酸的頻率為25％或更高，將其舍入到其最接近的25％，在合成步驟中加入的兩種或更多種氨基酸的量相當(dāng)于其舍入頻率。
本發(fā)明所形成的肽混合物包括多個(gè)不同肽，其反映了HIV-1包膜糖蛋白(gp120)中最常出現(xiàn)的可變氨基酸，同文獻(xiàn)所報(bào)導(dǎo)的。具體而言，gp120-1至gp120-5是獨(dú)立的肽混合物，其分別包含64，64，32，32和48種變體。
上述實(shí)施例只是用于舉例說明。在不超出本發(fā)明的范圍下，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠進(jìn)行有效變換，如利用可選擇方案、修改和變換方式，但本發(fā)明的保護(hù)范圍只由所附權(quán)利要求而限定。
權(quán)利要求
1.一種制備免疫原肽混合物的方法，其包括步驟獲得病原體的免疫原表位序列，所述免疫原表位序列具有一共同殘基區(qū)域和至少一種可變殘基，該可變殘基使所述序列各不相同；測定免疫原表位序列的可變殘基處出現(xiàn)的不同氨基酸的頻率；合成包含至多約100種不同肽的肽混合物，每種肽具有一共同殘基區(qū)域和至少一種處于可變殘基處的氨基酸，該氨基酸選自在免疫原表位序列的可變殘基處出現(xiàn)頻率大于約10％至約30％的閾頻率的氨基酸。
2.權(quán)利要求1的方法，其中，閾頻率為約12％。
3.權(quán)利要求1的方法，其中，肽混合物包括具有一種可變殘基處的氨基酸的序列，該氨基酸選自免疫原表位序列的可變殘基處出現(xiàn)頻率最高的氨基酸，前提條件是肽混合物中的不同肽的可變殘基處的氨基酸不超過4種氨基酸。
4.權(quán)利要求3的方法，其中合成肽混合物的步驟中，合成的肽中出現(xiàn)在可變殘基處的不同氨基酸相當(dāng)于免疫原表位序列的可變殘基處出現(xiàn)的各氨基酸的頻率。
5.權(quán)利要求1的方法，其中，可變殘基處出現(xiàn)的氨基酸頻率被舍入到其最接近的25％，而只有那些具非零舍入頻率的氨基酸才被包含在肽混合物中的肽可變殘基位點(diǎn)處。
6.權(quán)利要求5的方法，其中，肽混合物中的肽具有一特定氨基酸，其在可變殘基位點(diǎn)處的頻率相當(dāng)于所述特定氨基酸的舍入頻率。
7.權(quán)利要求6的方法，其中，當(dāng)計(jì)算舍入頻率時(shí)，累計(jì)可變殘基處的相似氨基酸頻率，將累計(jì)后的頻率賦予給最頻繁出現(xiàn)的相似氨基酸上。
8.權(quán)利要求7的方法，其中，只有可變殘基處的各相似氨基酸的頻率低于閾頻率時(shí)，才累計(jì)相似氨基酸的頻率。
9.權(quán)利要求7的方法，其中，當(dāng)舍入各相似氨基酸的頻率至其最接近的25％時(shí)，相似氨基酸的頻率只有被累計(jì)才會(huì)達(dá)到25％或更高的舍入頻率。
10.權(quán)利要求7的方法，其中，相似氨基酸選自組群芳香族氨基酸、脂肪族氨基酸、帶脂肪族羥基側(cè)鏈的氨基酸、堿性氨基酸、酸性氨基酸、含酰胺的氨基酸和含硫的氨基酸。
11.權(quán)利要求5的方法，其中，合成步驟采用氨基酸的偶合進(jìn)行，可變位點(diǎn)處通過加入氨基酸而進(jìn)行偶合，其加入量相當(dāng)于其舍入頻率值。
12.權(quán)利要求1的方法，其中，所述免疫原表位序列包括2至7個(gè)可變殘基。
13.權(quán)利要求1的方法，其中，肽混合物包含2至約64個(gè)不同肽。
14.權(quán)利要求1的方法，其中，至少一個(gè)步驟采用了生物信息學(xué)方法學(xué)。
15.一種制備免疫原肽混合物的方法，包括步驟獲得病原體的免疫原表位序列，所述免疫原表位序列具有一共同殘基區(qū)域和至少一種可變殘基，該可變殘基使所述序列各不相同；測定免疫原表位序列的可變殘基處出現(xiàn)的不同氨基酸的頻率；舍入可變殘基處出現(xiàn)的氨基酸的頻率至其最接近的25％；合成包含至多約100種不同肽的肽混合物，每種肽具有一共同殘基區(qū)域和一種處于可變殘基處的氨基酸，該氨基酸選自最頻繁出現(xiàn)在免疫原表位序列的可變殘基處的氨基酸，條件是所述氨基酸的舍入頻率不等于零。
16.權(quán)利要求15的方法，進(jìn)一步包括步驟累計(jì)舍入頻率低于25％的相似氨基酸的頻率；將累計(jì)頻率賦予給最頻繁出現(xiàn)的相似氨基酸；舍入該累計(jì)頻率至其最接近的25％；以及在合成肽混合物的步驟中，加入非零舍入頻率中最頻繁出現(xiàn)的相似氨基酸。
17.對(duì)一種病原體具有免疫原性的肽混合物，所述混合物包括至多約100種不同的肽，每種肽具有一共同殘基區(qū)域和一可變殘基位點(diǎn)；不同肽的共同殘基區(qū)域是病原體免疫原表位序列的不變氨基酸，與其相鄰的是一免疫原表位序列的可變殘基；可變殘基位點(diǎn)被一種氨基酸所占據(jù)，該氨基酸選自免疫原表位序列的可變殘基處最頻繁出現(xiàn)的氨基酸，條件是(a)肽混合物中不同肽的可變殘基位點(diǎn)處的不同氨基酸不超過4種氨基酸；和(b)出現(xiàn)在免疫原表位序列的可變殘基位點(diǎn)處的不同肽中的可變殘基位點(diǎn)處的氨基酸頻率大于約10％至約30％的閾頻率。
18.權(quán)利要求17的肽混合物，其中，出現(xiàn)在可變殘基位點(diǎn)處的氨基酸頻率根據(jù)以下方案確定出現(xiàn)在免疫原表位序列的可變殘基處的氨基酸頻率被舍入到其最接近的25％，和具有非零舍入頻率的不同肽的可變殘基位點(diǎn)處的氨基酸，其頻率相當(dāng)于舍入頻率。
19.權(quán)利要求18的肽混合物，其中，舍入頻率低于25％的相似氨基酸在可變殘基位點(diǎn)處出現(xiàn)的頻率由以下方案確定累計(jì)相似氨基酸的頻率并將其舍入至其最接近的25％；對(duì)于非零舍入頻率，將該舍入頻率賦予給最頻繁出現(xiàn)的相似氨基酸；不同肽的可變殘基位點(diǎn)處最頻繁出現(xiàn)的相似氨基酸的頻率相當(dāng)于舍入頻率。
20.一種結(jié)合的肽組合物，其包括與脂質(zhì)部分結(jié)合的權(quán)利要求17的肽混合物。
21.一種結(jié)合的肽組合物，其包括與載體蛋白部分結(jié)合的權(quán)利要求17的肽混合物。
22.一種包括權(quán)利要求17的多個(gè)肽混合物的免疫原組合物，其中，每個(gè)所述肽混合物對(duì)于相同病原體都具有免疫原性。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的免疫原組合物，其中，所述多個(gè)肽混合物中的每一個(gè)都針對(duì)相同病原體的不同免疫原表位序列，不同免疫原表位序列處于病原體表面上的緊鄰區(qū)域。
24.一種激發(fā)產(chǎn)生抗病原體的免疫應(yīng)答疫苗，其包括權(quán)利要求17的肽混合物和可藥用載體。
25.一種抗病原性疾病的疫苗接種方法，其包括將有效量的權(quán)利要求24的疫苗施用于主體。
26.一種診斷主體感染病原體的方法，該方法包括步驟從所述主體體內(nèi)獲得含有抗體的生物樣品；將該生物樣品與權(quán)利要求1的免疫原肽混合物相接觸，該肽混合物是基于該病原體的免疫原表位序列而制得；以及評(píng)價(jià)所述樣品與所述肽混合物的免疫應(yīng)答。
27.一種檢測主體感染病原體的診斷試劑盒，其包括權(quán)利要求1的免疫原肽混合物，該肽混合物是基于該病原體的免疫原表位序列而制得，和評(píng)價(jià)含有抗體的主體生物樣品與免疫原肽混合物的免疫應(yīng)答的說明書。
28.一種分離對(duì)病原體具有抗性的抗體的方法，其包括步驟給主體施用權(quán)利要求17的肽混合物，和獲取主體中由施用肽混合物而誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體。
29.一種分離編碼對(duì)病原體具有抗性的抗體的基因的方法，其包括步驟給主體施用權(quán)利要求17的肽混合物；獲取主體中由施用肽混合物而誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體；以及分離編碼該抗體的基因。
30.一種分離編碼所有或部分與病原體具有反應(yīng)性的抗體的部分基因或基因性物質(zhì)的方法，包括步驟給主體施用權(quán)利要求17的肽混合物；獲取主體中由施用肽混合物而誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體、與病原體反應(yīng)的部分抗體；以及分離編碼該抗體或部分抗體的所述部分基因或基因物質(zhì)。
31.一種抗病原體的免疫療法，其包括給主體施用由權(quán)利要求30的方法所獲得的部分基因或基因物質(zhì)所編碼的肽或蛋白質(zhì)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用一次合成制備免疫原肽混合物的方法。該肽混合物綜合體現(xiàn)了病原體的免疫原表位的體內(nèi)可變性。該混合物被稱為高可變表位構(gòu)建體(HEC)。用HEC進(jìn)行免疫能夠激發(fā)抗HEC所基于的該病原體的各種株的廣泛免疫反應(yīng)性。
文檔編號(hào)A61P31/16GK1625409SQ02828706
公開日2005年6月8日 申請(qǐng)日期2002年2月8日 優(yōu)先權(quán)日2002年2月8日
發(fā)明者若澤·V·托里斯 申請(qǐng)人:變異生物技術(shù)公司