專利名稱：：高血糖素樣肽1(glp-1)藥物制劑的制作方法
技術領域：
：木發(fā)明涉及藥物制劑的領域。本發(fā)明公開了包含與高血糖素樣肽l(Glucagon-LikePeptide1,GLP-1)組合的—:酮哌嗪(DKP)顆粒的干粉制劑。本發(fā)明可用作治療疾病的藥物制劑，所述疾病如糖尿病、癌癥和肥胖癥但不僅限十這類疾病。本發(fā)明更尤其可用作肺部遞送的藥物制劑。
背景技術：
：文獻中公開的高血糖素樣肽l(GLP-l)是30或31個氨基酸的增泌素(incretin)，其響應來自進餐的脂肪、碳水化合物攝取和蛋白質(zhì)而從腸內(nèi)分泌L細胞屮被釋放。發(fā)現(xiàn)在患有2型糖尿病的個體屮該肽激素的分泌受損，使其成為治療該疾病和其他相關疾病的可能候選者。在無疾病的狀態(tài)下，GLP-1響應經(jīng)口攝取的養(yǎng)分(尤其是糖)從腸L細胞中分泌，刺激來自胰腺的進餐誘導的胰島素釋放，抑制來自肝的高血糖素釋放，以及對消化道和腦的其他效應。胰腺中的GLP-1效應是依賴于葡萄糖的，使得外源肽施用期間的低血糖風險最小化。GLP-1還促進了胰島素生物合成屮的所有步驟，并直接刺激/5-細胞生長和存活以及/3-細胞分化。這些效應的組合導致提高的/3-細胞量。另外，GLP-1受體信號轉(zhuǎn)導導致/5-細胞凋亡的減少，這進一歩有助于提高的/3-細胞量。在胃腸道屮，GLP-1抑制GI活動力，提高響應葡萄糖的胰島素分泌，并降低高血糖素的分泌，從而有助于減少葡萄糖偏差(glucoseexcursion)。嚙齒類中GLP-1的中樞施用已經(jīng)顯示抑制食物攝取，提示外周降低的GLP-1可直接影響腦。這是可行的，因為已經(jīng)顯示循環(huán)的GLP-1能夠達到某些腦區(qū)中的GLP-1受體；即穹隆下器官和最后區(qū)。已知腦的這些區(qū)域涉及食欲和能量穩(wěn)態(tài)的調(diào)解。有趣的是，胃膨脹激活孤束的動眼神經(jīng)核中含GLP-1的神經(jīng)元，預示著中樞表達的GLP-1作為食欲抑制劑的作用。這些假設由使用GLP-1受體拮抗劑一一毒蜥外泌肽(9-39)的研究支持，所述研究中觀察到相反作用。在人中，施用的GLP-1具有飽足效應(Verdichetal.,2001)，當在6周期間通過連續(xù)的皮下灌輸提供時，糖尿病患者顯示食欲降低，這導致體重的顯著減輕(Zanderetal.,2002)。GLP-1還已顯不在患有2型糖尿病的患者中有效，當作為連續(xù)皮下灌輸提供時，其提高胰島素分泌并使得禁食和餐后血糖二者正?；?Naucketal.,1993)。另外，GLP-1的灌輸已經(jīng)顯示降低下述患者的葡萄糖水平先前用非胰島素口服藥物治療的患者和磺酰脲治療失敗后需耍胰島素治療的患者(Naucketal.,1993)。然而，如本領域中和下而本文中所記錄到的，單一皮下注射GLP-1的作用提供了令人失望的結果。盡管達到了免疫反應性GLP-1的^血漿水平，但是胰島素分泌快速地返回處理前的位，血糖濃度未被正常化(Naucketal.,1996)。只有進行重復的皮下施用時，對禁食血糖的作用才能夠比得上靜脈施用(Naucketal.,1996)。連續(xù)皮下施用6周顯示降低禁食和餐后葡萄糖濃度并降低HbAlc水平(Zanderetal.,2002)。單一皮下注射GLP-1的短暫效果與其循環(huán)的不穩(wěn)定性相關。有證據(jù)表明GLP-1由血漿體外代謝，酶二肽基肽酶-IV(DPP-IV)負責該降解(Mentleinetal.,1993)0考慮到GLP-1在糖尿病患者中的生理學顯著性和外源GLP-1在健康受試者和2型糖尿病受試者二者中被快速氨基酸末端降解的事實，許多研究已經(jīng)致力于操作GLP-1的體內(nèi)穩(wěn)定性作為治療糖尿病的抗糖尿病劑的新穎途徑的可能性(Deaconetal.,2004)。己經(jīng)研究了兩種獨立的途徑1)開發(fā)對酶降解不敏感的GLP-1類似物，和2)使用選擇性酶抑制劑防止體內(nèi)降解并提高完整的、生物活性肽的水平。已經(jīng)在臨床試驗屮研究了抗降解7的、名為"增泌素模擬物"的長效GLP-1類似物(例如Liraglutide(NovoNordisk,Copenhagen,丹麥)；exenatide(毒蜥夕卜泌肽-4;Byetta)(AmylinInc.,SanDiego,CA)禾口exenatide-LAR,EliLilly,Indianapolis,IN)。抑制負責增泌素降解的酶的二肽基肽酶IV抑制劑(例如由Novartis,Basel,瑞士開發(fā)的Vildagliptin(Galvus))禾口由Merck,WhitehouseStation,NewJersey開發(fā)的Januvia(sitagliptin))也在研究中(Deaconetal"2004)。因此，GLP-1的多種作用模式(例如提高的胰島素釋放、延遲的胃排空和提高的飽滿感)與其低的低血糖傾向似乎為它帶來了超過目前可獲得的療法的優(yōu)點。然而，盡管GLP-1治療中有這些途徑/進歩，目前糖尿病患者可獲得的藥物均不能夠在所有的患者中達到目的(HbAlc、禁食血糖、葡萄糖偏差)，且它們均不能避免副作用如毒性、低血糖、體重增加、惡心和來自嘔吐的壓力。因此在本領域中，仍然需要作為藥物施用時具有長期效用和最優(yōu)吸收的穩(wěn)定的GLP-1制劑。
發(fā)明內(nèi)容用作藥物的穩(wěn)定的、可吸入的高血糖素樣肽l(GLP-l)制劑是木領域缺乏的。為了克服本領域中的缺陷，本發(fā)明提供了與二酮哌嗪(DKP)顆粒組合的、作為藥物的GLP-1制劑。因此，在本發(fā)明的具體的實施方案中，提供了包含GLP-1分子和二酮哌嗪或其可藥用鹽的干粉組合物。在其他實施方案中，本發(fā)明的干粉組合物包含選自下組的GLP-1分子，所述組由天然GLP-l、GLP-1代謝產(chǎn)物、GLP-1類似物、GLP-1衍生物、二肽酰-肽酶-IV(DPP-IV)保護的GLP-1、GLP-1模擬物、毒蜥外泌肽(exendin)、GLP-1肽類似物或生物合成的GLP-1類似物組成。還在本發(fā)明的乂一實施方案中，干粉組合物包含具有式2，5-二酮-3,6-二(4-X-氨丁基)哌嗪的二酮哌嗪，其中X選自由琥珀酰基、戊二酰基、馬來?；透获R?；M成的組。在另一實施方案中，干粉組合物包含二酮哌嗪鹽。還在木發(fā)明的另一實施方案中提供了干粉組合物，其中二酮哌嗪為2，5-二酮-3,6-二(4-富馬酰-氨丁基)哌嗪。本發(fā)明還包括干粉組合物，其中GLP-1分子為天然的GLP-1或酰胺化的GLP-1分子，其中酰胺化的GLP-1分子是GLP-l(7-36)酰胺。還在本發(fā)明的另一具體的實施方案中，提供了用于制備包含GLP-1分子和二酮哌嗪的顆粒的方法，所述方法包括步驟提供包含GLP-1分子的GLP-1溶液；提供能形成顆粒的二酮哌嗪溶液或二酮哌嗪顆粒的懸浮液；和將GLP-1溶液與二酮哌嗪溶液或懸浮液組合。在本發(fā)明的其他具體的實施方案中，用于制備包含GLP-1分子和二酮哌嗪的顆粒的方法還包括通過凍干法、過濾或噴霧干燥從溶液或懸浮液中去除溶劑。還在又一實施方案中，本發(fā)明的顆粒通過去除溶劑形成，或在去除溶劑之前形成。在本發(fā)明的一個實施方案中，在用于制備具有GLP-1分子和二酮哌嗪的顆粒的方法中，提供了選自下組的GLP-1分子，所述組由天然的GLP-1、GLP-1類似物、GLP-1衍生物、二肽基肽酶-IV(DPP-IV)保護的GLP-1、GLP-1模擬物、毒蜥外泌肽、GLP-1肽類似物或牛物合成的GLP-1類似物組成。在另一實施方案中，用于制備具有GLP-1分子和二酮哌嗪的顆粒的方法包括以顆粒懸浮液形式提供提供的二酮哌嗪。在乂一實施方案中，二酮哌嗪在溶液中提供，且該方法包括調(diào)節(jié)溶液的pH，從向沉淀二酮哌嗪并形成顆粒。在本發(fā)明的其他具體實施方案中，GLP-1溶液處于約1yg/ml-50mgZml、更優(yōu)選地約O.lmg/ml-10mg/ml的濃度。還在本發(fā)明另一具體的實施方案中，GLP-1溶液處于約0.25mg/ml的濃度。在用于制備含GLP-1分子和二酮哌嗪顆粒的另一方法中，該方法還包括向溶液中添加一種試劑，其中所述試劑選自鹽、表面活性劑、離子、滲透物(osmolyte)、離液劑(chaotrope)和感膠離子(lyotrope)、酸、堿和有機溶劑。該試劑促進GLP-1和二酮哌嗪顆粒之間的締合，還改進GLP-1分子的穩(wěn)定性和/或藥物動力學。在本發(fā)明的一些實施方案中，該試劑為鹽，例如但不限于氯化鈉。還考慮了該試劑可以是表面活性劑，例如但.不限于Tween、Triton、pluronicacid、CHAPS、cetrimide禾口Brij、H(CH2)7S04Na。該試劑可以是離子，例如陽離子或陰離子。該試劑可以是滲透物(穩(wěn)定劑)，例如但不限于己二醇(Hexylene-Glycol,Hex-Gly)、海藻糖、甘氨酸、聚乙二醇(PEG)、三甲胺n-氧化物(TMAO)、甘露醇和脯9氨酸。該試劑可以是離液劑或感膠離子，例如但不限于氯化銫、檸檬酸鈉和硫酸鈉。該試劑可以是有機溶劑，例如選自甲醇(MeOH)、乙醇(EtOH)、三氟代乙醇(TFE)和六氟異丙醇(HFIP)的醇。在本發(fā)明的另一具體實施方案中，考慮了用于制備含GLP-1分子和二酮哌嗪的顆粒的方法，其中該方法包括將顆粒懸浮液的pH調(diào)節(jié)至約4或更大。在本發(fā)明的其他實施方案中，用于制備顆粒的方法包括GLP-1分子和二酮哌嗪，其中顆粒中的GLP-1分子具有更大的穩(wěn)定性。本發(fā)明中還考慮了對需要的受試者施用有效量的GLP-1分子的方法，包括對受試者提供GLP-1/二酮哌嗪顆粒。該施用方法可以是靜脈內(nèi)、皮下、經(jīng)口、經(jīng)鼻、經(jīng)頰、經(jīng)直腸或通過肺部遞送，但不僅限于此。在一個實施方案中，施用方法是通過肺部遞送。還在木發(fā)明的又一實施方案屮，施用的方法包括治療選自下組的病癥或疾病，所述組由糖尿病、局部缺血、再灌注組織損傷、血脂障礙、糖尿病性心臟病、心肌梗塞、急性冠狀動脈綜合征、肥胖癥、手術后的分解代謝改變、"血糖癥、過敏性腸綜合征、中風、神經(jīng)變性病癥、記憶和學習障礙、胰島細胞移植和再牛.性治療組成。在木發(fā)明的另一實施方案屮施用GLP-l/一.酮哌嗪顆粒組合物的方法導致改進的GLP-1藥物代謝動力學半衰期和生物利用度。還在木發(fā)明的又一具體實施方案中，提供了制備具有改進的藥物代謝動力學模式的干粉組合物的方法，該方法包括步驟提供GLP-1分子的溶液；提供能形成顆粒的二酮哌嗪；形成顆粒；和將GLP-1與二酮哌嗪組合；和之后通過干燥的方法去除溶劑，獲得干粉，其中所述干粉具有改進的藥物代謝動力學模式。經(jīng)改進的藥物代謝動力學模式包括提高的GLP-1半衰期和/或經(jīng)改進的GLP-1生物利用度。提高的GLP-1半衰期大于或等于7.5分鐘。在本發(fā)明的一個實施方案中，提供了包含GLP-1分子和二酮哌嗪組合物或其可藥用鹽的干粉組合物。在另一實施方案中，GLP-1分子選自由以下組成的組天然GLP-1、GLP-1代謝產(chǎn)物、GLP-1類似物、GLP-1衍生物、二肽酰-肽酶-IV(DPP-IV)保護的GLP-1、GLP-1模擬物、GLP-1肽類似物或生物合成的GLP-1類似物。在本發(fā)明的一個實施方案中，二酮哌嗪是具有式2,5-二酮-3,6-二(4-X-氨丁基)哌嗪的二酮哌嗪，其中X選自由琥珀?；⑽於；ⅠR來?；透获R?；M成的組。在另一實施方案中，二酮哌嗪是二酮哌嗪鹽。在另一實施方案中，二酮哌嗪是2，5-二酮-3，6-二(4-富馬酰-氨丁基)哌嗪。在木發(fā)明的一個實施方案中，GLP-1分子是天然的GLP-1。在另一實施方案中，GLP-1分子是酰胺化的GLP-1分子。在另一實施方案中，酰胺化的GLP-1分子是GLP-l(7-36)酰胺。在本發(fā)明的一個實施方案中，提供了形成包含GLP-1分子和二酮哌嗪的顆粒的方法，該方法包括步驟提供GLP-1分子；提供下述形式的二酮哌嗪，所述形式選自能形成顆粒的二酮哌嗪、二酮哌嗪顆粒及其組合；和將GLP-1分子與二酮哌嗪以共溶液的形式組合，其中形成包含GLP-1分子和二酮哌嗪的顆粒。在本發(fā)明的一個實施方案屮，該方法還包括通過凍干法、過濾或噴霧干燥從所述共溶液中去除溶劑。在另一實施方案中，通過去除溶劑形成包含所述GLP-1分子和二酮哌嗪的顆粒。在另一實施方案屮，在去除溶劑之前形成包含所述GLP-1分子和二酮哌嗪的顆粒。在另一實施方案屮，GLP-1分子選自由以下組成的組天然的GLP-1、GLP-1類似物、GLP-1衍生物、二肽基肽酶-IV(DPP-IV)保護的GLP-1、GLP-1模擬物、GLP-1肽類似物或生物合成的GLP-1類似物。在另一實施方案中，GLP-1分子以溶液的形式提供，所述溶液包含約l/xg/ml-50mg/ml的GLP-1濃度。在另一實施方案中，GLP-1分子以溶液的形式提供，所述溶液包含約0.1mg/ml-10mg/ml的GLP-1濃度。在另一實施方案中，GLP-1分子以溶液的形式提供，所述溶液包含約0.25mg/ml的GLP-1濃度。在本發(fā)明的另一實施方案屮，二酮哌嗪以二酮哌嗪顆粒懸浮液的形式提供。在另一實施方案中，二酮哌嗪以包含能形成顆粒的二酮哌嗪的溶液的形式提供，該方法還包括調(diào)節(jié)溶液的pH以形成二酮哌嗪顆粒。在另一實施方案中，該方法還包括向所述溶液或懸浮液中添加下述試劑，其屮所ii述試劑選自由鹽、表面活性劑、離子、滲透物、離液劑和感膠離子、酸、堿和有機溶劑組成的組。在另一實施方案中，該試劑促進GLP-1分子和二酮哌嗪顆?；蚰苄纬深w粒的二酮哌嗪之間的締合。在另一實施方案中，該試劑改善GLP-1分子的穩(wěn)定性或藥物動力學。在另一實施方案中，該試劑為氯化鈉。在本發(fā)明的另一實施方案中，該方法還包括調(diào)節(jié)懸浮液或溶液的pH。在另一實施方案中，pH被調(diào)節(jié)至約4.0或更大。還在另一實施方案中，顆粒中的GPL-1分子具有比天然GPL-1更大的穩(wěn)定性。在另一實施方案中，共溶液包含約1Atg/ml-50mg/ml的GLP-1濃度。在另一實施方案中，共溶液包含約0.1mg/ml-10mg/ml的GLP-1濃度。在另一實施方案屮，共溶液包含約0.25mg/ml的GLP-1濃度。還在木發(fā)明的另一實施方案中，該方法還包括向共溶液中添加下述試劑，其屮所述試劑選自由鹽、表面活性劑、離子、滲透物、離液劑和感膠離子、酸、堿和有機溶劑組成的組。在另一實施方案屮，該試劑促進GLP-1分子和二酮哌嗪顆?；蚰苄纬深w粒的一-酮哌嗪之間的締合。在另一實施方案中，該試劑改善GLP-1分子的穩(wěn)定性或藥物動力學。在另一實施方案屮，該試劑為氯化鈉。在另一實施方案中，該方法還包括調(diào)節(jié)共溶液的pH。在另一實施方案中，pH被調(diào)節(jié)至約4.0或更大。在本發(fā)明的一個實施方案中，提供了對需要的受試者施用有效量的GLP-1分子的方法，包括對受試者提供包含GLP-1和二酮哌嗪的顆粒。在另一實施方案中，通過靜脈內(nèi)、皮下、經(jīng)口、經(jīng)鼻、經(jīng)頰、經(jīng)直腸或通過肺部遞送完成提供。在其他實施方案屮，通過肺部遞送完成提供。在另一個實施方案中，該需要包括對選自下組的病癥或疾病的治療，所述組由糖尿病、局部缺血、再灌注組織損傷、血脂障礙、糖尿病性心臟病、心肌梗塞、急性冠狀動脈綜合征、肥胖癥、手術后的分解代謝改變、高血糖癥、過敏性腸綜合征、中風、神經(jīng)變性病癥、記憶和學習障礙、胰島細胞移植和再生性治療組成。在另一實施方案屮，顆粒的提供導致與天然GLP-1分子相比改進的GLP-1藥物代謝動力學半衰期和生物利用度。在本發(fā)明的一個實施方案中，提供了形成具有改進的GLP-1藥物代謝動力學模式的粉末組合物的方法，該方法包括步驟提供GLP-1分子；提供溶液中的能形成顆粒的二酮哌嗪；形成二酮哌嗪顆粒；將GLP-1分子與溶液組合形成共溶液；和通過噴霧干燥從共溶液中去除溶劑，形成具有改進的GLP-1藥物代謝動力學模式的粉末。在另一實施方案中，改進的GLP-1藥物代謝動力學模式包括提高的GLP-1半衰期。在另一實施方案中，提高的GLP-1半衰期大于或等于7.5分鐘。在另一實施方案中，改進的GLP-1藥物代謝動力學模式包括與天然GLP-1相比改進的GLP-1生物利用度。以下附圖構成本說明書的一部分，用于進一歩說明木發(fā)明的特定方面。通過以下附圖，并結合具體實施方式的詳細描述，可以更好地理解本發(fā)明。圖1A-1D.GLP-1在多種濃度下的結構分析(pH4，20°C)。圖1A-GLP-1的遠-UV圓二色性(CD)闡述了隨著濃度的提高，肽的二級結構從主要為無組織的構象轉(zhuǎn)化為螺旋構象。圖IB-近-UVCD闡述了三級結構隨著提高的肽濃度而增加，提示GLP-1的自身締合。圖1C-由280nm處色氨酸激發(fā)引起的多種濃度下GLP-l(pH4，20。C)的熒光發(fā)射。圖ID-多種濃度下GLP-l(pH4,20。C)的透射FTIR。1656cm—1處的酰胺I條帶表明在2mg/mL的濃度下GLP-1具有ce-螺旋結構。圖2A-2D.在多種離子強度下(pH4,20。C)低濃度GLP-1的結構分析。圖2A-1.0mg/mLGLP-1的遠-UVCD闡明了提高鹽濃度將無序的GLP-1結構轉(zhuǎn)化為更有序的"-螺旋結構。圖2B-1.0mg/mL肽的近-UVCD證實了提高NaCl濃度也增強GLP-1的三級結構。圖2C-在280nm處色氨酸激發(fā)后多種NaCl濃度下(pH4，20°C)1.0mg/mLGLP-1的內(nèi)熒光發(fā)射。在高肽濃度下，最大值強度降低并遷移至更短的波長，這指示了明確定義的三級結構。圖2D-在多種離子強度下(pH4,20°C)10mg/mLGLP-1的三級結構分析。近-UVCD譜證實提高的離子強度增強了自身締合的GLP-1的三級結構。圖3A-3B.多種溫度下(pH4)10mg/mLGLP-1的結構分析。圖3A-近-UVCD闡明了提高的溫度下GLP-1寡聚物解離。圖3B-多種溫度下(pH4)10mg/mLGLP-1的結構分析。圖3C-多種溫度下(pH4)0.05mg/mLGLP-1的結構分析。遠-UVCD闡明了肽對溫度是不敏感的。圖4A-4B.多種pH下(20。C)GLP-1的結構分析。圖4A-多種pH下(20°C)10mg/mLGLP-1的遠-UVCD。當pH被提高時，自身締合的GLP-1在pH6.3和7.6之間沉淀，但是在pH1.5和11.7時保留螺旋結構。圖4B-放大pH7.6處的譜系揭示GLP-1的二級結構是無序的，由濃度降低引起。圖5.通過HPLC證實的1mg/mLGLP-1對脫酰胺作用和氧化作用二者的抗性。通過將GLP-l在pH10.5時于4(TC孵育5天達到脫酰胺條件。通過將GLP-1在0.1%H202中于室溫下孵育2小時達到氧化條件。圖6A-6B.攪動對1.5mg/mLGLP-1和9.4mg/mLGLP-l(pH4)的三級結構的影響。近-UVCD(圖6A)和GLP-1的熒光發(fā)射(圖6B)均闡明了GLP-1肽的三級結構不由于攪動而顯著改變。樣品在室溫下攪動30和90分鐘并在280nm處色氨酸激發(fā)后收集熒光發(fā)射譜。圖7A-7C.10次凍融循環(huán)對1.6、5.1和8.4mg/mLGLP-1(pH4)三級結構的影響。近-UVCD(圖7A)禾BGLP-1的熒光發(fā)射(圖7B)均顯示肽的三級結構不因為多重凍融循環(huán)而顯著改變。樣品冷凍于-2(TC下并在室溫下解凍。在280nm處色氨酸激發(fā)后收集熒光發(fā)射譜。通過遠-UVCD進行類似的實驗，該實驗顯示11次凍融循環(huán)對10mg/mLGLP-1(pH4)二級結構的影響(圖7C)。圖8A-8B.鹽研究。作為pH和NaCl濃度的函數(shù)的GLP-1/FDKP負載曲線(圖8A)。在5mg/mLFDKP禾P0.25mg/mLGLP-1下進行負載。NaCl濃度以mM表示。圖8B-作為pH和NaCl濃度的函數(shù)，描述了在重建的無FDKP對照樣品中檢測的GLP-1量。圖9A-9B.表面活性劑研究。作為pH和表面活性劑的函數(shù)的GLP-1/FDKP負載曲線(圖9A)。在5mg/mLFDKP和0.25mg/mLGLP-l下進14行負載。圖9B-作為pH和添加的表面活性劑的函數(shù)，描述了在重建的無FDKP對照樣品中檢測的GLP-1量。圖10A-10D.離子研究。作為pH和離子的函數(shù)的GLP-1/FDKP負載曲線。在5mg/mLFDKP禾卩0.25mg/mLGLP-1下進行負載(圖10A和11C)。離子濃度在圖例中示出(mM)。右側(cè)曲線描述1MNaCl的結果。圖10B禾n10D-作為pH、離子和1MNaCl的函數(shù)，描述了在重建的無FDKP對照樣品中檢測的GLP-1量。圖11-11B.滲透物研究。作為pH的函數(shù)和存在常見穩(wěn)定劑(滲透物)時的GLP-1/FDKP負載曲線(圖11A)。在5mg/mLFDKP禾n0.25mg/mLGLP-1下進行負載。圖UB-作為pH和滲透物的函數(shù)，描述了在重建的無FDKP對照樣品屮檢測的GLP-1量。"N/A"表示樣品中不存在滲透物。圖12A-12B.離液劑/感膠離子研究。作為pH3.0(圖12A)和pH4.0(圖12C)下離液劑或感膠離子濃度的函數(shù)的GLP-1/FDKP負載曲線。在5mg/mLFDKP和0.25mg/mLGLP-1下進行負載。圖12B和12D—作為pH的函數(shù)和存在多種離液劑或感膠離子時，描述了在重建的無FDKP對照樣品中檢測的GLP-1量。"N/A"表不樣品屮不存在離液劑或感膠離子。圖13A-13B.醇研究。作為pH和醇的函數(shù)的GLP-1/FDKP負載曲線。在5mg/mLFDKP和0.25mg/mLGLP-1下進行負載。對每種醇評價四種醇濃度，5%、10%、15%和20%v/v(圖13A)。TFE^三氟代乙醇；HFIP=六氟異丙醇。圖13B-作為pH和醇(20%)的函數(shù)，描述了在重建的無FDKP對照樣品中檢測的GLP-1量。圖14A-14B.來自GLP-1/FDKP濃度研究的負載(圖14A)。負載在5mg/mLFDKP下進行，分析的GLP-1濃度列于X軸中。圖14B-多種GLP-1/FDKP配方(放大10000x倍)的掃描電子顯微術(SEM)圖像顯示球形和棒狀GLP-1/FDKP顆粒組成。(圖A)0.5mg/mLGLP-1和2.5mg/mLFDKP;(圖B)0.5mg/mLGLP-1禾卩10mg/mLFDKP;(圖C)20mM氯化鈉、20mM乙酸鉀和20mM磷酸鉀，pH4.0中0.5mg/mLGLP-1和10mg/mLFDKP;和(圖D)20mM氯化鈉、20mM乙酸鉀和20mM磷酸鉀，pH4.0中10mg/mLGLP-1禾口50mg/mLFDKP。圖15.展示脅迫對多種GLP-1/FDKP制劑的影響。圖例指出凍干前GLP-1對FDKP顆粒和溶液中存在的其他組分的質(zhì)量-質(zhì)量百分比。樣品在40。C孵育10天。圖16A-16C.GLP-1的結構。圖16A-描述GLP-1的甘氨酸-延伸的形式(SEQIDNO.l)和酰胺化的形式(SEQIDNO.2)。FIG.16B-抑肽酶對DPPIV活性的抑制。圖16C-DPPIV抑制劑對DPPIV活性的抑制。圖17.在肺灌洗液中孵育后檢測GLP-1。圖18A-18B.描述GLP-1在血漿中的定量。圖18A顯示l:2血漿稀釋液中的定量。圖18B顯示1:10血漿稀釋液中的定量。圖19A-19B.GLP-1禾nGLP-1類似物對細胞存活的影響。GLP-1對大鼠胰腺上皮(ARIP)細胞死亡的影響(圖19A)。在單獨存在和組合存在GLP-1和十字孢堿(Stau)時，錨定蛋白V染色顯示抑制細胞凋亡(圖19B)。GLP-1的濃度為15nM，十字孢堿的濃度為l/zM。圖20.GLP-1類似物毒蜥外泌肽-4對細胞存活力的影響。用0、10、20和40nM毒蜥外泌肽將ARIP細胞處理16、24和48小時。圖21.多種GLP-1/FDKP制劑對十字孢堿誘導的細胞死亡的影響。用GLP-1樣品預處理的ARIP細胞被暴露于5/zM十字孢堿中4小時，并用CellTiter-Gk)TM分析測定細胞存活力。在4。C禾B40。C將樣品脅迫處理4周。右側(cè)顯示的對照樣品(培養(yǎng)基、GLP-1、STAU、GLP+STAU)示出了培養(yǎng)基(不含GLP-1或十字孢堿)中、含GLP-1、含十字孢堿和含GLP-1與十字孢堿時細胞的存活力(注意圖例不適用于對照樣品)。顯不的所有結果是一式三份運行的平均值。圖22A-22B.藥物代謝動力學研究描述使用多種濃度的GLP-1/FDKP制劑在大鼠中單一靜脈注射(IV;圖22A)和肺吹入法(IS;圖22B)。圖例指出分析的制劑中GLP-1對FDKP顆粒的質(zhì)量-質(zhì)量百分比。圖23A-23B.給藥后2小時(圖23A)禾Q6小時(圖23B)用GLP-1/FDKP制劑給藥的大鼠中累積食物消耗的減少。圖24.雄性肥胖Zucker大鼠中通過肺吹入法施用的GLP-1/FDKP的藥16物動力學研究。數(shù)據(jù)描述了對照組(空氣；第1組)和GLP-1/FDKP處理組(第2組)在第0、15、30、45、60和90分鐘的葡萄糖測量結果。圖25.雄性肥胖Zucker大鼠中通過肺吹入法施用的GLP-1/FDKP的藥物動力學研究。數(shù)據(jù)描述了對照組(空氣；第1組)和GLP-1/FDKP處理組(第2組)在第O、15、30、45、60和90分鐘的GLP-1測量結果。圖26.雄性肥胖Zucker大鼠中通過肺吹入法施用的GLP-1/FDKP的藥物動力學研究。數(shù)據(jù)描述了對照組(空氣；第1組)和GLP-1/FDKP處理組(第2組)在第O、15、30、45、60和90分鐘的胰島素測量結果。圖27.雌性大鼠中用通過肺吹入法施用的多種GLP-1濃度進行的GLP-1/FDKP藥物動力學研究。數(shù)據(jù)描述了對照組(空氣；第1組)和分別施用了5%、10%和15%GLP-1的GLP-1/FDKP處押.第2、3和4組在第0、2、5、10、20、30、40和60分鐘的GLP-1測量結果。圖28.雌性大鼠中用通過肺吹入法施用的多種GLP-1濃度進行的GLP-1/FDKP藥物動力學研究。數(shù)據(jù)描述了對照組(空氣；第1組)和分別施用了5%、10%和15%GLP-1的GLP-1/FDKP處理第2、3和4組在第0、2、5、10、20、30、40和60分鐘的FDKP測量結果。圖29.雌性大鼠(『10)中的GLP-1/FDKP藥物動力學研究，所述大鼠連續(xù)4天通過單一每日肺吹入法施用了含15%GLP-1(0.3mgGLP-l)的GLP-1/FDKP。數(shù)據(jù)顯示連續(xù)4天在給藥前、給藥后1、2、4禾n6小時測量的平均食物消耗。圖30.雌性大鼠(『10)中的GLP-1/FDKP藥物動力學研究，所述大鼠連續(xù)4天通過單一每日肺吹入法施用了含15%GLP-1(0.3mgGLP-1)的GLP-1/FDKP。數(shù)據(jù)顯示連續(xù)4天在給藥前、給藥后1、2、4和6小時測量的平均體重。圖31.在猴子中的GLP-1/FDKP毒物代謝動力學研究，所述猴子連續(xù)5天通過每日一次(每天30分鐘)口鼻施用施用了GLP-1/FDKP。數(shù)據(jù)顯示雄性和雌性中GLP-1的血漿濃度峰值(Cmax)。動物接受對照(空氣；第l組)、2mg/kgFDK(第2組)或0.3、1.0或2.0mg/kgGLP-1/FDKP(分別為第3、4禾Q5組)。優(yōu)選的實施方案詳述用作藥物的穩(wěn)定的、可吸入的高血糖素樣肽l(GLP-l)制劑是本領域缺乏的。這歸因于GLP-1肽體內(nèi)的不穩(wěn)定性。GLP-1化合物在大量條件下趨向于保留在溶液中，并且當作為溶液制劑被施用時具有相對短的體內(nèi)半衰期。另外，發(fā)現(xiàn)存在于多種生物學流體如肺和血中的二肽基-肽酶IV(DPP-IV)極大地降低GLP-1分子的生物學半衰期。例如，GLP-l(7-37)的生物學半衰期己經(jīng)顯示為3到5分鐘；見美國專利No.5,118,666。GLP-1也已顯示在胃腸外施用后經(jīng)歷快速的體內(nèi)吸收。類似地，酰胺GLP-1(7-36)被皮下施用時具有約5Q分鐘的半衰期；也參見美國專利No.5,118,666。本領域現(xiàn)有技術中GLP-1組合物的快速清除和短半衰期代表了本發(fā)明克服的缺陷。木發(fā)明通過提供特別適用于肺部遞送的最優(yōu)化的天然GLP-1/FDKP(富馬酰二酮哌嗪)制劑克服了本領域現(xiàn)有技術的缺陷。在其他具體的方面，本發(fā)明提供了天然GLP-1分子的制劑，所述制劑可在體內(nèi)引起GLP-1應答。還考慮了在這類制劑屮使用天然GLP-1的變體。為了克服木領域現(xiàn)有技術的缺陷，木發(fā)明提供了與二酮哌嗪(DKP)顆粒組合的GLP-1的制劑。在本發(fā)明具體的實施方案中，提供了GLP-1/DKP制劑用f施用給受試者。在其他具體的實施方案中，GLP-1/DKP制劑包含富馬酰二酮哌嗪(FDKP)但不僅限于此，并可包括其他KDP(不對稱的DKP、xDKP)如2,5-一.酮-3,6-二(4-琥珀酰基-氨丁基)哌嗪(SDKP)，不對稱的二酮哌嗪，包括僅在DKP環(huán)上一個位置取代的那些(例如FDKP的"單臂"類似物)，和DKP鹽。在本發(fā)明的其他具體的實施方案中，通過肺部遞送施用GLP-1/FDKP制劑。開發(fā)GLP-1分子的治療制劑時，通過使用多種的生物物理學和分析技術評價溶液中GLP-1的結構特征，所述技術包括遠紫外線圓二色性(遠-UVCD)、近紫外線圓二色性(近-UVCD)、內(nèi)熒光、傅立葉變換紅外光譜學(FTIR)、高壓液相色譜(HPLC)和質(zhì)譜(MS)。圓二色性(CD)技術是用于分析多種實驗條件下蛋白質(zhì)結構改變的有力工具，并是木領域公知的。進行這些分析的實驗條件包括濃度、離子強度、溫度、pH、氧化脅迫、18這些分析被設計為表征降解的主要途徑以及確立操作GLP-1肽結構的條件從而達成優(yōu)選的GLP-1/DKP制劑，所述制劑具有想要的藥物代謝動力學(PK)和藥物動力學(PD)特征。觀察到隨著GLP-1濃度提高，肽的二級結構從主要是無組織的構象轉(zhuǎn)化為更螺旋的構象。提高溶液中的離子強度引起GLP-1的結構增加，直到其可逆地沉淀為止。NaCl的存在提高了GLP-1的三級結構，這通過圖2D中所示的近CD條帶的強度提高顯示。這甚至在不顯示自身締合的低肽濃度下發(fā)生。提高的離子強度容易地將無組織的GLP-1轉(zhuǎn)化為a-螺旋形式(如圖2A中朝向208nm和222nm的遠CD最小值遷移所示)和自身締合的構象(如使川提高的鹽和近CD模式的圖2B和2D中向更短波長的色氨酸激發(fā)遷移所示)。溫度和pH有差異地影響GLP-1構象，因為GLP-1的無序結構不被這些參數(shù)中任一個所改變。另一方面，發(fā)現(xiàn)GLP-1的自身締合構象對熱變性是敏感的并其其溶解度對pH是敏感的，如圖4A和4B中所不，該圖顯示在10mg/ml的肽濃度下，在pH6.3-7.6之間GLP-1肽可逆地沉淀。發(fā)現(xiàn)GLP-1的多種構象一般對攪動和多重凍融循環(huán)是穩(wěn)定的。對GLP-1未觀察到脫酰胺，也未觀察到氧化。還在多種條件下觀察了GLP-1對FDKP顆粒的吸附，所述條件包括pH、GLP-1濃度的改變，和多種表面活性劑、鹽、離子、離液劑和感膠離子、穩(wěn)定劑和醇濃度的改變。發(fā)現(xiàn)GLP-1對FDKP顆粒的吸附受pH的強影響，特別是在約pH4.0或更大時發(fā)生結合。發(fā)現(xiàn)其他賦形劑對GLP-1對FDKP顆粒的吸附具有有限的影響。在開發(fā)本發(fā)明的GLP-1/DKP制劑時，評價了可能影響或沖擊其體內(nèi)可遞送性和吸收的大量參數(shù)。這類參數(shù)包括例如GLP-1肽的結構、在某配制條件下分子上的表面電荷、作為制劑的溶解度和穩(wěn)定性，以及對絲氨酸蛋白酶降解的易感性和體內(nèi)穩(wěn)定性；這些均在產(chǎn)生可被容易地吸收且顯示延長的生物學半衰期的制劑時起關鍵的作用。在多種條件下體外和體內(nèi)測試了獲得的GLP-1/FDKP制劑的穩(wěn)定性。通過HPLC分析和基于細胞的測定法分析了GLP-1的穩(wěn)定性。另外，在肺灌洗液(其含有DPP-IV)中檢查了GLP-1的穩(wěn)定性。還發(fā)現(xiàn)天然GLP-119的穩(wěn)定性在溶液中是濃度依賴性的。還使用體外GLP-1生物活性研究用于GLP-1/FDKP負載的研究，并測定了體內(nèi)效力。該策略有助于進一步鑒定領先的GLP-1/FDKP配制方法。另外，基于GLP-1已經(jīng)顯示通過抑制細胞凋亡、刺激^-細胞增殖和胰島再生在提高/3-細胞量中起作用的事實，通過基于細胞的測定法檢査本發(fā)明的GLP-1/FDKP制劑的增殖和抗細胞凋亡潛能。因此，本發(fā)明提供了包含與富馬?；哙?FDKP)組合的天然人GLP-1的最優(yōu)化的制劑，該制劑是穩(wěn)定的并且抗降解。II.GLP-l分子在本發(fā)明具體的實施方案中，提供了最優(yōu)化的制劑，其包含與二酮哌嗪如富馬?；哙?FDKP)組合的天然人高血糖素樣肽l(GLP-l)。木發(fā)明的這類GLP-1/FDKP制劑是穩(wěn)定的并且抗降解。人GLP-1是本領域公知的，并且來源下-遠端回腸(distalileum)中、胰腺中和腦屮L-細胞合成的前高血糖素原(preproglucagon)多肽。GLP-1是30-31個氨基酸的肽，其以兩種分子形式存在7-36和7-37，其中7-36形式是主要的。前"血糖素原成為GLP-l(7-36)酰胺和GLP-l(7-37)延長形式的加工主要發(fā)生在L-細胞中。木領域已經(jīng)顯示在禁食狀態(tài)下，GLP-1的血漿水平為約40pg/ml。進餐后，GLP-1血漿水平迅速提高至約50-165pg/ml。本文使用的術語"GLP-1分子"是指GLP-1蛋白質(zhì)、肽、多肽、類似物、模擬物、衍生物、同種型、片段等等。這類GLP-1分子可包括天然存在的GLP-1多月太(GLP-l(7-37)OH、GLP-1(7-36)NH2)和GLP-1代謝產(chǎn)物如GLP-l(9-37)。因此，在本發(fā)明具體的實施方案中，GLP-1分子包括天然的GLP-1、GLP-1類似物、GLP-1衍生物、二肽基肽酶-IV(DPP-IV)保護的GLP-l、GLP-1模擬物、GLP-1肽類似物或生物合成的GLP-1類似物。木文使用的術語"類似物"包括與另一化合物的結構相似的化合物。例如，抗病毒化合物阿昔洛韋(acyclovir)是一種核苷類似物，其與衍生自堿基鳥嘌呤的核苷鳥苷結構上類似。因此，阿昔洛韋模擬鳥苷(生物學上與鳥苷類似)，并且通過置換病毒核酸中的鳥苷殘基(或與之競爭)來干擾DNA合成并阻止翻譯/轉(zhuǎn)錄。因此，與另一(親本化合物)具有結構類似性的化合物是類似物，其模擬親本化合物的生物學或化學活性。將化合物確定為類似物不需要最大或最小的基本或功能基團取代數(shù)量，只要類似物能夠以一些相關的模式(同一地、補充地或競爭地)模擬親本化合物的生物學特性或化學特性即可。類似物可以是并且通常是親木化合物的衍生物(見下文"衍生物")。本文公開的化合物的類似物可以具有等于、小于或大于它們親本化合物的活性。本文使用的"衍牛物"是指天然地或合成地從親本化合物制成(或衍生)的化合物。衍生物可以是類似物(見上文"類似物")并從而可具有類似的化學或生物學活性。然而，與類似物不同，衍生物不必須模擬親本化合物的生物學或化學活性。將化合物確定為衍生物不需要最大或最小的基本或功能基團取代數(shù)量。例如，盡管抗病毒化合物甘克洛韋(ganckwir)是阿昔洛節(jié)的衍生物，伹是甘克洛韋具有弓阿昔洛韋不同的抗病毒活性譜系和不同的毒物學特性。本文公開的化合物的衍生物與其親木化合物比較時可以具有相等、更小、更大或甚至不相似的活性。本文使用的術語"代謝產(chǎn)物"是指代謝的任何屮間產(chǎn)物或產(chǎn)物，并包括大分子和小分子。木文使用時和適當時，該定義適用于初級和次級代謝產(chǎn)物。初級代謝產(chǎn)物直接涉及活體牛物正常的生長、發(fā)育和繁殖。次級代謝產(chǎn)物不直接涉及這些過程，但是典型地具有重要的生態(tài)學功能(例如抗生素)。本文使用的術語"生物合成的"是指活體生物對化合物的任何生產(chǎn)。本文使用的術語"能形成顆粒的"是指化學的、生物合成的或生物學實體或化合物，其能夠形成固體顆粒，通常在液體培養(yǎng)基中形成。顆粒的形成典型地發(fā)生在能形成顆粒的實體暴露于某條件下時，所述條件例如為pH、溫度、濕度和/或摩爾滲透壓濃度/重量摩爾滲透壓濃度。對所述條件的暴露可導致例如結合、聚結、凝固和/或脫水，從而形成顆粒。沉淀反應是能形成顆粒事件的一個例子。本文使用的"共溶液"是由至少兩種化學、生物學和/或生物合成的實21體組成的任何介質(zhì)。例如，可以通過將包含至少一種化學、生物學和/或生物合成的實體的液體與包含化學、生物學和/或生物合成的實體的固體組合來形成共溶液。在另一個例子中，可以通過將包含至少一種化學、生物學和/或生物合成的實體的液體與包含化學、生物學和/或生物合成的實體的另一種液體組合來形成共溶液。在又一個例子中，可以通過向單個溶液中添加至少兩種固體形成共溶液，所述每種固體包含至少一種化學、生物學和/或生物合成的實體。本發(fā)明中考慮的天然GLP-1是具有SEQIDNO.1或SEQIDNO.2的氨基酸序列的多肽。天然GLP-1肽在體內(nèi)于數(shù)分鐘內(nèi)被快速的切割和滅活。本發(fā)明的GLP-1類似物可包括毒蜥外泌肽，其為被發(fā)現(xiàn)是GLP-1受體激動劑的肽；這類類似物可還包括毒蜥外泌肽1到4。毒蜥外泌肽在毒蜥(Gila-monster)的毒液中被發(fā)現(xiàn)，并與哺乳動物GLP-1分享約53%的氨基酸同源性。毒蜥外泌肽還具有對GLP-1受體的類似親合力。據(jù)報道毒蜥外泌肽-3和毒蜥外泌肽-4刺激胰腺腺泡細胞中的cAMP生產(chǎn)和淀粉酶從胰腺腺泡細胞中的釋放(Malhotraetal.,1992;Raufmanetal.,1992;Singhetal"1994)。己經(jīng)提出了毒蜥外泌肽-3作為促胰島素劑用于治療糖尿病和預防高血糖癥的用途(美國專利No.5,424,286)。毒蜥外泌肽的羧基末端片段如毒蜥外泌肽[9-39](羧基酰胺化的分子)和穿過9-39的片段3-39已經(jīng)被報道為是GLP-1的有力的和選擇性的拮抗劑(Gokeetal.,1993;Raufmanetal"1991;Scheppetal"1994;Montrose-Rafizadehetal.，1996)。文獻還證實了毒蜥外泌肽[9-39]在體內(nèi)封閉內(nèi)源GLP-1，導致減少的胰島素分泌(Wangetal"1995;D'Alessioetal"1996)。毒蜥外泌肽-4有效結合分泌胰島素的/3-TCl細胞上的GLP-1、來自胰腺的分散的腺泡細胞和來自胃的壁細胞。毒蜥外泌肽-4肽也在經(jīng)分離的胃中刺激促生長素抑制素釋放和抑制胃泌素釋放中起作用(Gokeetal.,1993;Scheppetal.,1994;Eisseleetal.,1994)。在用克隆的GLP-1受體轉(zhuǎn)染的細胞中，毒蜥外泌肽-4被報道為激動劑(即其促進cAMP)，而毒蜥外泌肽[9-39]被定義為拮抗劑(即其阻斷毒蜥外泌肽-4和GLP-1的刺激作用)。還22發(fā)現(xiàn)毒蜥外泌肽是抗降解的。本發(fā)明的另一實施方案考慮了肽模擬物的用途。如本領域技術人員已知的，肽模擬物是生物學上模擬激素、細胞因子、酶底物、病毒或其他生物分子上活性決定簇的肽，并可拮抗、刺激或以其他方式調(diào)節(jié)天然配體的生理活性。參閱例如BIOTECHNOLOGYANDPHARMACY,Pezzutoetal.,Eds"ChapmanandHall,NewYork(1993)中的Johnsonetal""PeptideTurnMimetics"。使用肽模擬物的潛在原理是蛋白質(zhì)的肽主鏈主要以確定氨基酸側(cè)鏈方向有助于分子相互作用的方式存在。預計肽模擬物允許與天然分子相似的分子相互作用。在其他實施方案中，本發(fā)明的GLP-1分子會具有天然GLP-1的至少一種生物活性，例如與GLP-1受體結合并引發(fā)導致促胰島素活性的信號轉(zhuǎn)導途徑的能力。在本發(fā)明的其他實施方案中，GLP-1分子可以是肽、多肽、蛋白質(zhì)、類似物、模擬物、衍生物、同種型、片段等等，其維持天然存在的GLP-1的至少一種生物活性。GLP-1分子還可包括可藥用鹽和前藥，和前藥的鹽，天然存在的人GLP-1的多形體(polymorph)、水合物、溶劑合物、生物活性片段、生物活性變體和立體異構體，以及天然存在的人GLP-1的激動劑、模擬物和拮抗劑變體。包括毒蜥外泌肽1到4的毒蜥外泌肽家族，及其多肽融合物。木發(fā)明的GLP-1分子也可以包括二肽基肽酶-IV(DPP-IV)保護的GLP-1，其阻止或抑制GLP-1的降解。本發(fā)明的GLP-1分子包括肽、多肽、蛋白質(zhì)及其衍生物，其含有氨基酸取代、改進溶解度、賦予對氧化的抗性、提高生物效力，或提高循環(huán)中的半衰期。因此，本發(fā)明中考慮的GLP-1分子包含氨基酸取代、刪除或添加，其中所述氨基酸選自本領域公知的那些。分子的N端或C端也可以被修飾，例如但不限于被?；?、乙?；Ⅴ０坊?。因此，在木發(fā)明中，術語"氨基酸"是指天然存在的和非天然存在的氨基酸，以及氨基酸類似物和氨基酸模擬物，其以與天然存在的氨基酸相似的方式發(fā)揮功能。天然編碼的氨基酸是20種常見的氨基酸(丙氨酸、精氨酸、天冬酰氨、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰氨、谷氨酸、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸和纈氨酸)和焦賴氨酸(pyrolysine)和硒代半胱氨酸(selenocysteine)。氨基酸類似物是指具有與天然存在的氨基酸相同的基本化學結構的化合物，所述基本化學結構即與氫、羧基、氨基和R基團結合的a碳，例如高絲氨酸、正亮氨酸、正纈氨酸、甲硫氨酸亞砜、甲硫氨酸甲基锍、瓜氨酸、羥基谷氨酸、羥基脯氨酸和pmline。這類類似物具有經(jīng)修飾的R基團(例如正亮氨酸)，但是保留與天然存在的氨基酸相同的基本化學結構。本發(fā)明中考慮的氨基酸還包括與a-氨基酸相似的/3-氨基酸，因為它們含有氨基端和羧基端。然而，在3-氨基酸中，兩個碳原子分開這些功能性末端。帶有特定側(cè)鏈的^-氨基酸能夠作為a(C2)碳或/3(C3)碳上的R或S異構體存在。這導致對任何給定的側(cè)鏈而言總共四種可能的非對映異構體。本發(fā)明的GLP-1分子也可包括雜種GLP-1蛋白、其融合蛋白、寡聚體和多聚體、同系物、糖基化模式變體和突變蛋白質(zhì)，其中GLP-1分子保持天然分子的至少一種生物活性，并且與其合成或制造方法無關，所述方法包括但不限于重組(無論是從cDNA、基因組DNA、合成的DNA或其它形式的核酸產(chǎn)生)、合成和基因激活方法。重組DNA技術是本領域普通技術人員公知的(見Russell，D.W.，etal.,MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarbor,N.Y.,2001)。in.二酮哌嗪二酮哌嗪因為其形成微粒的能力而是本領域公知的，所述能力適用于藥物遞送和穩(wěn)定。在木發(fā)明中，使用二酮哌嗪有助于GLP-1分子的吸收，從而提供抗降解的穩(wěn)定制劑?？墒褂枚喾N方法，其中二酮哌嗪可以形成整和GLP-1分子的顆粒，或GLP-1分子能夠吸附在上面的顆粒。這可涉及將二酮哌嗪溶液與GLP-1分子的溶液或懸浮液混合然后沉淀，隨后形成包含二酮哌嗪和GLP-1的顆粒。或者，可以沉淀二酮哌嗪形成顆粒，并隨后與GLP-1分子的溶液混合。二酮哌嗪顆粒與GLP-1分子之間的締合可以通過溶劑去除來進行，或在干燥之前可以包括特定的步驟(如pH調(diào)節(jié))，從而促進締合。在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的二酮哌嗪包括但不限于3,6-二(4-富馬酰-氨丁基)-2，5-二酮哌嗪，也已知為(E)-3，6-二[4-(N-羧基-2-丙烯基)氨丁基]-2，5-二酮哌嗪(其也被稱作富馬酰二酮哌嗪或FDKP)。本發(fā)明中考慮的其他二酮哌嗪包括，但不限于3,6-二(4-氨丁基)-2,5-二酮哌嗪的衍生物例如3,6-二(琥珀酰-4-氨丁基)-2,5-二酮哌嗪(在本文中也稱作3,6-二(4-羧丙基)氨丁基-2,5-二酮哌嗪；琥珀酰二酮哌嗪或SDKP);3,6-二(馬來酰-4-氨丁基)-2,5-二酮哌嗪；3，6-二(檸康酰-4-氨丁基)-2-5-二酮哌嗪；3，6-二(戊二酰-4-氨丁基)-2，5-二酮哌嗪;3，6-二(丙二酰-4-氨丁基)-2.5-二酮哌嗪；3,6-二(草酰-4-氨丁基)-2,5-二酮哌嗪及其衍生物。在其它實施方案中，木發(fā)明考慮了二酮哌嗪鹽的用途。這類鹽可包括例如任何可藥用的鹽，如二酮哌嗪的Na、K、Li、Mg、Ca、銨或単.、二或三烷基銨(如衍生自三乙胺、丁胺、二乙醇胺、三乙醇胺或吡啶等等)鹽。鹽可以是單鹽、二鹽或混合的鹽。也考慮了二酮哌嗪的更高級的鹽，其中R基團含有多于一個酸基。在本發(fā)明的其它方面，試劑的基本形式可以與二酮哌嗪混合形成二酮哌嗪的藥物鹽，從Ift了該藥物是二酮哌嗪的平衡陽離子(countercation)。木文考慮的鹽的一個例子以非限制性的方式包括FDKP二鈉。美國專利申請No:11/210,710教導了使用DKP的藥物遞送，其涉及DKP鹽的所有內(nèi)容通過參考并入本文。如本文中別處所公開的，本發(fā)明還使用了新穎的FDKP不對稱類似物xDKP，例如(E)-3-(4-(3，6-二氧代哌嗪-2-基)丁基氨基甲?；?-丙烯酸；(E)-3-(3-(3，6-二氧代哌嗪-2-基)丙基-氨基甲酰基)丙烯酸；和(E)-3-(4-(5-異丙基-3.6-二氧代哌嗪-2-基)-丁基氨基甲酰基)丙烯酸，并在題為"AsymmetricalFDKPAnalogsforUseasDrugDeliveryAgents"的美國臨時專利申請中公開，該申請在與此一致的日期提交并以其整體并入本文(代理人案號No.51300-00041)。二酮哌嗪可以如下形成如Katchalski,etal.,(J.Amer.Chem.Soc.68:879-80;1946)所述通過氨基酸酯衍生物的環(huán)二聚體作用，如Kopple,etal.，(J.Org.Chem.33:862-64;1968)所述通過二肽酯衍生物的環(huán)化或通過氨基酸衍生物在高沸點溶劑中的熱脫水，所述文件的教導被引入本文。25用于合成和制備二酮哌嗪的方法是本領域普通技術人員公知的，并公開于美國專利5,352,461;5,503,852;6,071,497;6,331,318;6,428,771和美國專利申請No.20060040953中。美國專利No.6,444,226和6,652,885描述了在水性懸浮液中制備和提供二酮哌嗪微粒，所述水性懸浮液中被添加了活性試劑的溶液，從而使活性試劑與顆粒結合。這些專利還描述了通過凍干法去除液體介質(zhì)產(chǎn)生包含活性劑的微粒的方法，改變這類懸浮液的溶劑條件以促進活性試劑與顆粒的結合則在美國專利申請系列No:60/717,524和11/532,063(二者均題為"MethodofDrugFormulationBasedonIncreasingtheAffinityofActiveAgentsforCrystallineMicroparticleSurfaces")禾口11/532,065(題為"MethodofDrugFormulationBasedonIncreasingtheAffinityofActiveAgentsforCrystallineMicroparticleSurfaces.")屮教導。還參閱美國專利No.6,440,463和2005年8月23日提交的美國專利申請系列No:11/210,709和美國專利申請No.11/208,087。在一些情況下，考慮到通過例如2006年2月22日提交的題為"AMethodForImprovingthePharmaceuticPropertiesofMicroparticlesComprisingDiketopiperazineandanActiveAgent."的美國專利申請系列No.11/678,046中公開的噴霧干燥方法干燥本發(fā)明的被負載的二酮哌嗪顆粒。每份專利和專利申請針對它們涉及二酮哌嗪的內(nèi)容通過參考并入木文。IV.GLP-1/DKP顆粒的治療制劑本發(fā)明還提供了用于施用給需要治療的受試者的GLP-1/FDKP制劑。本發(fā)明中考慮的受試者可以是家居寵物或人。在某些實施方案中，治療是針對II型糖尿病、肥胖癥、癌癥或其任何相關疾病和/或病癥。人是尤其優(yōu)選的受試者。本發(fā)明中考慮的其它疾病或病癥包括，但不限于腸易激綜合征、心肌梗死、缺血、再灌注組織損傷、血脂障礙、糖尿病心肌病、急性冠狀動脈綜合征、代謝綜合征、手術后分解代謝改變、神經(jīng)變性病癥、記憶和學習障礙、胰島細胞移植和再生治療或中風。木發(fā)明考慮的其它疾病和/或病癥包括與上文所列的相關的任何疾病和/或病癥，其可以通過對需要的受試者施用GLP-1/FDKP干粉制劑來治療。本發(fā)明的GLP-1/FDKP干粉制劑也可以用于治療II型糖尿病和高血糖癥的人細胞中/3細胞分化的誘導。還在本發(fā)明的又一個實施方案中，考慮到受試者可以是家居寵物或動物，包括大鼠、兔子、倉鼠、荷蘭豬、沙土鼠(gerbil)、旱獺、貓、犬、綿羊、山羊、豬、牛、馬、猴子和猿(包括猩猩、長臂猿和狒狒)。還考慮到本發(fā)明的GLP-1/FDKP顆粒制劑可以通過本領域普通技術人員公知的和用于臨床或非臨床目的的多種施用途徑施用。本發(fā)明的GLP-1/FDKP組合物可以被施用至任何靶向的生物膜，優(yōu)選受試者的粘膜。施用可以通過任何途徑進行，所述途徑包括但不限于經(jīng)口、經(jīng)鼻、經(jīng)頰、全身性靜脈注射、皮下、通過血或淋巴提供的分區(qū)施用、直接施用至受侵襲的位點或甚至通過局部手段進行。在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，GLP-1/FDKP組合物的施用通過肺部遞送。本發(fā)明中可以使用的其它備選的施用途徑可包括真皮內(nèi)、動脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、病灶內(nèi)、顱內(nèi)、關節(jié)內(nèi)、前列腺內(nèi)、胸膜內(nèi)、氣管內(nèi)、玻璃體內(nèi)、陰道內(nèi)、直腸的、瘤內(nèi)、肌內(nèi)、血管內(nèi)(intravesicular)、粘膜的、心包內(nèi)、支氣管局部施用，使用氣霧劑，注射、灌輸、連續(xù)灌輸、集中灌注直接沐浴靶細胞，通過導管、通過灌洗，在霜劑屮、在液體組合物(例如脂質(zhì)體)中，或通過本領域常規(guī)計數(shù)人員會制造的其它方法或前述的任何組合(參閱例如Remington'sPharmaceuticalSciences,1990，其涉及給藥方法的全部內(nèi)容通過參考并入本文)。作為干粉制劑，本發(fā)明的GLP-1/DKP顆?？梢酝ㄟ^吸入被遞送至呼吸系統(tǒng)的特定區(qū)域，這取決于顆粒的大小。另外，GLP-1/DKP顆?？梢员恢圃斐勺銐蛐《軗饺腱o脈注射懸浮液劑型中。對于經(jīng)口遞送而言，可以可以被摻入懸浮液、片劑或膠囊中。GLP-1/DKP組合物可以從吸入裝置被遞送，所述吸入裝置例如霧化器、壓力定量氣霧劑、干粉吸入器和噴霧器。在其它實施方案中，考慮向需要的患者施用"有效量"的GLP-1/DKP制劑。本發(fā)明中考慮的"有效量"的GLP-1/DKP干粉制劑是指GLP-1化合物、類似物或肽模擬物等等的量，該用量會在一些程度上緩解被治療的27疾病、病癥或障礙的一個或多個癥狀。在一個實施方案中，"有效量"的GLP-1/DKP干粉制劑應當是通過將血漿胰島素水平提高、禁食血糖水平減少或降低和胰腺/3-細胞量提高至少約1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%或更多(但不限于此)來治療糖尿病的GLP-1分子的量。在另一優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明考慮通過對需要這類治療的受試者施用藥物有效量的GLP-1分子來治療肥胖癥。在這類情況下，"有效量"的GLP-1/DKP干粉制劑應當是通過將體重減少或降低至少約5%、10。％、15%、20%、25°%、30%、35%、40%、45%、50%或更多(但不限于此)的GLP-1分子的量。本發(fā)明還考慮了施用"有效量"的GLP-1/DKP干粉制劑用于通過對需要這類治療的受試者施用藥物有效量的GLP-1分子來控制飽滿感。就非限制性的方式而言，GLP-1分子可以是毒蜥外泌肽分子如毒蜥外泌肽-1或-4。在這類情況下，"有效量"的GLP-1/DKP干粉制劑應當是將饑餓感受和食物攝入(例如通過質(zhì)量或卡路里含量測量)減少至少約5%,6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、2"%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、35%、40%、45%、50%或更多(但不限于此)的GLP-1分子的量。"有效量"的GLP-1/DKP干粉制劑還可以被定義為足夠可檢測地和可重復地改善、減少、最小化或限制疾病或病癥或其癥狀的程度的量。也可能使用"有效量"的本發(fā)明制劑消除、清除或治愈疾病或病癥。在對需要的受試者施用本發(fā)明的GLP-1/FDKP組合物時，組合物的實際劑量可以以物理和生理因素為基礎確定，所述因素如體重、病癥的嚴重性、被治療的疾病類型、先前或共存的治療干涉、患者的特發(fā)病(idiopathy)和施用途徑。技術人員應當能夠基于一個或多個這些因素確定實際的劑本發(fā)明的GLP-1/DKP制劑可以被施用一次或多于一次，取決于待治療的疾病或病癥。GLP-1/DKP制劑的施用可以以下述間隔被提供給受試者，所述間隔在數(shù)分鐘、數(shù)小時、數(shù)天、數(shù)周或數(shù)月的范圍內(nèi)變化。在一28些情況下，治療方案的計時可涉及施用后GLP-1分子的半衰期。在其它實施方案中，例如在治療具體的或復雜的疾病或病癥如癌癥時，例如可期望施用含藥物賦形劑或試劑的本發(fā)明的GLP-1/DKP制劑。在這類情況下，可以由藥物賦形劑或試劑指導施用方案。V.實施例以下的實施例包括在本文中用于闡述本發(fā)明的某些實施方案。本領域技術人員應當明白，實施例中公開的技術闡明了在本發(fā)明的實踐中適當?shù)匕l(fā)揮功能的代表性技術。然而，木領域的技術人員在本發(fā)明的啟發(fā)下應當明白，可以在公開的特定實施方案中進行許多改變，并且仍然獲得相似或類似的結果，而不偏離本發(fā)明的宗旨和范圍。實施例1GLP-1結構的生物物理學分析和分析法分析為了分析GLP-1的結構和行為，使用了大量的生物物理學技術和分析技術。這些技術包括遠紫外線圓二色性(遠-UVCD)、近紫外線圓二色性(近-UVCD)、內(nèi)熒光、傅立葉變換紅外光譜學(FTIR)、高壓液相色譜(HPLC)和質(zhì)譜(MS);其均是本領域普通技術人員公知的。使用大范圍的條件研究濃度、離子強度、溫度、pH、氧化脅迫、攪動和多重凍融循環(huán)對GLP-1肽的影響；其均在下文更詳細地描述。也使用這些分析表征降解的主要途徑，并確立操作GLP-1的肽結構從而達成某GLP-1/DKP制劑的條件。實驗歩驟GLP-1購自AmericanPeptide(Sunnyvale,CA)或AnaSpec(SanJose,CA)，或內(nèi)部制造(MannKindCorporation,Valencia,CA)。在pH4.0和20°C(除非另有說明)下分析多種濃度的水性GLP-1樣品。樣品一般是新鮮制備的并在每次實驗前與適當?shù)奶砑觿?例如鹽、pH緩沖液、&02等，如果有的話)混合。用遠-UVCD和透射傅立葉轉(zhuǎn)換紅外光譜(FTIR)收集多種條件下GLP-1的二級結構測量結果。另外，使用近-UVCD和內(nèi)熒光，通過監(jiān)測其芳香族殘基(即色氨酸)周圍的環(huán)境來分析GLP-1的三級結GLP-1的濃度依賴性結構使用圓二色性(CD)譜分析分子(如蛋白質(zhì)或肽)可能顯示的a-螺旋、隨機巻曲、/3-折疊片層、/S-轉(zhuǎn)角和隨機巻曲。具體地，使用遠-UVCD測定蛋白質(zhì)和肽中二級結構的類型，例如純a-螺旋、^-片層等。另一方面，使用近-UVCD分析分子的三級結構。因此，為了檢查濃度對GLP-1的影響，使用遠-UVCD和近-UVCD技術二者。圖1A中的遠UV-CD證實了在大范圍的濃度(例如1.8、4.2、5.1、6.1、7.2禾t18.6mg/ml)下，GLP-1形成兩種不同的結構，所述結構包括a-螺旋和隨機巻曲。通過205nm處的巨大單個最小值確定，在低濃度(S2mg/mL)下GLP-1主要是無組織的。通過208nm和224nm處的兩個最小值確定，當濃度提高時肽采取a-螺旋結構(圖1A)。三級結構分析提示高濃度的GLP-1結構是自身締合的構象(即寡聚物)。近-UVCD和熒光發(fā)射數(shù)據(jù)均支持該假設。近-UVCD(圖IB)中250-300nm之間的陽性條帶揭示了GLP-1具有確定的三級結構，該結構在更高的濃度下增加。更特別地，這些條帶表明肽的芳香族殘基被大量地固定，并存在于明確定義的環(huán)境中。類似地，多種濃度下(pH4.0，20°C)GLP-1的熒光發(fā)射顯示芳香族殘基色氨酸(其也在近-UVCD譜中顯示強烈的條帶)存在于明確定義的三級結構中；顯示的數(shù)據(jù)得自280nm處的色氨酸激發(fā)(圖1C)。對低濃度GLP-1而言355nm處的熒光最大值表明色氨酸被暴露于溶劑中，且不存在顯著的三級結構。在高肽濃度下，最大值強度降低并遷移至更短的波長，表明更多確定的三級結構。為了進一歩測定GLP-1自身締合構象的潛在的二級結構，在多種濃度下(pH4.0,20。C)進行FTIR分析。1656cm—1處的酰胺I條帶清楚地表明在2mg/mL的濃度下GLP-1具有a-螺旋結構(圖1D)。因此，GLP-1不形成/3-片層結構；取而代之，在高濃度下肽更可能產(chǎn)生螺旋束。另外，實驗顯示這些不同的GLP-1結構不是通過樣品處理產(chǎn)生的。與30將肽直接溶于緩沖液中制備的GLP-1相比，來自濃縮的儲存溶液的稀釋液產(chǎn)生類似的遠-UVCD、近-UVCD和熒光發(fā)射譜。離子強度對GLP-1的影響還進行了一些研究來測定離子強度對GLP-1肽的影響。圖2A(遠-UV-CD)闡述了提高鹽的濃度(從100mM到1000mM)將無序的GLP-1結構轉(zhuǎn)化為a-螺旋構象，如208nm和224nm處的最小值所揭示的那樣。將NaCl濃度提高至1M后，很多肽(在1.0mg/mL時)從溶液中沉淀出來(圖2A)。然而，這種類型的沉淀顯示用水稀釋后溶解，從而確定了在高離子強度下GLP-1可以被可逆地沉淀。鹽還顯示產(chǎn)生并促進GLP-1的三級結構。這在圖2B(近-UV-CD)中例證，其屮1.0mg/mLGLP-1在無鹽時不顯示信號，但是顯不清楚的二級結構，該三級結構隨著提高的離子強度而強化。280nm處色氨酸激發(fā)后在多種NaCl濃度下(pH4.0，20。C)1.0mg/mLGLP-1的熒光發(fā)射(圖2C)i正實了這些結果。提高的離子強度引起熒光最大值遷移至更短的波長，表明1.0mg/mLGLP-1的三級結構既被產(chǎn)生又被增強。另外，使用近-UVCD譜在多種離子強度下(pH4.0,20。C)對10mg/mLGLP-1的三級結構分析證實提高的離子強度也增強了GLP-1的自身締合構象(圖2D)。因此，數(shù)據(jù)提示離子強度對GLP-1的結構具有巨大的影響，引起蛋白質(zhì)既采取a-螺旋構象又締合成為寡聚體。另外，提高溶液中的離子強度引起GLP-1的寡聚化提高，直到其可逆地沉淀為止。該事件在低肽濃度(其中最初不存在三級結構)以及高肽濃度(其己經(jīng)顯示大量二級和三級結構)下是明顯的。因此，提高的離子強度容易地將無組織的GLP-1轉(zhuǎn)化為a-螺旋和自身締合的構象。另外，觀察到的分光鏡結果與先前顯示的提高的肽濃度的影響是可比較的。溫度和pH對GLP-1的影響還進行了研究來測定GLP-1的自身締合的構象是否對溫度或pH的改變敏感。圖3A(近-UV-CD)證實隨著溫度提高，10mg/mLGLP-l的三級結構顯著地離解。另一方面，在多種溫度和pH4.0下，溫度對低濃度(0.05mg/mL)的GLP-1不具有影響；見圖3B禾卩3C(遠-UV-CD)。遠-UVCD闡明了肽對溫度是不敏感的。因此，提高的分子運動顯著地妨礙了GLP-1的自身締合。相反，圖4A(遠-UV-CD)證實ce-螺旋GLP-1構象的溶解度是pH敏感的。盡管在pH4.4和以下時，10mg/mLGLP-1的結構是相對均一的(即GLP-1保持螺旋)，但是當pH提高至接近或處于中性(pH6.3和7.6之間)時，一些沉淀發(fā)生并產(chǎn)生無序的譜系。其中發(fā)生了沉淀的樣品具有更低的強度，因為溶液中存在更少的可溶性GLP-1。該無序的結構通過圖4A(遠-UV-CD)中208nm處觀察到的單個最小值確定，這在圖4B(近-UV-CD)中進一步描述并且有可能得自沉淀后溶液中GLP-1的減少。當pH提高至高于GLP-l的5.5的pI時，可發(fā)生該沉淀。然而，隨著pH從接近中性提高至11.7，大部分沉淀再溶解，表明該沉淀是可逆的。在pH11.7剩余的未溶解的GLP-1沉淀會引起溶液中肽量降低，從而降低遠-UVCD譜系的強度，如圖4A中所觀察到的。還觀察到當凍干的GLP-1粉末與pH9緩沖液混合為高濃度GLP-1時，GLP-1是極端不溶的。GLP-1的穩(wěn)定性通過測定GLP-1肽對脫酰胺作用和氧化作用的抗性以及對攪動和凍融循環(huán)影響的抗性來測定其穩(wěn)定性。將處于pH10.5的GLP-1(1mg/mL)在4(TC孵育5天，之后進行反相HPLC和電噴射質(zhì)譜(MS)用于脫酰胺作用和氧化作用分析。也使用HPLC和MS對GLP-1樣品(lmg/mL)進行氧化研究，所述樣品在存在0.1%H202時孵育2小時。圖5描述了GLP-1在脫酰胺和氧化條件下的穩(wěn)定性。HPLC色譜圖闡明了GLP-1在相同的滯留時間下洗脫，并且所分析的失穩(wěn)條件沒有產(chǎn)生降解峰。另外，MS分析對所有樣品產(chǎn)生了類似的質(zhì)量3297g/mol，表明該質(zhì)量未被改變。數(shù)據(jù)還闡明了在多種條件下孵育時肽保持純凈和完整。因此，未觀察到GLP-1的脫酰胺。GLP-1也顯示對氧化脅迫是穩(wěn)定的，如在存在0.1%H202時所觀察的那樣，其中GLP-1的純度和質(zhì)量保持完整，如通過HPLC和MS分別測定的那樣?？傊?，不存在滯留時間或質(zhì)量值的改32變，并且未產(chǎn)生降解峰，從而證實了GLP-1肽對脫酰胺和氧化均是抗性的。攪動和連續(xù)的凍融循環(huán)對多種濃度的GLP-1的影響用近-UVCD和內(nèi)熒光分析。9.4和1.5mg/mLGLP-1的攪動不產(chǎn)生肽的顯著改變，如通過近-UVCD(圖6A)和熒光發(fā)射(圖6B)所觀察到的那樣。將樣品在室溫下攪動30和90分鐘，并在280nm處色氨酸激發(fā)后收集熒光發(fā)射譜。在獨立的凍融研究中，將含1.6、5.1和8.4mg/mLGLP-1(pH4.0)的溶液在-20。C冷凍并在室溫下熔化。通過近-UVCD(圖7A)和熒光發(fā)射(圖7B)指導和分析IO次凍融循環(huán)對GLP-1的影響。在280nm處色氨酸激發(fā)后收集熒光發(fā)射譜。兩種分析均顯示肽的三級結構不由于多重凍融循環(huán)而可觀地改變。在類似的實驗中，分析11次凍融循環(huán)對10mg/mLGLP-1(pH4.0)二級結構的影響(圖7C)。遠-UVCD闡明了肽的二級結構不因為多重凍融循環(huán)而顯著改變?？傊?，得自以上實驗的生物物理學分析顯示GLP-1肽的結構受其在溶液中濃度的強烈影響。當GLP-1的濃度被提高時，a-螺旋更加突出。另外，提高離子強度增強(在一些情況下產(chǎn)生)三級GLP-1結構。實施例2GLP-1/FDKP吸附研究通過進行吸附研究評價懸浮液中GLP-1與二酮哌嗪(DKP)顆粒的相互作用。吸附研究中的變量探究了靜電、氫鍵、水結構、蛋白質(zhì)柔性和特異的鹽-配對相互作用對GLP-1/DKP相互作用的影響。另外，測試了若干種常見的蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑對GLP-1與DKP表面吸附的影響。使用預先形成的DKP懸浮液顆粒(即FDKP)，研究了GLP-1吸附至預先形成的DKP顆粒表面的條件。FDKP顆粒懸浮液(其中FDKP顆粒是預先形成的)與3XpH緩沖液和3X添加劑或賦形劑的溶液組合。最終溶液具有5,mg/ml的FDKP濃度和0.25，mg/ml(5%w/w)的GLP-1濃度。上清液中未結合的GLP-1從懸浮液中濾除。用lOO,mM碳酸氫銨溶解FDKP顆粒與結合的GLP-1蛋白質(zhì)，并過濾以分離任何聚集的GLP-1蛋白質(zhì)。通33過HPLC定量上清液和重建的級分中的GLP-1量。進行一系列實驗，其中使用的條件包括使用添加劑(例如鹽、表面活性劑、離子、滲透物、離液劑、感膠離子)和多種濃度的GLP-1。得自這些研究的結果在下文描述。鹽研究。-通過HPLC分析觀察鹽對GLP-1與FDKP顆粒結合的影響。在存在0、25、50、100、250、500、1000禾D1500mMNaCl時于5mg/mLFDKP禾卩0.25mg/mLGLP-1下進行GLP-1/FDKP顆粒的負載(圖8A)。還作為pH和NaCl濃度的函數(shù)，評價了在重建的無FDKP對照樣品中檢測的GLP-1量(圖8B)。兩組數(shù)據(jù)組中的pH均用20mM磷酸鹽/20mM乙酸鹽混合物控制。如在圖8A中所觀察到的，GLP-1對FDKP的最佳結合(吸附)受到懸浮液pH的強烈影響。在4和以上的pH下，溶液中GLP-1/FDKP比例為5%w/w時，觀察到約3.2%到約4%的GLP-1對FDKP的結合。在存在0和25mMNaCl時，在pH2.0下基本上沒有明顯的GLP-1對FDKP顆粒的吸附，但是用提高的離子強度觀察到一些明顯的負載。在含2MNaCl的無FDKP對照中觀察到GLP-1沉淀，圖8B。在2MNaCl下該明顯的負載是GLP-1肽在高離子強度下可逆沉淀(鹽析)的結果。不含F(xiàn)DKP顆粒的高鹽GLP-1對照也在重建的樣品中顯示高GLP-1水平，表明收集上淸液時GLP-1已經(jīng)被濾器捕獲。低于lMNaCl時，不存在FDKP顆粒的情況下沒有GLP-1沉淀的跡象。表面活性劑研究.-通過HPLC分析研究表面活性劑對GLP-1與FDKP顆粒結合的影響。負載在存在表面活性劑時5mg/mlFDKP禾B0.25mg/mLGLP-1下進行(圖9A)。也作為pH和表面活性劑的函數(shù)評價了在重建的無FDKP對照樣品中檢測的GLP-1量(圖9B)。pH和對照樣品條件與上面描述的用于離子強度研究的條件相同。該研究中使用的表面活性劑包括0.09mM的Brij78、0.01mM的Tween80、0.2mM的TritonX、0.12mM的PluronicF68、0.9mM的H(CH2)7S04Na、0.9mM的CHAPS、0.9mM的Cetrimide。存在每種表面活性劑時GLP-1的負載曲線作為pH的函數(shù)針對GLP-1/FDKP顯示。數(shù)據(jù)顯示針對GLP-1/FDKP顆粒的pH吸附曲線不受接近其臨界膠團濃度(CMC)的表面活性劑的存在影響，所述臨界膠團濃度即分開下述界限的小范圍的濃度在其以下事實上檢測不到聚集物/膠團的界限，且在其以上事實上所有額外的表面活性劑分子均形成聚集物的界限。因此，還提示了任何這些表面活性劑可被用于最優(yōu)化如下所述的穩(wěn)定性和/或藥物代謝動力學(PK)。如上文鹽研究中可證實的，GLP-1與FDKP顆粒的相互作用受懸浮液的pH影響。離子研究。對該實驗而言，進行兩種不同的離子研究來測定離子對GLP-1與FDKP顆粒結合的影響。在兩種研究中，Cl—為陽離子的平衡離子，Na+為陰離子的平衡離子。如先前實驗所述進行GLP-1/FDKP顆粒的負載。如上文所述控制pH。在存在和不存在NaCl(其被用于更好地評價高離子強度的情況)時用pH3.0、3.5、4.0或5.0的pH緩沖液制備樣品。個體樣品中如下包含其他離子20或250mM的LiCl、20或250mM的NH4C1、20或250mM的NaF和20或250mM的NaCH3COO。如圖IOA所示，來自第一個離子研究的數(shù)據(jù)顯7K作為pH和離子的函數(shù)的GLP-1/FDKP負載曲線。在無NaCl時，20或250mM濃度的氟化物強烈地影響(增強)低pH下的吸附，其中250mM的NaF濃度顯示與pH無關的最大的結合。觀察到該模式是由于溶液中的氟而不是鈉，因為碳酸氫鈉在20和250nM不具有相同的作用。另外，這些作用不是樣品中鈉的結果，因為如圖8中所示，類似濃度的鹽不顯示該作用。存在lMNaCl時，所有的離子給出了高的"表觀"負載。對1MNaCl，而言該"表觀"負載由存在高離子強度時GLP-1肽從溶液中鹽析引起。這在圖IOB中進一歩闡明，所述圖10B顯示GLP-1存在于含1MNaCl的重建的無FDKP對照樣品屮。針對這些對照樣品檢測的GLP-1的量在更大的離子濃度下提高，因為它們增加了樣品中的總離子強度。在第二個離子實驗(圖IOC)中，在存在20或250mMKCl、20或250mM咪唑、20或250mMNal、或20或250mMNaPCM寸制備GLP-1/FDKP樣品。數(shù)據(jù)顯示250mM咪唑在存在1MNaCl時降低負載，250mM磷酸鹽和250mM均給出高的"表觀"負載(圖10C)。根據(jù)在0M和1MNaCl濃度下重建的無FDKP對照樣品中檢測的GLP-1量(圖3510D)，這些影響是由離子對GLP-1肽自身的影響而不是對肽與FDKP顆粒相互作用的影響引起。磷酸鈉和碘化鈉引起不存在NaCl時一些GLP-1的鹽析。另外，咪唑幫助將GLP-1溶解于1MNaCl樣品中，從而給出更低的"表觀"負載。在250mM磷酸鹽和碘化物的0MNaCl對照中也觀察到了沉淀。滲透物研究。也通過HPLC分析觀察GLP-1對FDKP顆粒的結合。圖11A顯示存在常見的穩(wěn)定劑(滲透物)時作為pH函數(shù)的GLP-1/FDKP負載曲線。如先前實驗中所述進行GLP-1/FDKP顆粒的負載。類似地，如上文所述控制pH。在pH3.0和存在20、50、100、150、200或300mM的滲透物(穩(wěn)定劑)時制備樣品。滲透物為己二醇(Hex-Gly)、海藻糖、甘氨酸、PEG、TMAO、甘露醇或脯氨酸；N/A表不無滲透物。在類似的實驗中，樣品中滲透物(穩(wěn)定劑)的濃度被保持恒定在100mM，pH從2.0到4.0變化。研究的滲透物(穩(wěn)定劑)均對GLP-1到FDKP表面的吸附?jīng)]有可觀的影響，無論pH被維持在pH3.0而滲透物的濃度變化(圖11A;左側(cè)曲線)還是滲透物濃度被維持恒定在100mM而改變pH(圖11A;右側(cè)曲線)。在重建的無FDKP對照樣品中未檢測到GLP-1沉淀(圖11B)。這些滲透物可被用于最優(yōu)化穩(wěn)定性和/或藥物代謝動力學。離液劑和感膠離子研究。研究影響水和蛋白質(zhì)結構的離子種類(離液劑和感膠離子)，確定這些因素在GLP-1對FDKP吸附中的作用。如先前的實驗中所述進行GLP-1/FDKP顆粒的負載。類似地，如上文所述控制pH。在pH3.0和存在0、20、50、100、150、200或300mM下述離液劑或感膠離子時制備樣品，所述離液劑或感膠離子為NaSCN、CsCl、Na2S04、(CH3)3N-HC1、Na2N03、檸檬酸鈉和NaC104。在類似的實驗中，樣品中離液劑或感膠離子的濃度被保持恒定在100mM，pH從2.0到4.0變化。圖12A顯示作為pH和離液劑和/或感膠離子的函數(shù)的GLP-1/FDKP負載曲線。在低pH(《3)時，對于分析的不同離液劑發(fā)生了負載中的顯著變化，特別是在較高的離液劑濃度下。然而在pH4時，未觀察到變化(圖不利的較低pH下促進GLP-1對FDKP顆粒的結合，但是在對結合有利的較高pH條件下具有非常少的影響。來自重建的無FDKP對照樣品的數(shù)據(jù)提示在pH3.0下觀察到的負載改變部分歸因于特定的離液劑在多種程度上影響GLP-1肽的鹽析(沉淀)(圖12B和12D)。這對強離液劑如NaSCN和NaC104而言是顯著的。有機物研究。評價下述醇來確定螺旋構象在GLP-1對FDKP的吸附中所起的作用，所述醇已知通過提高氫鍵的鍵合強度在無組織的肽中誘導螺旋構象。如先前實驗中所述進行GLP-1/FDKP顆粒的負載。類似地，如上文所述控制pH。在pH2.0、3.0、4.0禾G5.0下觀察每種醇的作用。使用的醇為甲醇(MeOH)、乙醇(EtOH)、三氟代乙醇(TFE)或六氟異丙醇(HFIP)。在5%、10%、15。/。和20。/。v/v的濃度下評價每種醇。圖13A顯示對每種濃度的每種醇而言作為pH函數(shù)的GLP-1/FDKP負載曲線。在pH3.0下，低濃度的HFIP(5%)導致高吸附，如GLP-1對FDKP顆粒的質(zhì)量比所證實的那樣。只有最強的H-鍵增強(成螺旋)醇HFIP對緩沖的懸浮液中的吸附具有影響。在更高濃度的HFIP(20%)下，GLP-1/FDKP吸附被抑制。圖13B顯示在20%的醇濃度下，在重建的無FDKP對照樣品中未記錄到顯著的GLP-1沉淀。這提示藥物的構象柔性(即能夠形成的FDKP-接觸物的熵和數(shù)量)可在吸附中起作用。數(shù)據(jù)提示H-鍵合在上述條件下GLP-1與FDKP表面的相互作用中可起作用?；谠摂?shù)據(jù)，還推測如果H-鍵合作為FDKP-GLP-1相互作用中主要的和一般的力作用，則應期待更多和更強的作用。濃度研究。-在多種GLP-1濃度下研究了GLP-1對FDKP顆粒表面的吸附。圖14A顯示多種pH下作為GLP-1濃度函數(shù)的來自GLP-1/FDKP的負載曲線。GLP-1濃度為0.15、0.25、0.4、0.5、0.75、1.0、1.5、2.0、5.0或10mg/mL。樣品的pH為2.5、3.0、3.5、4.0、4.5或5.0。當FDKP濃度被保持恒定在5mg/mL而GLP-1濃度提高時，觀察到FDKP顆粒上GLP-1負載的提高。在pH4下當GLP-1的濃度為10mg/mL時，觀察到FDKP顆粒上接近20%的GLP-1吸附。驚人的是，在高濃度GLP-1下未觀察到FDKP顆粒上負載的GLP-1吸附飽和。該觀察結果可能37歸因于GLP-1自身締合成為多層體。通過掃描電子顯微鏡(SEM)對GLP-1/FDKP制劑形態(tài)學的分析顯示GLP-1/FDKP顆粒作為晶體或平板樣結構存在，其能夠形成包含多于一個GLP-1/FDKP顆粒的聚集物(圖14B)。通過凍干溶液制備這些制劑，所述溶液含有(圖A)0.5mg/mLGLP-1和2.5mg/mLFDKP;(圖B)0.5mg/mLGLP-1禾卩10mg/mLFDKP;(圖C)20mM氯化鈉、20mM乙酸鉀和20mM磷酸鉀，pH4.0中0.5mg/mLGLP-1禾Q10mg/mLFDKP;和(圖D)20mM氯化鈉、20mM乙酸鉀和20mM磷酸鉀，pH4.0中10mg/mLGLP-1禾[]50mg/mLFDKP結果概述總之，對GLP-1與FDKP顆粒相互作用的吸附研究顯不GLP-1以pH-依賴性的方式與DKP顆粒表面結合，在pH4或之上具有高吸附。發(fā)現(xiàn)DKP顆粒表面對GLP-1的吸附受到pH最強影響，在pH2.0時基本沒有吸附，在pHS.O時有重大的相互作用。根據(jù)觀察，在低pH下鈉和氟離子增強吸附。其他添加劑如表面活性劑和常用的穩(wěn)定劑僅對GLP-1與FDKP顆粒表面的吸附具有輕微影響。另外，GLP-1自身的特性影響這些實驗的結果。發(fā)現(xiàn)GLP-1的行為是非典型并且驚人的，因為未觀察到飽和吸附，這歸因于高濃度下GLP-1的自身締合。高濃度下GLP-1的自身締合允許可能的多層GLP-1肽對DKP顆粒的包裹，從而促進更高百分比的GLP-1肽負載。該驚人的自身締合性質(zhì)證實在制備穩(wěn)定的GLP-1施用形式中是有益的。另外，GLP-1的自身締合構象可以能夠減少或延遲其在血中的降解。然而，注意到當操作締合的GLP-1時必須小心，因為其對溫度和高pH是敏感的。實施例3GLP-1/FDKP制劑的完整性分析以來自實施例1和2中實驗的結果為基礎，選擇了具有表1中所述特征的一系列GLP-1制劑用于本文討論的細胞存活力測定。大部分制劑含有GRAS("—般被認為安全的")賦形劑，但是一些被選擇以允許研究穩(wěn)定性和吸附之間的關系。表l.針對完整性相分析(IntegrityPhaseAnalysis)選擇的GLP-l/FDKP。修飾劑量(mM)無緩沖液pH3.0pH4.0pH5.0無XXXXNaCl1000XXNaCl20XTween800.01%XHepSulf0.90%XBrij780.09%XF-250XF-20XXLi+20XXX磷酸鹽250XX磷酸鹽20XXX咪唑250X甘露醇20X廿麵20XMe3N.HCl50X檸檬酸鹽50XAm2S0450XC10450XE認20%XTFE20%X另外，以實施例1和2中獲得的結果為基礎，還選擇了一系列制劑用于GLP-1/FDKP的相II完整性研究。下表2顯示選擇用于相II完整性的六種GLP-l制劑。制備粉末后，將它們與空白的FDKP摻合，在每種制劑中產(chǎn)生類似的大量GLP-l肽和FDKP。表2.針對II期完整性選擇的GLP-1/FDKP制劑。從20mMNaCl和pH4.0緩沖液中10mg/mlGLP-l制成的制劑被描述為鹽-締合制劑。GLP-1濃度質(zhì)量比水(無緩20mMNaCl+(GLP/FDKP)沖液)pH4.0緩沖液0.5mg/mL0.05XX3.0mg/mL0.10XX10mg/mL0.20XX通過HPLC分析脅迫對表2中GLP-1/FDKP制劑的影響(圖15)。含負載在H20中5%、10%或20%GLP-1/FDKP的樣品；或負載在NaCl+pH4.0緩沖液中5%或10%GLP-1/FDKP的樣品在40。C孵育10天。HPLC色譜圖證實GLP-1肽以相同的滯留時間洗脫并且不存在降解峰。另外，MS分析產(chǎn)生對所有樣品而言類似的質(zhì)量3297g/mol，表明該質(zhì)量對所有分析的樣品而言是均一的。數(shù)據(jù)顯示凍干前GLP-1對FDKP顆粒和溶液屮存在其他成分的質(zhì)量-質(zhì)量比例?？傊珿LP-1/FDKP制劑顯示對脅迫是穩(wěn)定的。實施例4在肺灌洗液中孵育的GLP-1的穩(wěn)定性考慮到在生物流體中發(fā)現(xiàn)二肽基-肽酶IV(DPP-IV)切割并滅活GLP-1，分析生物流體(如肺流體和血)中GLP-1的穩(wěn)定性。二肽基-肽酶IV(DPP-IV)是一種細胞外膜結合的絲氮酸蛋白酶，其在若干種細胞類型(尤其是CD4+T細胞)的表面上表達。還在血和肺流體中發(fā)現(xiàn)了DPP-IV。DPP-IV己經(jīng)涉及葡萄糖代謝的控制，因為其底物包括促胰島素激素GLP-1，所述GLP-1通過其N-端氨基酸的去除而被滅活；見圖16A。DPP-IV切割人GLP-1(GLP-1(7-36))的主要循環(huán)形式的Ala-Glu鍵，釋放N-末端的兩個殘基。DPP-IV顯示通過降解GLP-1從而降低腸降血糖素對胰腺/3-細胞的作用來負調(diào)節(jié)葡萄糖處理。進行一些研究測定存在抑肽酶或DPP-IV抑制劑時大鼠血和肺流體中的GLP-1降解。向收集后的樣品中以1、2、3、4和5TlU/ml添加天然存在的絲氨酸蛋白酶抑制劑抑肽酶，其在本領域已知抑制蛋白質(zhì)降解。然后通過檢測發(fā)光底物的切割測量DPP-IV活性，所述底物含有DPP-IV識別的40Gly-Pro序列。將支氣管肺洗出液與前-熒光底物孵育30分鐘，并通過發(fā)光檢測切割產(chǎn)物。如在具有遞增的抑肽酶濃度的多種生物流體(如本文所述)中通過肽降解的抑制所檢測的，數(shù)據(jù)顯示DPP-IV活性抑制的提高(圖16B)。向收集后樣品中以1.25、2.5、5、10和20/xl/ml添加DPP-IV抑制劑觀察到類似的結果(圖16C)。樣品收集后抑制劑的添加允許更精確的樣品評價。還使用捕獲ELISAmAb(其識別GLP-1氨基酸7-9)在肺洗出液中檢查了GLP-1的穩(wěn)定性。GLP-1在肺洗出液(LLF)中孵育2、5、20和30分鐘。如圖17所示，孵育條件為1或10Atg(w/w)LLF禾B1或10//g(w/w)GLP-1。單獨在LLF中未檢測到GLP-1。使用多種濃度的LLF和GLP-1的組合，存在可與單獨的GLP-1相比的高GLP-1檢測，表明在肺洗出液中GLP-1是隨時間穩(wěn)定的(圖17)。在類似的研究中證實了未稀釋的肺洗出液中GLP-1的穩(wěn)定性；標注了20分鐘時70-72%的GLP-1完整性(數(shù)據(jù)未示出)。另外，檢查了大鼠血漿中GLP-1的穩(wěn)定性。血漿得自不同的大鼠(如圖例中血漿1和血漿2所示)并被1:2或l:10(v/v)稀釋。向10pd血漿或PBS中添加1毫克GLP-1。將樣品在37'C孵育5、10、30或40分鐘。在冰上終止反應并添加O.IU的抑肽酶。數(shù)據(jù)顯示在測試的所有時間點1:2和1:10的血漿稀釋液中高濃度的GLP-1(圖18A和18B)?？傊?，數(shù)據(jù)表明GLP-1在發(fā)現(xiàn)了絲氨酸蛋白酶DPP-IV的肺洗出液和血漿中均是驚人的穩(wěn)定的。實施例5GLP-1分子對細胞凋亡和細胞增殖的影響為了檢查GLP-1是否抑制細胞凋亡，進行篩選測定來確定GLP-1對/3-細胞死亡抑制的影響。用0、2、5、10、15或20nM濃度的GLP-1將大鼠胰腺上皮(ARIP)細胞(用作胰腺/3-細胞模型；購自ATCC,Manassas,VA)預處理10分鐘。然后使細胞未處理或用5AtM十字孢堿(細胞凋亡41誘導物)處理4.5小時。使用CellTiter-GloTM(Promega,Madison,WI)評價細胞存活力。在十字孢堿處理的細胞中，用高達10nM的GLP-l濃度提高記錄到細胞死亡百分比的降低(圖19A)使用錨定蛋白V染色通過FACS分析確定了GLP-l對細胞凋亡的影響的進一歩檢查。錨定蛋白V染色是檢測凋亡細胞的一個有用工具，并是本領域技術人員公知的。錨定蛋白與細胞膜的結合允許在與細胞凋亡相關的形態(tài)學改變發(fā)生之前和膜完整性喪失之前分析磷脂(PS)不對稱的改變。因此，在用15nmGLP-l、1/xM十字孢堿4小時、lpM十字孢堿+15nmGLP-1或既無十字孢堿又無GLP-l(實驗對照)處理的細胞中測定GLP-l對細胞凋亡的影響。數(shù)據(jù)顯示GLP-1將十字孢堿誘導的細胞凋亡抑制約40%(圖19B)。使用GLP-l類似物毒蜥外泌肽-4觀察到類似的細胞凋亡抑制結果，所述毒蜥外泌肽-4以類似GLP-l的方式與GLP-l受體結合。在存在0、10、20或40nM毒蜥外泌肽時用5AiM十字孢堿將ARIP細胞分別處理16、24或48小時。數(shù)據(jù)(圖20)顯示在10nM時、毒蜥外泌肽對抑制細胞凋亡是完全無效的，因為100%細胞死亡。在20和40nM下，毒蜥外泌肽相同程度抑制細胞凋亡，存在40nM毒蜥外泌肽-4時48小時約50%抑制。實施例6候選物GLP-l/FDKP制劑對細胞死亡的影響進行基于細胞的測定實驗來評價GLP-1/FDKP制劑(如實施例3、上表1中公開的)抑制細胞死亡的能力。這些GLP-1/FDKP顆粒制劑處于懸浮液中或被凍干。分析制劑在ARIP細胞中抑制十字孢堿誘導的細胞死亡的能力。用GLP-l樣品預處理的ARIP細胞被暴露于5十字孢堿中4小時，并用CellTiter-GloTM(Promega,Madison,WI)分析以確定細胞存活力。將多種GLP-1/FDKP制劑的樣品不脅迫或在fC或4(TC下脅迫4周。在基于細胞的測定法中以45nM使用每種GLP-1/FDKP樣品，來確定它們抑制十字孢堿誘導的細胞死亡的能力。右側(cè)所示對照樣品闡明單獨的培養(yǎng)基中，單獨含GLP-1的、單獨含十字孢堿的、或存在GLP-1和十字孢堿二者的培養(yǎng)基中細胞的存活力(注意圖例不適用于對照樣品。每條代表獨立的一式三份)。所有所示的結果是一式三份進行的平均值。數(shù)據(jù)顯示所有脅迫的GLP-1/FDKP凍干制劑抑制十字孢堿誘導的細胞死亡(圖21)。然而，許多GLP-1/FDKP懸浮液制劑不抑制細胞死亡。實施例7GLP-1/DKP顆粒的肺吹入法為了檢查GLP-1/FDKP的藥物代謝動力學，在雌性SpragueDawley大鼠中評價GLP-1的血漿濃度，所述雌性大鼠通過靜脈(IV)注射或肺吹入法施用了多種GLP-1/FDKP制劑。在初步的研究中，使用占GLP-1/FDKP顆粒制劑約4%和16%(w/w)的GLP-1。大鼠被隨機化為12組，其中第1、4、7和10組接受通過肺液體滴注或IV注射施用的GLP-1溶液。第2、5、8和11組接受通過肺吹入法或IV注射施用的GLP-1/FDKP鹽結合的制劑(圖表2中公開的)。第3、6、9、12組接受通過肺吹入法或IV注射施用的GLP-1/FDKP鹽結合的混合制劑。GLP-1/FDKP制劑是約16%負載的鹽結合的制劑。為了達到約4%的負載，將16%的制劑與DKP顆粒在3:1的混合物中摻合。對0.08mg的總GLP-1劑量而言，肺吸入法或靜脈注射為0.5或2.0mg的顆粒(分別為16X或4XGLP-1負載)。在獨立的動物組(第7-12組)中，在第2天重復施用。對第1、4、7和IO組施用80ygGLP-1溶液。對第2、5、8和11組施用GLP-1/DKP鹽結合的制劑(~16%GLP-1負載)。第3、6、9、12組接受GLP-1/DKP鹽結合的摻合制劑(4。/oGLP-l負載)。使用相同的制劑將實驗進行兩次，在連續(xù)的兩天中給藥和收集血。對每組而言在給藥當天，在給藥前(時間0)、給藥后2、5、10、20、30、60和120分鐘取血樣。在每個時間點，將來自尾緣靜脈的約150mL全血收集在含約3U/mL抑肽酶和0.3%EDTA的cyro-vial管中，倒置并儲存于冰上。將血樣在4000rpm離心并將40/xl血漿用移液管移至96-孔平板中，所述平板被儲存于-80°C，之后按照制造商的推薦(LincoResearch,StCharles,MO)通過ELISA分析GLP-1水平。測定了最佳條件是只存在血清(5。/。FBS)而無基質(zhì)的情況下當測定緩沖液為GLP-1時。靜脈施用:第5、6、10、11和12組靜脈(IV)接受了多種GLP-1/FDKP制劑和GLP-1溶液(圖22A)。第5組和第6組被施用給15.8%GLP-1/FDKP，第11和12組在相連的一天被施用給15.8%GLP-1/FDKP的另一種劑量；第10組被施用給作為對照的GLP-1溶液。在第0、2、5、10、20、40、60、80、100和120分鐘的時間點檢測GLP-1/FDKP的濃度。所有的組在靜脈施用后顯示GLP-1血漿水平的可檢測提高，在處理后2分鐘觀察到最大的濃度。對所有組而言處理后20分鐘活性GLP-1的血漿水平返回背景水平。通過靜脈注射施用時，這些多種GLP-1ZFDKP制劑和GLP-1溶液的動力學未觀察到顯著差異。注意到在通過靜脈注射處理的大鼠中，給藥后10-20分鐘GLP-1的血漿水平回復至基線水平，提示生理動力學(即約95%的GLP-1在10分鐘內(nèi)被消除)。單一吹入法施用:第1、2、3、7、8和9組通過肺吹入法接受了多種GLP-1/FDKP配方或GLP-1溶液(圖22B)。第1組通過肺液體吹入法(LIS)施用了80/xg的GLP-1對照；第2組通過肺吹入法(IS)施用了15.8%GLP-1/FDKP;第3組通過肺吹入法(IS)施用了3.8%GLP-1/FDKP;第7組通過肺液體吹入法(LIS)施用了80/xg的GLP-1對照；第8組通過肺吹入法(IS)施用了15.8%GLP-1/FDKP;和第9組通過肺吹入法(IS)施用了3.8%GLP-1/FDKP。在第0、2、5、10、20、40、60、80、100和120分鐘的時間點測量GLP-1/FDKP的濃度。所有的組在肺施用后顯示血漿GLP-1濃度的可檢測提高。GLP-1最大血漿濃度隨使用的制劑/組合物而變化。如AUC所指示的，第2組和第8組顯示在處理后10-20分鐘的最大GLP-1血漿水平，而第3組和第9組顯示在第5-10分鐘的顯著活性GLP-1水平，第1組和第7組顯示活性GLP-1血漿水平的更快速和瞬時的提高。在第2、3、7和8組中，處理后60分鐘活性GLP-1的血漿水平回歸至背景水平，而第1和7組在處理后20分鐘達到背景水平。在糖尿病大鼠模型中8納摩爾的GLP-1似乎是有效的；GLP-1劑量為80/xg(大于報道的有效劑量3000倍)；在給藥后30分鐘使用肺遞送的血漿GLP-1水平與3小時灌輸(Chelikanietal.,2005)相比高10倍；通過肺吹入法遞送的GLP-1/FDKP的生物利用度為71%。這些結果在下表4中進一步報道。在通過肺遞送處理的大部分大鼠中，給藥后30-60分鐘GLP-1的血漿水平回復至基線水平。除了第2組中的l號大鼠外，所有的大鼠在靜脈注射或肺吹入多種GLP-1/FDKP制劑后顯示GLP-1血槳濃度的提"。結論:在GLP-1/FDKP制劑的藥物代謝動力學模式中觀察到了與GLP-1溶液相比的差異。相對于用GLP-1溶液處理的大鼠而言，通過GLP-1/FDKP制劑肺吹入法處理的大鼠中GLP-1的血漿濃度更加持久。在給藥后20到60分鐘之間，所有的動物顯示GLP-1血漿濃度的降低。這些結果顯示連續(xù)2天進行的2個實驗的相對一致件。表4.GLP-1/FDKP制劑的生物利用度組制劑GLP-1劑量(pg)/,途徑T1/2(min)T1max(min)(pM)給藥后30分鐘(~pM)AUC(pM*min/mL)1GLP-180/24LIS1.0519330293502FDKP-GLP-180/24IS9.910315410001450823FDKP-GLP-1*80/24IS7.710277640060171*與FDKP顆粒3:1摻合實施例8GLP-l/FDKP減少大鼠的食物攝入本領域還已知GLP-1在大腦中作用，以觸發(fā)飽滿的感覺并減少食物攝入。根據(jù)GLP-1在飽滿感和食物攝入中的該作用，進行實驗確定本發(fā)明的GLP-l/FDKP制劑是否作為減少飼養(yǎng)的試劑是有效的并從而具有控制肥胖癥的潛能。通過肺吹入法用對照(空氣)或2mg/天劑量的15.8%GLP-l/FDKP制劑(0.32mgGLP-1/劑)對兩組雌性SpragueDawley大鼠給藥。對照組由五只大鼠組成，測試組由十只大鼠組成。每個大鼠連續(xù)5天被提供給單一劑量，并在每次給藥后2和6小時測量食物攝入。每天收集每只大鼠的體重。初步的數(shù)據(jù)顯示在給藥后2和6小時，在用GLP-1/FDKP制劑給藥的大鼠中存在累積食物消耗的整體減少(圖23A和23B)。在第4天給藥后2小時該減少更顯著(p-0.01)。第1天和第2天6小時時該減少更顯著(p<0.02)。給藥后24小時沒有對食物消耗的影響。實施例9毒性研究進行重復的劑量毒性研究，以評價多次施用后GLP-1/DKP的可能的毒性作用和毒物代謝動力學模式。進行了大鼠中14天的研究和猴子中28天的研究。通過吸入途徑每天進行GLP-1/DKP給藥。在對動物給藥28天的研究中，一部分動物要在給藥方案后立即處死，而其它動物允許在處死前有至多一個月的恢復周期。評價所有動物的臨床體征，多種生理參數(shù)，包括GLP-1、葡萄糖、胰島素、器官重量和臨床病理學和多種器官的組織病理學。進行一系列GLP誘變性研究，以評價二酮哌嗪顆粒的誘變潛能。這些研究包括體外Ames和染色體畸變測定法，其均是本領域技術人員公知的。另外，也進行了技術人員已知的體內(nèi)小鼠微核測定法。遺傳毒性數(shù)據(jù)顯示沒有證據(jù)表示二酮哌嗪顆粒有誘變性或遺傳毒性的潛能。還進行一些研究評價二酮哌嗪顆粒對繁殖毒性的影響。這些研究包括在大鼠和兔子中的生育力、胚胎-胎兒發(fā)育和出生后發(fā)育研究。通過皮下注射施用的二酮哌嗪顆粒在大鼠中不損傷生育力或植入，并且沒有在大鼠或兔子中致畸性的證據(jù)。二酮哌嗪顆粒并未不利地影響生育力和早期胚胎發(fā)育、胚胎發(fā)育或出生前或出生后發(fā)育?？紤]到大量藥物已經(jīng)由于它們引起LQT綜合征(獲得性LQTS或長期Q-T綜合征是一種在用藥人群中發(fā)生的罕見的心臟電節(jié)律的遺傳性異常)的傾向而從臨床市場中被去除，使用hERG測定法檢查二酮哌嗪顆粒的藥理學?？紤]到引起獲得性LQT的大部分藥物通過封閉人醚-^go-go相關基因(hERG)鉀通道而引起獲得性LQT的，因此使用hERG測定法，所述鉀通道負責心室賁門動作電位(ventricularcardiacactionpotential)的復極化。來自hERG測定法的結果表明二酮哌嗪顆粒的IC5。>100AtM。另外，來自二酮哌嗪非臨床研究的結果顯示對QTc間隔(心率校正的QT間隔)沒有影響，因為在犬中未觀察到延長(9個月或安全藥理學心血管研究)。靜脈內(nèi)施用時，二酮哌嗪顆粒對在安全藥理學核心電池組中評價的CND或心血管系統(tǒng)沒有影響。實施例10GLP-l對/3-細胞質(zhì)量的影響巳知GLP-l促進胰島素生物合成中的所有步驟并直接刺激/3-細胞生長和存活以及^-細胞分化。這些作用的組合導致增加的/3-細胞質(zhì)量。另外，GLP-1受體信號轉(zhuǎn)導導致/3-細胞凋亡的減少，這進一歩有助于增加/3-細胞質(zhì)量。已知GLP-1通過三種可能的途徑調(diào)節(jié)/3-細胞質(zhì)量增強/3-細胞增殖；抑制/5-細胞凋亡；和分化導管上皮屮推定的干細胞。為了證實GLP-1對^-細胞的影響，在第1、3和5天用GLP-1/FDKP處理細胞并與未處理的細胞比較。如文獻中所述，活性GLP-1的施用將細胞質(zhì)量至多提高2倍(Sturisetal.,2003)。另外，多種GLP-1受體(GLP-1R)激動劑對糖尿病的影響的檢查證實GLP-1R激動劑預防或延遲了糖尿病的發(fā)生或發(fā)展。在雄性Zucker糖尿病肥胖/肥胖(ZDF)大鼠(n二8/組)中評價GLP-1/FDKP對/S-細胞增殖、胰島素和葡萄糖的影響。動物連續(xù)3天接受對照(空氣)或含15%(0.3mg)GLP-1的2mgGLP-1/FDKP。進行腹膜內(nèi)(IP)葡萄糖耐受測試，并在給藥前、給藥后15、30、45、60和90分鐘收集血樣用于血漿GLP-1和葡萄糖分析。收集胰腺組織用于通過免疫組織化學分析胰島素分泌、/3-細胞質(zhì)量和細胞凋亡。在給藥的第4天進行IP葡萄糖耐受測試(IPGTT，圖24)。過夜禁食后在第3天，動物通過腹膜內(nèi)注射接受葡萄糖推注，隨后立即通過肺吹入法接受對照(空氣)或GLP-1/FDKP施用。在葡萄糖激發(fā)前和至給藥后90分鐘的多個時間點收集血。在給藥后30分鐘，第1組顯示與給藥前相比4747%的葡萄糖水平提高，而第2組(GLP-1/FDKP)顯示與給藥前值相比17%的葡萄糖水平提高。在葡萄糖耐受測試后所有的時間點中，處理與對照動物相比，葡萄糖水平顯著更低(p0.05)。還在給藥的第3天測量GLP-1水平(圖25)。第2組中血漿GLP-1水平的最大濃度是給藥后15分鐘的10，643pM。另外，與IP葡萄糖耐受測試后的葡萄糖測量一起，在第3天的多個時間點測量胰島素水平。對照(空氣)第1組和第2組(GLP-ZDKP)均證實給藥后15分鐘相對于給藥前水平而言分別46%和30。/^的胰島素濃度初始降低(圖26)。然而，在給藥后30分鐘，第2組中的胰島素水平回歸至基線，而第1組中的胰島素水平持續(xù)降低至給藥前值的64%。在被處理的動物屮，45分鐘、60分鐘和90分鐘的胰島素水平接近給藥前值，偏差少于1,5%。制備了用于胰島素免疫染色和顯微鏡評價胰島素表達的載玻片。根據(jù)通過光學顯微鏡對胰島素表達的定量評價，雄性ZDF大鼠的胰屮存在處理相關的胰島素表達提高(其為劑量相關的)，盡管未達到統(tǒng)計學顯著性(p=0.067);這通過表達胰島素的/3胰島細胞的百分比所確定。還對ZDF大鼠的胰腺組織進行了細胞凋亡分析。通過TUNEL測定法評價外分泌和內(nèi)分泌的胰腺細胞(TomuscioloD.R.etal.,1995)。對胰屮約10,000個細胞(外分泌的和內(nèi)分泌的)評分。大部分TUNEL-陽性細胞是外分泌的。在處理和對照組中沒有細胞凋亡標記指數(shù)的差異。另外，在Zucker糖尿病肥胖大鼠的胰中評價了/3細胞增殖，所述大鼠通過肺吹入法用對照(空氣)或GLP-1/FDKP每天一次給藥3天。制備了使用免疫組織化學對胰島素和Ki67(增殖標記物)共定位的載玻片。在總計17只ZDF大鼠的胰島素陽性的胰島和外分泌胰腺中進行細胞增殖的顯微鏡評價。根據(jù)細胞增殖的定量評價，雄性ZDF大鼠的胰島/3-細胞或胰腺外分泌細胞中沒有對細胞增殖的處理相關的影響?？傊?，該研究顯示通過肺吹入法以2mg或0.3mgGLP-1施用的GLP-1/FDKP在葡萄糖耐受測試后降低糖尿病肥胖小鼠(II型糖尿病的模型)中的血糖水平，并提高每個胰島的胰島素分泌細胞數(shù)量。48實施例11GLP-1/FDKP顆粒制劑的制備還使用了制備GLP-1/FDKP顆粒制劑的備選方法。制劑如下制備通過將1份GLP-1(按重量計)添加進9份去離子水中并添加小量的冰醋酸形成澄清溶液來制備10wt%GLP-1儲存溶液。將FDKP顆粒的儲存懸浮液(約10wty。的顆粒)分為三部分。向每部分懸浮液中添加合適量的GLP-1儲存溶液，提供按干燥粉末計5和15wt%GLP-1的靶組合物。添加蛋白質(zhì)溶液后，懸浮液的pH約為3.5。然后將懸浮液調(diào)節(jié)至約pH4.4-4.5，之后將懸浮液在液氮中制成小球并凍干除去冰。粉末的氣體動力學用填充量可吸入級分比(respirablefractiononfill)(RFBasedonFill)來表征，即以藥筒中粉末的量計可吸入范圍內(nèi)的粉末百分比(%)，其如下測定用5mg的粉末手工填充五個藥筒并通過MannKind，sMedTone⑧吸入器(描述于美國專利申請No.10/655,153中)排放。該方法產(chǎn)生具有良好的填充量RF的制劑。具有5wt%GLP-1的粉末被測量為48.8。/。RF/填充量，而含約15wt%GLP-1的粉末為32.2。/。RF/填充量0實施例12含多種GLP-1濃度的GLP-1/FDKP的藥物代謝動力學為了評價具有多種GLP-1濃度的GLP-1/FDKP的藥物代謝動力學，將稱重在192.3克到211.5克之間的十八只雄性SpragueDawley大鼠分為四個處理組對照GLP-1(第l組，n=3);GLP-1/FDKP制齊U(第2-4組，11=5/組)。動物接受以下的測試物品之一通過肺吹入法的對照(空氣)；含5。/。GLP-l的2.42mgGLP-1/FDKP(0.12mgGLP-1);通過肺吹入法的含10%GLP-1的1.85mgGLP-1/FDKP(0.19mgGLP-1)，或含15%GLP-1的2.46mgGLP-1/FDKP(0.37mgGLP-1)。收集血樣并測定給藥前和給藥后多個時間點(2、5、10、20、30、40禾Q60分鐘)血清FDKP禾口血漿GLP-1水平。施用GLP-1/FDKP(5%制劑)后的最大血漿GLP-1濃度(C,)為給藥后5分鐘T^x處的2321pM;給藥后10分鐘Tn^處的4,887pM(10%制劑)；和給藥后10分鐘T皿處的10,207pM(15%制劑)。如圖27所示，直到給藥后30分鐘仍觀察到顯著的GLP-1水平。第1-4組的GLP-1水平的曲線下面積(AUC)分別為10622、57101、92606、227873pM^^分鐘。對10%或15%GLP-1負載的GLP-1/FDKP估計的GLP-1半衰期為10分鐘。如圖28所示，5%、10。％和15%GLP-1的GLP-1/FDKP制劑的最大FDKP濃度分別被測定為8.5pg/mL(第2組)、4.8pg/mL(第3組)和7.1pg/mL(第4組)。到最大濃度的時間(Tn^)為10分鐘。該數(shù)據(jù)顯示FDKP禾PGLP-1顯示類似的吸附動力學，類似量的FDKP被吸附而與顆粒上的GLP-1負載無關?？傊?，研究顯示在SpragueDawley大鼠中通過肺吹入法單一劑量施用GLP-1/FDKP后，血漿GLP-1水平被檢測為顯著水平。觀察到血漿GLP-1水平的劑量相關提高約在給藥后IO分鐘達到最大濃度，在給藥后40分鐘具有可觀察的GLP-1水平。所有的動物存活，直到研究結束時為止。實施例13通過肺吹入法施用的GLP-1/FDKP的藥物動力學特性為了評價GLP-1/FDKP的藥物動力學特性，將雌性SpragueDawley大鼠分為2個處理組。動物(11=10)連續(xù)4天通過單一的每日肺吹入法接受對照(空氣;n=5)或含15%GLP-1(0.3mgGLP-l)的2mgGLP-l/FDKP。連續(xù)4天在暗循環(huán)中于給藥前、給藥后1、2、4、和6小時測量食物消耗(圖29)。與對照(空氣)組相比，受處理的動物中在第1、2和3天通過肺吹入法每日單一劑量施用GLP-1/FDKP后食物消耗減少(p<0.05)。第1天的1小時和6小時時間點上和第2天的4小時、6小時和第3天的給藥前，受處理組中的動物相對于對照(空氣)存在統(tǒng)計學顯著的食物消耗減少。連續(xù)4天在給藥前每天測量體重(圖30)。給藥起始時的體重在從約180到209克的范圍內(nèi)變化。盡管處理和對照(空氣)動物之間未達到統(tǒng)計學顯著性，但是處理的動物中體重更低。所有的動物存活直到預定的處死為止。實施例14-16毒物代謝動力學(TK)研究下文實施例14到16公開了為了評價GLP-1/FDKP吸入粉末可能的毒性作用和毒物代謝動力學模式而在大鼠和猴子中進行的重復給藥毒性研究。數(shù)據(jù)表明在高于計劃的臨床用途劑量若干倍的劑量下，GLP-1/FDKP吸入粉末沒有明顯的毒性。另外，在每個物種中顯示雄性和雌性動物之間沒有差異。實施例14通過猴子中肺吹入法施用5天的GLP-1/FDKP的毒物代謝動力學進行研究測定GLP-1/FDKP的毒性和毒物代謝動力學模式，所述GLP-1/FDKP連續(xù)5天每天一次(每天30分鐘)通過口鼻施用(預期的人治療施用途徑)給短尾猴(7lfocacfl/mc/cM/flnX)。口鼻施用涉及在猴子的口和鼻上佩戴面具并呼吸測試制劑30分鐘。在開始處理前十四天使動物適應限制(restraint)和給藥步驟。在處理開始時(第l天)，雄性動物在30和56個月齡之間，體重范圍從2.3到4.0kg;雌性在31和64個月齡之間，體重范圍從1.6到3.4kg。如下文表5和表6中所示，將十只(5只雄性和5只雌性)非首次實驗的短尾猴指定為5組(每組2只動物)。非首次實驗的猴子是先前已接受待測試制劑的群體動物。然而，這些制劑具有短半衰期，并且預期在本文公開的給藥實驗期間不會顯示或具有對猴子的任何影響。動物接受對照(空氣)、2mg/kgFDKP或0.3(0.04mgGLP-1)、1.0(0.13mgGLP-1)或2.0(0.26mgGLP-1)mg/kgGLP-1/FDKP。表5:目標的和評估的實際劑量水平(通過重量:組號組命名評估的劑量水平(mg/kg/day)51<table>tableseeoriginaldocumentpage52</column></row><table>通過在給藥前、給藥期間和給藥后稱重吸入腔中的濾紙進行重量分析，來計算腔中氣溶膠的濃度和測定給藥的持續(xù)時間。i基于假定的2.5kg體重。2基于測量的體重(對雄性和雌性平均)。3列出的目標和實際的劑量水平假定產(chǎn)生的氣體中GLP-1的比例為13%?？偽雱┝康墓乐导俣ㄔ诤粑乐?00%沉積。表6:目標的和實際的平均氣溶膠濃度(通過重量分析*測定)<table>tableseeoriginaldocumentpage52</column></row><table>*通過在給藥前、給藥期間和給藥后稱重吸入腔中的濾紙進行重量分析，來計算腔中氣溶膠的濃度和測定給藥的持續(xù)時間。1列出的目標和實際的氣霧劑濃度假定產(chǎn)生的氣體中GLP-1的比例為13%?？偽雱┝康墓乐导俣ㄔ诤粑乐?00%沉積。在第5天的以下時間點獲得全血樣品(1.4mL/血樣)給藥前、給藥后10、30、45、60、90、120分鐘。通過靜脈穿剌從股靜脈中收集血。將血樣分為2等分；一份用于血漿GLP-1分析(0.8mL)，另一份(0.6mL)用于血清FDKP分析。對于血漿GLP-1分析而言，在每個時間點將全血(0.8mL)收集進1.3mLEDTA管(0.1。/。EDTA)中。在血收集后約5-10秒向管中添加(10^L/mL血)DPP-IV抑制劑(Millipore-Billerica,MA)，得到100^M的DPP-IV濃度。將管反轉(zhuǎn)數(shù)次并立即置于濕潤的冰上。全血樣品保持在濕潤的冰上，直到在4000rpm離心(2。-8。C)約10分鐘產(chǎn)生血漿為止。將血漿樣品轉(zhuǎn)移至適當?shù)墓苤校⒃趦Υ嬗?70(±10)°C冰箱前保持在干冰上。測定GLP-1的須將濃度(Q^)、Tmax、AUC和T^。連續(xù)4天吸入施用GLP-1/FDKP后，第5天在所有給藥前樣品中發(fā)現(xiàn)可檢測的GLP-1水平。在第5天，給藥施用后約10分鐘內(nèi)達到了GLP-1的血漿濃度峰值(Q^)(圖31)。第5天在雄性和雌性猴子中均觀察到作為劑量函數(shù)的GLP-1Q^和AUClast(從零時間到最后可計量濃度時間的濃度-時間曲線下的面積)的劑量相關增加。在研究的劑量范圍中，在雄性和雌性猴子中用遞增的劑量觀察到少于與劑量成比例的GLP-1AUQw增加，1mg/kg/天劑量水平的雄性除外。從0.3到2.0mg/kg/天的6.7倍劑量增加僅導致雄性中AUQw的2.9倍增加和雌性中AUQ^的1.1倍增加。當分別以0.3、1.0和2.0mg/kg/天的劑量水平施用GLP-1/FDKP時，平均的GLP-1濃度峰值在雄性中為17.2、93.1和214pg/mL，在雌性屮為19.3、67.9禾n82.8pg/mL。GLP-1的血漿水平快速下降，其表觀清除半衰期范圍在4分鐘到24分鐘。當分別以0.3、1.0和2.0mg/kg/天的劑量水平施用GLP-1/FDKP時，GLP-1的AUC值在雄性中為21.6、105禾卩62.3pg*h/mL，在雌性中為33.4、23.7禾Q35.4pg*h/mL。在最低劑量水平觀察的GLP-1TK參數(shù)中不存在明顯的性別差異。然而，在研究的中和高劑量水平下，雄性猴子始終展示比雌性猴子更高的AUC^值。來自運載體對照和對照(空氣)猴子的一些樣品顯示可測量的GLP-1水平。這可由動物吸入的空氣污染引起，或可以是這些具體猴子中內(nèi)源GLP-1的度量。應當注意對照動物被暴露在與GLP-1/FDKP處理的動物不同的房間。因為GLP-1的生物半衰期少于15分鐘，所以來自GLP-1/FDKP施用的GLP-1在24小時內(nèi)應當被完全清除。因此，GLP-1的內(nèi)源水平可能解釋第5天在所有GLP-1/FDKP處理的動物中收集的零時間樣品中始終可計量的GLP-1水平。從觀察到的給藥后GLP-1濃度中減去零時間值會反映由于GLP-1/FDKP施用引起的GLP-1改變。53對于血清FDKP分析而言，在每個時間點將全血(0.6mL)收集進不含抗凝血劑的管中，允許在室溫下凝結最少30分鐘，并通過離心分離獲得血清。FDKP分析并測定血清濃度(C^x)、Tmax、AUC和T1/2。連續(xù)四天吸附施用GLP-1/FDKP后，第5天在所有給藥后樣品中發(fā)現(xiàn)可檢測的FDKP水平。第5天，在給藥施用后約10到30分鐘達到FDKP的血漿濃度峰值第5天在雄性和雌性猴子中均觀察到作為劑量函數(shù)的FDKPAUC①(從零時間推至無限時間的濃度-時間曲線下的面積)的劑量相關增加。然而在雄性中，0.3和1.0mg/kg/天之間沒有FDKPAUC①的差異，但是在1和2mg/kg/天之間記錄到劑量相關的提高。在觀察到增加的所有情況下，其小于與劑量成比例。從0.3到2.0mg/kg/天的6.7倍劑量增加僅導致雄性中AUC^的2.7倍增加和雌性中AUC①的3.0倍增加。當分別以0.3、1.0和2.0mg/kg/天的劑量水平施用GLP-1/DKP時，平均的FDKP濃度峰值(C,x)在雄性中為200、451和339ng/mL，在雌性中為134、161和485ng/mL。當分別以0.3、1.0禾卩2.0mg/kg/天的劑量水平施用GLP-1/FDKP時，平均的FDKPAUC^值在雄性中為307、578和817ng.h/mL，在雌性中為268、235和810ng.h/mL。僅以2.1mg/kg/天施用FDKP的動物(第2組)中AUC^禾CIC腿水平與接受2.13mg/kg/天GLP-1/FDKP的動物處于相同的數(shù)量級，例外是給藥施用后30到45分鐘的T,x輕微更長?？傊?，GLP-1/FDKP被良好耐受，沒有臨床體征或影響體重、食物消耗、臨床病理學參數(shù)、肉眼或顯微鏡的評價。還記錄到對短尾猴每天30分鐘施用5天的GLP-1/FDKP吸入施用不具有任何劑量限制的毒性，所述施用的評估的實際劑量高達2.13mg/kg/天(對應于0.26mg/kg/天的GLP-1劑量)。實施例15通過肺吹入法在大鼠中施用14天的GLP-1/FDKP的毒物代謝動力學該研究評價了連續(xù)14天通過肺吹入法每日施用后GLP-1/FDKP的可能毒性。大鼠連續(xù)14天(『24/性另U/組)接受對照(空氣)、10mg/kg的54FDKP顆粒，或1(0.15mgGLP陽1)、3(0.45mgGLP-1)或10(1.5mgGLP-l)mg/kgGLP-1/FDKP作為每日肺吹入。每天觀察動物的毒性臨床體征；也記錄體重和食物消耗。在第l天和第14天，在所有劑量組中于給藥施用后約10到15分鐘內(nèi)達到了GLP-lC腿。在雄性和雌性中，10mg/kg/天GLP-l/FDKP下平均的GLP-l的濃度峰值分別為第1天6714禾B6270pg/mL和第14天2979和5834pg/mL。GLP-l的血漿水平下降，表觀清除半衰期范圍從0.7小時到4.4小時。在10mg/kg/天GLP-1/FDKP的最高劑量下，GLP-l的平均AUC水平在雄性中為2187pM*h，在雌性中為2703pM*h。觀察到最小或沒有GLP-l蓄積，并且Cmax、半衰期和T,x沒有性別差異。在所有劑量下，雌性大鼠中GLP-1的AUC值輕微高于雄性大鼠屮。通過肺吹入法連續(xù)14天施用GLP-1/FDKP的大鼠中不可見的不良作用水平(NOAEL)為10mg/kg/天GLP-l/FDKP(1.5mg/kg沃GLP-l)。最終給藥后約24小時處死動物(12/性別/組)；進行臨床病理學、肉眼的和顯微鏡評價。給藥的第14天在最終血收集后處死動物代謝動力學(TK)隨體動物(12/性別/組)。不存在與GLP-1/DKP相關的死亡或臨床觀察結果。對照和受處理的動物之間沒有體重或食物消耗的差異。僅在10mg/kgGLP-1/FDKP的雌性中，肝重量和肝對體重的比例與對照(空氣)組相比明顯更低。來自血液學、凝固、化學、尿液分析或尿化學的結果中，未記錄到施用了運載體的大鼠和空氣對照之間有明顯的差異。組織中不存在下述肉眼發(fā)現(xiàn)或組織病理學發(fā)現(xiàn)，所述發(fā)現(xiàn)被確定為由于施用了GLP-1/FDKP而具有可能的毒性。實施例16猴子屮通過肺吹入法施用28天的GLP-1/FDKP的毒物代謝動力學該研究評價了至少4周通過吸入每天施用GLP-1/FDKP的毒性和毒物代謝動力學。為了評價任何作用的可逆性、持久性或晚發(fā)，存在4周的恢復周期。55動物接受以下的處理之一第1組對照(空氣)；第2組3.67mg/kg/天FDKP顆粒；第3組0.3mg/kg/天GLP-1/FDKP(0.045mg/kg/天GLP-1);第4組1mg/kg/天GLP-1/FDKP(0.15mg/kg/天GLP-1)或第5組2.6mg/kg沃GLP-1/FDKP(0.39mg/kg沃GLP-1)。將四十二只短尾猴分為2組第1、2和5組中的恢復(11=2/性別/組)和主要研究(11=3/性另1」/組)。第1組空氣對照，第2組FDKP(4mg/kg/天)；第3組0.3mg/kg/天GLP-1/FDKP(低劑量);第4組.0mg/kg/天GLP-1/FDKP(中劑量);第5組2.6mg/kg/天GLP-1/FDKP(高劑量)。典型地，在猴子研究中只有高劑量和對照在恢復時評價。每天兩次觀察動物的死亡率或發(fā)病率，至少每天一次在給藥后30分鐘觀察異常和毒性癥狀。每周收集體重數(shù)據(jù)，每天評價定性的食物消耗。在第l、28和56天收集血用于毒物代謝動力學。在第29天將三只動物/性別/組麻醉、稱重、放血和尸體剖檢。在第57天將第1、2和5組中的剩余動物(11=2/性別/組)麻醉、稱重、放血和尸體剖檢。尸體剖檢時，將選定的器官稱重，收集選定的組織并防腐。顯微鏡檢查來自每個動物的所有組織。所有組的體重存在偶然的波動；但是不存在與處理相關的對體重的影響。一般地，所有的動物在研究過程中維持體重或增加小量體重。在高劑量下觀察到更高發(fā)病率和頻率的松弛或液體糞便。未記錄到被認為是與處理相關的任何臨床化學參數(shù)的顯著改變，例外是第29犬(處理結束時)高劑量雌性中乳酸脫氫酶(LDH)和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)的中度增加；見表7。雄性中LDH的水平也輕微提高。這些改變在恢復周期結束時己經(jīng)消除，并且與肝中任何顯微鏡發(fā)現(xiàn)不相關。高劑量雄性組中AST水平的改變主要歸因于五個動物之一。表7:ALT、AST和LDH的均值改變％均值改變％組ALT(U/L)AST(U/L)LDH(U/L)雌性1.對照-252-956-13-34-533.0.3mg/kg/天GLP-l/FKDP-1153-144.1.0mg/kg/天GLP-l/FKDP-159-115.2.6mg/kg沃GLP-l/FKDP32422117雄性1.對照-16-42-622.3.67mg/kg沃FKDP1460-63.0.3mg/kg/天GLP-1/FKDP24168694.1.0mg/kg/天GLP-l/FKDP493275.2.6mg/kg/天GLP-l/FKDP-16306在高達2.6mg/kg/天GLP-1/FDKP的劑量水平下，不存在任何與處理相關的肉眼可見的改變或組織學改變的跡象。在高達2.6mg/kg/天GLP-1/FDKP(0.39mg/kg/天GLP-1)的劑量下，GLP-1/FDKP被良好耐受，沒有顯著的臨床體征，不影響體重、食物消耗、血液學、尿液分析、胰島素分析、檢眼鏡檢查、ECG，沒有觀察到的肉眼可見的或顯微鏡下的改變。28天內(nèi)以高達3.67mg/kg/天的評估的實際劑量用高達每天30分鐘吸入施用FDKP也不與任何毒性相關。第1天在雄性和雌性猴子中均觀察到作為劑量函數(shù)的GLP-1和FDKPC皿和AUC^t的劑量相關增加。在研究的劑量范圍中，第28天在雄性和雌性猴子中用遞增的劑量均觀察到少于與劑量成比例的GLP-1C,增加，而未發(fā)現(xiàn)AUCto增加。2.6mg/kg/天GLP-1/FDKP下平均的GLP-1濃度峰值在雄性中為259pg/mL，在雌性中為164pg/mL。GLP-1的血漿水平降低，清除半衰期范圍從0.6到2.5小時變化。高劑量下GLP-1的平均AUC值在雄性中為103pg*hr/mL，在雌性中為104pg*hr/mL。2.6mg/kg/天GLP-1/FDKP下平均的FDKP濃度峰值在雄性中為1800ng/mL，在雌性中為1900pg/mL?？偠灾?，對短尾猴的GLP-1/FDKP吸入施用被臨床良好地耐受，所述施用以高達2.6mg/kg/天GLP-1/FDKP或0.39mg/kg/天GLP-1的評估的實際劑量、以高達每天30分鐘吸入施用GLP-1/FDKP。NOAEL為2.6mg/kg/天GLP-l/FDKP(0.39mg/kg/天GLP-l)。如下文實施例19中所述，I期研究中的最大人劑量應為每天1.5mgGLP-1/FDKP或0.021mg/kgGLP-571(假定為70kg的人)。其它的研究劑量應為每天3.0mgGLP-l/FDKP或~0.042mg/kgGLP陽1。實施例17制備毒蜥外泌肽/FDKP制劑通過將酸性毒蜥外泌肽-4肽(SEQIDNo.3)溶液與FDKP顆粒懸浮液組合來制備毒蜥外泌肽-4/FDKP。酸性肽溶液為溶解在2%乙酸中的10%(w/w)肽。FDKP懸浮液含有約10%(w/w)FDKP顆粒。將酸性毒蜥外泌肽-4肽溶液添加進FDKP顆粒懸浮液中，同時柔和地混合。用25%氨溶液將毒蜥外泌肽-4/FDKP混合物逐步滴定至pH4.50。然后將混合物在液氮中制成小球并凍干。15X毒蜥外泌肽-4/FDKP粉末的填充量可吸入級分％(%RFonFill)含量為36%，藥筒排空百分比(PercentCartridgeEmptying)為99%。以類似規(guī)模生產(chǎn)的15%GLP-1/FDKP粉末顯示34%的。/。RFonFill,藥筒排空百分比為100%。實施例18通過肺吹入法施用的毒蜥外泌肽/FDKP的藥物代謝動力學進行重復的劑量初始毒性研究，以檢查多種濃度下和通過肺部途徑多次施用后毒蜥外泌肽-4(GLP-1類似物)的藥物動力學和藥物代謝動力學模式。在大鼠和猴子中進行了28天的研究。通過吸入途徑每天進行毒蜥外泌肽/FDKP給藥。在對動物給藥28天的研究中，一部分動物要在給藥方案后立即處死，而其它動物允許在處死前有多達一個月的恢復周期。評價所有動物的臨床體征，多種生理參數(shù)，包括毒蜥外泌肽-4、葡萄糖和胰島素的血水平；器官重量和多種器官的臨床病理學和組織病理學。初始的研究組由每組五只動物組成并具有兩個對照組空氣和靜脈施用毒蜥外泌肽。存在六個肺吹入組，其接受約2.0mg劑量的，5%、10%、15%、20%和25%和30。/。毒蜥外泌肽負載(w/w)的毒蜥外泌肽/FDKP。收集58全血用于血糖和毒蜥外泌肽濃度，直到8小時的時間點。收集數(shù)據(jù)(Q^、丁1/2和Tmax)，其證實毒蜥外泌肽/FDKP制劑具有相對于GLP-1/FDKP可比較的或更好的藥物代謝動力學。實施例19大鼠中通過肺吹入法施用的GLP-l/xDKP的藥物代謝動力學為了確定不同的DKP是否可以影響GLP-1/FDKP制劑的藥物代謝動力學模式，如題為"AsymmetricalFDKPAnalogsforUseasDrugDeliveryAgents"的美國臨時專利申請所公開，制造多種GLP-l/xDKP制劑，所述申請在與本文一致的日期提交并以其整體并入本文(代理人案號No.51300-00041)。在被分為6個處理組的大鼠中進行研究，所述組由每組5只動物組成。對照組(n-3)通過液體滴注接受GLP-1。還使用通過肺吹入施用的GLP-1/FDKP(0.3mgGLP-1)作為第二對照。每個GLP-l/xDKP處理的組通過肺吹入以負載10%和15%GLP-1的2.0mg的xDKP劑量接受GLP-1/xDKP制劑。使用的xDKP為(E)-3-(4-(3,6-二氧代哌嗪-2-基)丁基氨基甲?；?-丙烯酸)、(3,6-二(4-羧丙基)氨基丁基-2,5-二酮哌嗪)和((E)-3，6-二(4-(羧基-2-丙烯基)氨基丁基)-2,5-二酮哌嗪二鈉鹽)負載。在給藥后5、10、20、30、45、60直到90分鐘收集全血用于評價GLP-1濃度。實施例20健康成年雄性受試者中GLP-1/FDKP吸入粉末的la期、單一劑量、開放標簽、遞增劑量、受控的安全性和耐受性試驗通過靜脈(iv)或皮下(sc)灌輸或通過多重皮下注射給予時，GLP-1己經(jīng)顯示在人中控制提高的血糖。因為激素的半衰期非常短，可能需要連續(xù)皮下灌輸或多次每日皮下注射。這些途徑均不適用于長期臨床用途。動物實驗顯示通過吸入施用GLP-1時可達到治療水平。GLP-1的若干種作用(包括減少胃排空、提高飽滿感和抑制不適當?shù)母哐撬胤置?似乎與進餐開始時的GLP-1釋放爆發(fā)有關。通過用GLP-591/FDKP吸入粉末補充GLP-1的該早期波動，可以在糖尿病動物中引起藥物動力學應答。另外，可以通過餐后施用GLP-1/FDKP吸入粉末模擬與提高的胰島素分泌相關的天然GLP-1的晚期波動。GLP-1/FDKP吸入粉末的la期臨床試驗被設計為在人受試者中第一次測試選定劑量的新型吸入式血糖控制治療產(chǎn)品的安全性和可耐受性。給藥利用了先前測試過的MedTone⑧吸入器設備。該臨床試驗的主要目的在于鑒定通過肺吸入的GLP-1/FDKP吸入粉末的劑量范圍，所述劑量范圍是安全的、可耐受的并可在臨床試驗中進一步用于建立有效性和安全性的證據(jù)。針對la期臨床試驗選擇的劑量是以下述動物安全性結果為基礎的，所述動物安全性結果來自上述實施例中描述的GLP-1/FDKP吸入粉末在大鼠和靈長類中的非臨床試驗。二十六(26)個受試者被登記在5隊中，達到第1和2隊中每隊多達4個可評估的受試者，第3到5隊中每隊多達6個可評估的受試者，所述可評估的受試者滿足合格標準并且完成臨床試驗。每個受試者用作為GLP-1/FDKP吸入粉末的高血糖素樣肽-l(GLP-l)給藥一次，劑量水平如下第l隊0.05mg;第2隊0.45mg;第3隊0.75mg;第4隊1.05mg禾口第5隊1.5mg的GLP-1。不替換中途退出者。這些劑量假定70kg的體重。木領域技術人員能夠根據(jù)上文公開的研究確定額外的劑量水平。該試驗的目的是確定健康成年的男性受試者中遞增劑量的GLP-1/FDKP吸入粉末的安全性和耐受性。將評價遞增劑量的GLP-1/FDKP吸入粉末的耐受性，其通過監(jiān)測藥理學或?qū)ψ兞康牟焕饔么_定，包括報道的不利事件(AE)、生命體征、物理檢査、臨床實驗室測試和心電圖(ECG)。第二個目的是評價另外的安全性和藥物動力學參數(shù)。這包括另外的安全性參數(shù)，表述為肺和其它AE的發(fā)病率和調(diào)查1(篩選)與調(diào)查3(隨訪)之間肺功能的改變；用GLP-1/FDKP吸入粉末給藥后血槳GLP-1和血清富馬酰二酮哌嗪(FDKP)的藥物代謝動力學(PK)參數(shù)，通過AUQu2o(分鐘)血漿GLP-1和AUC。-柳分鐘血清FDKP測量；和另外的血漿GLP-1PK參數(shù)，包括t隨血漿GLP-l;C腿血漿GLP-1;和T1/2血漿GLP-1。另外的60FDKP;C匪血清FDKP;禾BT,/2血清FDKP。試驗終末點(endpoint)基于在試驗受試者群體中測定的以下藥理學和安全性參數(shù)的比較。初級終末點應包括安全性終末點將根據(jù)報道的AE(包括咳嗽和呼吸困難、惡心和/或嘔吐)發(fā)病率和嚴重性、來自生命體征篩選的改變、臨床實驗室測試和物理檢查來評價。次級終末點應包括血漿GLP-1和血清FDKP的PK分布(AUCo-,加分鐘血漿GLP-1和AUCo-柳分鐘血清FDKP);另外的血漿GLP-1PK參數(shù)(T腿血槳GLP-1、C腿x血漿GLP-1、丁1/2血漿GLP-1);另外的血清FDKPPK參數(shù)(Tmax血清FDKP，C^x血清FDKP);和另外的安全性參數(shù)(肺功能測試(PFTs))禾卩ECG。la期、單一劑量試驗整合了開放標簽、遞增劑量結構和符合21CFR312,GoodClinicalPractice:ConsolidatedGuidance(ICH-E6沐GuidanceonGeneralConsiderationsforClinicalTrials(ICH-E8)的設計策略，用于測定研究的藥物產(chǎn)品(IMP)安全性和耐受性。臨床試驗應由3個臨床調(diào)查組成l)一個篩選調(diào)查(調(diào)查l);2)—個治療調(diào)査(調(diào)查2);和3)調(diào)查2后8-14天的一個隨訪調(diào)査(調(diào)查3)。單一劑量的GLP-1/FDKP吸入粉末的施用將在調(diào)查2期間發(fā)生。該臨床試驗會評價每隊中的安全性參數(shù)。在主要調(diào)查人(PI)冋顧第一次給藥或先前給藥的所有安全性和耐受性數(shù)據(jù)之前，不對計劃接受下一劑量濃度的小隊進行給藥。應在每隊的受試者之間執(zhí)行半小時的給藥滯后時間，以確保受試者安全。如果小隊中3個或更多的受試者經(jīng)受嚴重的惡心和/或嘔吐，或當達到最大劑量時，或在PI的判斷下，可中止給藥。要評價5種劑量的GLP-1/FDKP吸入粉末(0.05、0.45、0.75、1.05禾口1.5mg的GLP-1)。為了適應所有的劑量，配制好的GLP-1/FDKP將與FDKP吸入粉末混合。將原樣使用或與適當量的FDKP吸入粉末混合使用含10mg干粉的單一劑量藥筒，所述干粉由GLP-1/FDKP吸入粉末組成(15%重量比重量的GLP-1/FDKP)，以獲得想要的GLP-1(0.05mg、0.45mg、0.75mg、1.05mg和1.5mg)劑量1.最低的2個劑量水平將在每隊4個受試者的2隊中評價，3個較高的劑量食品將在每隊6個受試者的3隊61中評價。每個受試者僅接受待評價的5個劑量水平中的l個劑量。除了取血進行GLP-1(活性的和總體的)和FDKP測量外，取樣用于高血糖素、葡萄糖、胰島素和c-肽測定。在該說明書全文中已經(jīng)引用了大量專利和印刷的出版物。每個上述參考文獻和印刷的出版物通過引用以其整體個別地并入本文。除非另有指明，本說明書和權利要求書中使用的表示成分數(shù)量，以及分子量、反應條件等性質(zhì)的所有數(shù)字都應當被理解為在所有情況下，用術語"約"加以了修飾。因此，除非有相反含義的說明，本說明書和所附權利要求書中示出的數(shù)量參數(shù)都是約數(shù)，它們可以根據(jù)本發(fā)明想要獲得的性質(zhì)而變動。至少，并且并非對權利要求書范圍等同原則的應用加以限制，每個數(shù)量參數(shù)至少應按照報道的有效數(shù)字的數(shù)，以及應用普通的湊整技術來解釋。雖然示出本發(fā)明寬廣范圍的數(shù)字范圍和參數(shù)是約數(shù)，但是特別實施例中所示的數(shù)值卻被盡可能地精確報道。但是，任何數(shù)值，必然含有一定誤差，這是它們各自的檢驗測量方法屮發(fā)現(xiàn)的標準偏差必然導致的。木領域技術人員容易理解，在不脫離本發(fā)明的范圍和精神的前提下，可對本發(fā)明進行各種改進。在本文中，在權利要求書和/或說明書中與"包括"一起使用的"一個"一般表示"一個"，但其表示的意思與"一個或多個"、"至少一個"和"一個或多于一個"也是一致的。本文所述的任何方法或組合物可通過本文所述的任何其它方法或組合物來實現(xiàn)。除非明確指出某個可選方式或可選方式之間互相排斥，權利要求中所用術語"或"是指"和/或"。在本文中，術語"約"所表示的值包括確定該值所用設備或方法的標準偏差。根據(jù)實施例以及權利要求書提供的先前描述，可以清楚地看出本發(fā)明的其它目的、特征和優(yōu)點。然而應當理解，詳細描述和具體實施例僅為示例性，而本領域技術人員根據(jù)這些詳細描述在本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)可以62作出各種改變和改進。參考文獻在提供補充本文公開內(nèi)容的示范性歩驟或其它細節(jié)的程度上，以下的參考文獻通過引用被明確地并入本文。ChelikaniPKetal"Intravenousinfusionofglucagon-likepeptide-1potentlyinhibitsfoodintake,shamfeeding,andgastricemptyinginrats.AmJPhysiol.Regul.Integr.Comp.Physiol.，288(6):R1695-706,2005.D'Alessio,etal"J.Clin.Invest"97:133-38，1996.DeaconCF:Therapeuticstrategiesbasedonglucagon-likepeptide1.Diabetes.Sep;53(9):2181-9，2004.Eissele,etal.,LifeSci.,55:629-34,1994.Goke,etal"J.Biol.Chem.268:19650-55，1993JohnsonJDetal:RyR2andcalpain-10delineateanovelapoptosispathwayinpancreaticislets.JBiolChem.，279(23):24794-802,2004.Malhotra,R.,etal"RegulatoryPeptides,41:149-56,1992.MentleinR，etal"DipeptidylpeptidaseIVhydrolysesgastricinhibitorypolypeptide,glucagon-likepeptide-1(7-36)amide，peptidehistidinemethionineandisresponsiblefortheirdegradationinhumanserum.EurJBiochem.，214:829-835,1993.Montrose-Rafizadeh,etal.,Diabetes,45(Suppl.2):152A，1996.NauckMA，etal.,NormalizationoffastinghyperglycemiabyexogenousGLP-l(7-36amide)intype2diabeticpatients.Diabetologia,36:741—744,1993.NauckMA,etal"Effectsofsubcutaneousglucagon-likepeptide1(GLP-l[7-36amide])inpatientswithNIDDM.Diabetologia,39:1546—1553，1996.NauckMA,etal"Effectsofglucagon-likepeptide1oncoimterregulatoryhormoneresponses,cognitivefunctions,andinsulinsecretionduringhyperinsulinemic,steppedhypoglycemicclampexperimentsinhealthyvolunteers.JClinEndocrinolMetab.,87:1239—1246,2002.63Raufman,etal.,J.Biol.Chem.267:21432-37,1992.Raufman,etal.,J.Biol.Chem.266:2897-902,1991Schepp,etal.,Eur.J.Pharmacol.,69:183-91，1994.Singh,etaL,Regul.Pept.53:47-59,1994.SturisJ,etal".BritishJournalofPharmacology,140,123.132，2003.TomuscioloD.R.etal.,Biotechniques19(5):800-805,1995.SimultaneousdetectionofTDT-mediateddUTP-biotinnickend-labeling(TUNEL)-positivecellsandmultipleimmunohistochemicalmarkersinsingletissuesections.VerdichC,etal"Ameta-analysisoftheeffectofglucagon-likepeptide-1(7-36)amideonadlibitumenergyintakeinhumans.JClinEndocrinolMetab.,86:4382—4389,2001.Wangetal.,Glucagon-likepeptide-1regulatesproliferationandapoptosisviaactivationofproteinkinaseBinpancreaticINS-1betacells.Diabetologia,47:478—487，2004.Wang,etal.,J.Clin.Invest,95:417-21,1995.ZanderM,etal"Effectof6-weekcourseofglucagon-likepeptide1onglycaemiccontrol,insulinsensitivity,andbeta-cellfunctionintype2diabetes:aparallel-groupstudy.Lancet,359:824—830，2002.6權利要求1.一種干粉組合物，其包含GLP-1分子和二酮哌嗪或其可藥用鹽。2.權利要求1的干粉組合物，其中所述GLP-1分子選自由以下物質(zhì)組成的組天然的GLP-1、GLP-1代謝產(chǎn)物、GLP-1類似物、GLP-1衍生物、二肽基肽酶-IV(DPP-IV)保護的GLP-1、GLP-1模擬物、GLP-1肽類似物或生物合成的GLP-1類似物。3.權利要求1的干粉組合物，其中所述二酮哌嗪是具有式2,5-二酮-3，6-二(4-X-氨丁基)哌嗪的二酮哌嗪，其中X選自由琥珀酰基、戊二?；?、馬來酰基和宮馬?；M成的組。4.權利要求1的干粉組合物，其包含二酮哌嗪鹽。5.權利要求3的干粉組合物，其中所述二酮哌嗪是2,5-二酮-3,6-二(4-富馬酰-氨r基)哌嗪。6.權利耍求1的干粉組合物，其屮所述GLP-1分子是天然的GLP-1。7.權利要求1的干粉組合物，其中所述GLP-1分子是酰胺化的GLP-1分子。8.權利耍求7的干粉組合物，其屮所述酰胺化的GLP-1分子是GLP-1(7-36)酰胺。9.用于形成包含GLP-1分子和二酮哌嗪的顆粒的方法，所述方法包括歩驟提供GLP-1分子；提供下述形式的二酮哌嗪，所述形式選自能形成顆粒的二酮哌嗪、二酮哌嗪顆粒及其組合；和將所述GLP-1分子與所述二酮哌嗪以共溶液的形式組合，其中形成包含所述GLP-1分子和所述二酮哌嗪的所述顆粒。10.權利要求9的方法，其還包括通過凍干法、過濾或噴霧干燥從所述共溶液中去除溶劑。11.權利要求10的方法，其中通過去除所述溶劑形成包含所述GLP-1分子和所述二酮哌嗪的所述顆粒。12.權利要求10的方法，其中在去除所述溶劑之前形成包含所述GLP-1分子和所述二酮哌嗪的所述顆粒。13.權利要求9的方法，其中所述GLP-1分子選自由以下物質(zhì)組成的組天然的GLP-1、GLP-1類似物、GLP-1衍生物、二肽基-肽酶-IV(DPP-IV)保護的GLP-1、GLP-1模擬物、GLP-1肽類似物或生物合成的GLP-1類似物。14.權利要求9的方法，其中所述GLP-1分子以溶液的形式提供，所述溶液包含約l^g/ml-50mg/ml的GLP-1濃度。15.權利要求9的方法，其中所述GLP-1分子以溶液的形式提供，所述溶液包含約0.1mg/ml-10mg/ml的GLP-1濃度。16.權利耍求9的方法，其屮所述GLP-1分子以溶液的形式提供，所述溶液包含約0.25mg/ml的GLP-1濃度。17.權利要求9的方法，其中所述二酮哌嗪以二酮哌嗪顆粒懸浮液的形式提供。18.權利要求9的方法，其中所述二酮哌嗪以包含能形成顆粒的二酮哌嗪的溶液的形式提供，所述方法還包括調(diào)節(jié)所述溶液的pH以形成二酮哌嗪顆粒。19.權利要求17或18的方法，其還包括向所述溶液或懸浮液中添加試劑，其中所述試劑選自由鹽、表面活性劑、離子、滲透物、離液劑和感膠離子、酸、堿和有機溶劑組成的組。20.權利要求19的方法，其中所述試劑促進所述GLP-1分子和所述二酮哌嗪顆?；蛩瞿苄纬深w粒的二酮哌嗪之間的締合。21.權利要求19的方法，其中所述試劑改善所述GLP-1分子的穩(wěn)定性或藥物動力學。22.權利要求19的方法，其中所述試劑為氯化鈉。23.權利要求17或18的方法，其還包括調(diào)節(jié)所述懸浮液或溶液的pH。24.權利要求23的方法，其中所述pH被調(diào)節(jié)至約4或更大。25.權利要求9的方法，其中所述顆粒屮的所述GLP-1分子具有更高的穩(wěn)定性。26.權利要求9的方法，其中所述共溶液包含約lpg/ml-50mg/ml的GLP-1濃度。27.權利要求9的方法，其中所述共溶液包含約0.1mg/ml-10mg/ml的GLP-1濃度。28.權利要求9的方法，其中所述共溶液包含約0.25mg/ml的GLP-1濃度。29.權利要求9的方法，其還包括向所述共溶液中添加試劑，其中所述試劑選自由鹽、表面活性劑、離子、滲透物、離液劑和感膠離子、酸、堿和有機溶劑組成的組。30.權利要求29的方法，其屮所述試劑促進所述GLP-1分子和所述二酮哌嗪顆?；蛩瞿苄纬深w粒的二酮哌嗪之間的締合。31.權利要求29的方法，其中所述試劑改善所述GLP-1分子的穩(wěn)定性或藥物動力學。32.權利耍求29的方法，其中所述試劑為氯化鈉。33.權利要求9的方法，其還包括調(diào)節(jié)所述共溶液的pH。34.權利要求33的方法，其屮所述pH被調(diào)節(jié)至約4或更大。35.對需要的受試者施用有效量GLP-]分子的方法，所述方法包括對所述受試者提供包含GLP-1和二酮哌嗪的顆粒。36.權利要求35的方法，其屮所述提供通過靜脈內(nèi)、皮V、經(jīng)口、經(jīng)鼻、經(jīng)頰、經(jīng)直腸或通過肺部遞送進行。37.權利要求35的方法，其中所述提供通過肺部遞送進行。38.權利要求35的方法，其中所述需要包括治療選自下組的病癥或疾病，所述組由糖尿病、局部缺血、再灌注組織損傷、血脂障礙、糖尿病性心臟病、心肌梗塞、急性冠狀動脈綜合征、肥胖癥、手術后的分解代謝改變、高血糖癥、過敏性腸綜合征、中風、神經(jīng)變性病癥、記憶和學習障礙、胰島細胞移植和再生性治療組成。39.權利要求35的方法，其中所述顆粒的所述提供導致與天然GLP-1相比改善的藥物代謝動力學半衰期和GLP-1生物利用度。40.形成具有改善的GLP-1藥物代謝動力學模式的粉末組合物的方法，所述方法包括步驟提供GLP-1分子；提供溶液中的能形成顆粒的二酮哌嗪；形成二酮哌嗪顆粒；將所述GLP-1分子與所述溶液組合形成共溶液；和通過噴霧干燥從所述共溶液中去除溶劑，形成具有改善的GLP-1藥物代謝動力學模式的粉末。41.權利要求40的方法，其中所述改善的GLP-1藥物代謝動力學模式包含提高的GLP-1半衰期。42.權利耍求41的方法，其中所述提髙的GLP-1半衰期大-T或等于7.5分鐘。43.權利要求40的方法，其屮所述改善的GLP-1藥物代謝動力學模式包括與天然GLP-1相比改善的GLP-1生物利用度。全文摘要本發(fā)明公開了在體內(nèi)和體外均穩(wěn)定的一種組合物，所述組合物包含與二酮哌嗪(DKP)組合的高血糖素樣肽1(GLP-1)顆粒。該組合物可用作治療疾病的藥物制劑，所述疾病如糖尿病、癌癥和肥胖癥但不僅限于這類疾病或病癥。本組合物尤其可用作肺部遞送的藥物制劑。文檔編號A61K9/16GK101453988SQ200780013424公開日2009年6月10日申請日期2007年4月16日優(yōu)先權日2006年4月14日發(fā)明者凱斯·奧伯格,大衛(wèi)·布蘭特,安德里亞·勒龍-貝,斯蒂芬尼·戈恩,柯哈瓦·蓋爾伯,瑪麗·法瑞斯,韋曼·溫蒂爾·師特漢姆,馬克·J·豪肯森,馬克·金申請人:曼金德公司