利用超高液相色譜串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜檢測(cè)右旋酮洛芬氨丁三醇溫敏水凝膠中入血成分的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種利用超高液相色譜串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜檢測(cè)右旋酮洛芬氨丁三醇溫敏水凝膠中入血成分的方法，包括以下步驟：將待測(cè)樣品經(jīng)處理后，采用超高液相色譜?串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜檢測(cè)。該方法檢測(cè)靈敏度高、專屬性強(qiáng)、檢測(cè)效率高，為體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)研究提供了準(zhǔn)確、可靠、快速的分析方法。
【專利說明】
利用超高液相色譜串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜檢測(cè)右旋酮洛芬氨丁三醇 溫敏水凝膠中入血成分的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)藥分析技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種利用超高液相色譜串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜 檢測(cè)右旋酮洛芬氨丁三醇溫敏水凝膠中入血成分的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 右旋酮洛芬氨丁三醇（dexketoprofen trometamol，DKPF)是2-芳基丙酸類非留體 抗炎藥(Non-steroidal anti-inflammatory drug，NSAIDs)酮洛芬的活性光學(xué)異構(gòu)體右旋 酮洛芬的水溶性鹽，具有明顯的抗炎、解熱、鎮(zhèn)痛作用。臨床上主要用于緩解各類疼痛，特別 是骨關(guān)節(jié)疼痛、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等。但目前右旋酮洛芬氨丁三醇在國(guó)內(nèi)外上市的制劑僅為 普通制劑，而普通制劑存在半衰期短，給藥頻繁，胃腸道不良反應(yīng)大等缺點(diǎn)。溫敏水凝膠是 一種溫度響應(yīng)型的智能材料，可以通過感知溫度的變化而產(chǎn)生功能性的效應(yīng)。其優(yōu)越性在 于體外為無定形的液體，可以方便的注射至生物體內(nèi)，隨給藥部位的形態(tài)特點(diǎn)，形成各種不 同的形狀，因而可以應(yīng)用于多種部位的局部給藥，并起到控制藥物釋放的作用。
[0003] 現(xiàn)有通過高效液相來檢測(cè)右旋酮洛芬氨丁三醇溫敏水凝膠中入血成分的方法，存 在著準(zhǔn)確性、可靠性差等缺點(diǎn)，不能對(duì)右旋酮洛芬氨丁三醇溫敏水凝膠的體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué) 進(jìn)行很好的研究。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種利用超高液相色譜串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜檢測(cè)右 旋酮洛芬氨丁三醇溫敏水凝膠中入血成分的方法，該方法靈敏性高、專屬性強(qiáng)、檢測(cè)效率 尚。
[0005] 為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的技術(shù)方案為一種利用超高液相色譜串聯(lián)四級(jí)桿 質(zhì)譜檢測(cè)右旋酮洛芬氨丁三醇溫敏水凝膠中入血成分的方法，其特征在于，包括以下步驟： 將待測(cè)樣品經(jīng)處理后，采用超高液相色譜-串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜檢測(cè)。
[0006] 作為優(yōu)選，所述待測(cè)樣品的處理方法包括以下步驟：精密量取血漿5〇yL，置于 1.5mL管中，先補(bǔ)加50yL甲醇，再依次加入內(nèi)標(biāo)物質(zhì)布洛芬30yL，甲醇200yL，渦混2min，超聲 10min，4°C、15000r · min-1離心10min，取上清液于2mL管中，45°C氮吹儀吹干，500yL甲醇復(fù) 溶，渦混，超聲，離心，取上清液，得待測(cè)樣品，備用。
[0007] 作為優(yōu)選，所述色譜的條件為：色譜柱:Waters BEH (：18柱，規(guī)格為2.1mmX50mm， 1·7μπι;柱溫:45°C;流速:0.35mL/min;流動(dòng)相:A相:0.1%甲酸乙腈，B相:0.1%甲酸水;進(jìn)樣 體積：lyL;
[0008] 所述質(zhì)譜的條件為：電噴霧電離源；離子源溫度：120°c;毛細(xì)管電離電壓：3kV;去 溶劑氣:N2,流速650L · h-S反吹氣:N2,流速:50L · h-S去溶劑氣溫度:350°C;碰撞氣：Ar， 流速:〇. 16mL · mirT1;質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集及處理軟件為MassLynx V4.1工作站，掃描方式為多反 應(yīng)離子監(jiān)測(cè)，入血成分右旋酮洛芬氨丁三醇及內(nèi)標(biāo)物質(zhì)布洛芬用于定量分析的監(jiān)測(cè)離子反 應(yīng)分別為m/z 255. l - 104.7、m/z 417.0-267.0。
[0009] 作為優(yōu)選，所述色譜中采用流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，洗脫時(shí)間為0~2min時(shí)，A相的體 積百分比為30%，B相的體積百分比為70%;2!^11<洗脫時(shí)間<3min，A相的體積百分比為 95% %，B相的體積百分比為5% ;洗脫時(shí)間2 3min時(shí)，A相的體積百分比為30%，B相的體積 百分比為70 %。
[0010] 本發(fā)明方法利用超高液相色譜串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜檢測(cè)，靈敏性高、專屬性強(qiáng)、檢測(cè)效 率高。
【附圖說明】
[0011] 圖1為空白樣品色譜圖A;
[0012 ]圖2加入DKPF溶液和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)溶液的色譜圖B;
[0013]圖3給藥大鼠血漿的色譜圖C;
[0014] 圖4為DKPF標(biāo)準(zhǔn)曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0015] 下面對(duì)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】作進(jìn)一步說明。在此需要說明的是，對(duì)于這些實(shí)施 方式的說明用于幫助理解本發(fā)明，但并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的限定。此外，下面所描述的本發(fā)明 各個(gè)實(shí)施方式中所涉及的技術(shù)特征只要彼此之間未構(gòu)成沖突就可以相互組合。
[0016] 1、儀器
[0017] Waters超高效液相色譜一三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀(AcquityTM UPLC系統(tǒng)， MassLynx V4.1工作站，包括二元高壓梯度栗、自動(dòng)進(jìn)樣器、電噴霧電離源等）；Allegra64R 低溫高速離心機(jī)(美國(guó)Beckman Coulter公司）；MTN-2800D氮吹濃縮裝置(奧特塞恩斯儀器 公司）；CQ250A-TS超聲波清洗機(jī)(上海躍進(jìn)醫(yī)用光學(xué)機(jī)械廠）；EL204電子分析天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司）；Eppend 〇rf移液器(艾本德中國(guó)有限公司）；ZH-2渦旋混合器(天 津藥典標(biāo)準(zhǔn)儀器廠）；TGL-16G離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠）。
[0018] 2、試藥
[0019]右旋酮洛芬氨丁三醇原料藥(批號(hào)20110301，純度99.8%，武漢遠(yuǎn)成共創(chuàng)科技有限 公司）；右旋酮洛芬氨丁三醇溫敏水凝膠(批號(hào)20121201自制）；色譜甲醇(天津科密歐化學(xué) 試劑有限公司）；色譜乙腈(德國(guó)Merck公司）；實(shí)驗(yàn)用水為超純水;其它溶劑均為分析純。 [0020] 3、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
[0021] SD大鼠，雌雄兼用，體重200~250g，由貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證 號(hào) SCXK(黔)2007-0001。
[0022] 4、方法-采用超高液相色譜-串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜來進(jìn)行檢測(cè)
[0023] 色譜的條件為：色譜柱:Waters BEH (：18柱，規(guī)格為2.1mmX50mm，1.7ym;柱溫:45 °C ;流速:0.35mL/min;流動(dòng)相:A相：0.1 %甲酸乙腈，B相:0.1 %甲酸水;進(jìn)樣體積：lyL;其 中，采用流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，洗脫時(shí)間為0~2min時(shí)，A相的體積百分比為30%，B相的體積 百分比為7 0 % ; 2 m i η <洗脫時(shí)間< 3 m i η，A相的體積百分比為9 5 % %，B相的體積百分比為 5% ;洗脫時(shí)間2 3min時(shí)，A相的體積百分比為30%，B相的體積百分比為70%。
[0024]質(zhì)譜的條件為：電噴霧電離源；離子源溫度：120°C;毛細(xì)管電離電壓：3kV;去溶劑 氣:N2,流速650L · h-S反吹氣:N2,流速:50L · h-S去溶劑氣溫度:350°C;碰撞氣:Ar，流速： 0.16mL ?mirT1;質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集及處理軟件為MassLynx V4.1工作站，掃描方式為多反應(yīng)離子 監(jiān)測(cè)，入血成分右旋酮洛芬氨丁三醇及內(nèi)標(biāo)物質(zhì)布洛芬用于定量分析的監(jiān)測(cè)離子反應(yīng)分別 為m/z 255.1 - 104.7、m/z 417.0-267.0。
[0025] 5、待測(cè)血漿樣品的處理方法
[0026]精密量取血漿50yL，置于1.5mL管中，先補(bǔ)加50yL甲醇，再依次加入內(nèi)標(biāo)物質(zhì)布洛 芬30yL，甲醇200yL，禍混2min，超聲 10min，4°C、15000r · min-1離心 lOmin，取上清液于2mL管 中，45°C氮吹儀吹干，500yL甲醇復(fù)溶，渦混，超聲，離心，取上清液，得待測(cè)樣品，備用。
[0027] 6、專屬性試驗(yàn)
[0028]精密量取血漿50yL，除不加入內(nèi)標(biāo)物質(zhì)外，其余同上述"待測(cè)血漿樣品的處理方 法"操作，獲得空白樣品色譜圖A，見圖1。
[0029]取空白大鼠血漿50yL加50yL的DKPF溶液及30yL的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)溶液，其余同上述"待 測(cè)血漿樣品的處理方法"操作，獲色譜圖B，見圖2。
[0030] 取給藥大鼠血漿，其余同上述"待測(cè)血漿樣品的處理方法"操作，獲得色譜圖C，見 圖3。
[0031] 從圖1-3可以看出DPKF與布洛芬（內(nèi)標(biāo))的分離良好，基質(zhì)無干擾。
[0032] 7、標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立
[0033]將一定濃度的DKPF溶液，按一定比例稀釋，配置成一系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別取 大鼠空白血漿50yL置于1.5mL EPP管中，加入上述標(biāo)準(zhǔn)溶液50yL，配制成相當(dāng)于大鼠血漿的 藥物濃度分別為0.21、0.62、1.84、5.53、16.6、49.8、149.4以 811/1，其余同上述"待測(cè)血漿 樣品的處理方法"操作。記錄色譜峰面積，以待測(cè)物與內(nèi)標(biāo)物峰面積之比(A/Ai)為縱坐標(biāo)Y， 濃度(C)為橫坐標(biāo)，X用加權(quán)最小二乘法進(jìn)行線性回歸，權(quán)重系數(shù)為1/X作圖，求得標(biāo)準(zhǔn)曲線 方程為 Y=1.22394C+0.149377，r = 0.9971，線性范圍為 0.21 ~149.4yg/mL。見圖 4。
[0034] 8、精密度與準(zhǔn)確度
[0035]按"7、標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立"項(xiàng)下的方法，分別配制含內(nèi)標(biāo)物質(zhì)和DKPF溶液的大鼠血漿 低、中、高三個(gè)濃度(分別為0.21、1.84、16.60yg · mL-1)的質(zhì)量控制樣品，3種不同濃度連續(xù) 測(cè)定6次，計(jì)算日內(nèi)精密度;3種不同濃度每天測(cè)1次，連續(xù)測(cè)3d，計(jì)算日間精密度，結(jié)果表明 DKPF日內(nèi)和日間精密度RSD( % )均小于6.14%，準(zhǔn)確度范圍為100.23%~128.88%，提示該 方法符合生物樣品分析的要求，可以保證測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性以及重現(xiàn)性。結(jié)果見表1。
[0036]表1右旋酮洛芬氨丁三醇在大鼠血漿中的準(zhǔn)確度及日內(nèi)、日間精密度 [0037] ± ? 3days)
[0039] 9、基質(zhì)效應(yīng)和提取回收率
[0040]按"7、標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立"項(xiàng)下的方法，分別配制含內(nèi)標(biāo)物質(zhì)和DKPF溶液的大鼠血漿 低、中、高三個(gè)濃度(分別為0.21、1.84、16.60yg · mL-1)的質(zhì)量控制樣品(QC，A樣品），3個(gè)濃 度均進(jìn)行5樣本分析。另取上述低、中、高濃度(分別為0.21、1.84、16.60yg · mL-1)的標(biāo)液與 內(nèi)標(biāo)，氮吹儀吹干，殘留物以500yL初始流動(dòng)相溶解(B樣品）；另取空白血漿50yL，除不加內(nèi) 標(biāo)與標(biāo)液外，其余均按血漿樣品處理方法操作，并將低、中、高濃度（分別為0.21、1.84、 16.60yg · mL-1)的標(biāo)液和內(nèi)標(biāo)加入至對(duì)應(yīng)的上清液中，氮吹儀吹干，殘留物以500yL初始流 動(dòng)相溶解(C樣品），內(nèi)標(biāo)以同樣方法進(jìn)行考察。基質(zhì)效應(yīng)為C樣品與B樣品峰面積之比，提取 回收率為C樣品與A樣品峰面積之比，經(jīng)測(cè)定DKPF線性范圍內(nèi)低、中、高3個(gè)濃度的血漿樣品 基質(zhì)效應(yīng)分別為：1〇〇· 59 %、96· 68 %、94· 70 %，提取回收率分別為：96.86 %、103.39%、 99.53%〇
[00411結(jié)果表明DKPF的提取回收率良好，且不存在明顯的基質(zhì)效應(yīng)，符合生物樣品分析 測(cè)定的要求，見表2。
[0042] 表2右旋酮洛芬氨丁三醇在大鼠血漿中的基質(zhì)效應(yīng)和提取回收率（·、_ ± n=5)
[0043]
[0044] 10、穩(wěn)定性考察
[0045]按"7、標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立"項(xiàng)下的方法，分別配制含內(nèi)標(biāo)物質(zhì)和DKPF溶液的大鼠血漿 低、中、高三個(gè)濃度(分別為0.21、1.84、16.60yg · mL-1)的質(zhì)量控制樣品（QC)，置于自動(dòng)進(jìn) 樣器中，分別于Oh，6h進(jìn)樣，考察處理后的血漿樣品在自動(dòng)進(jìn)樣器中的穩(wěn)定性，3個(gè)濃度均進(jìn) 行5樣本分析。另將上述QC樣品分別于室溫(約20°C)下放置6h，冷藏(4°C)下放置8h，凍融循 環(huán)3次，經(jīng)處理后進(jìn)樣，考察血漿中檢測(cè)成分于室溫，冷藏，反復(fù)凍融3種條件下的穩(wěn)定性，3 個(gè)濃度均進(jìn)行5樣本分析，經(jīng)測(cè)定，各濃度下所得到的峰面積與零時(shí)間點(diǎn)的偏差均在10%以 內(nèi)，提示實(shí)驗(yàn)條件下DKPF的大鼠血漿樣品穩(wěn)定性良好，見表3。
[0046] 表3右旋酮洛芬氨丁三醇在大鼠血漿中的穩(wěn)定性(T ± Λ7Χ ?=5)
[0047]
[0048]由上可知，本發(fā)明建立了血漿樣品中DKPF的UPLC-MS/MS分析方法，該方法檢測(cè)靈 敏度高、專屬性強(qiáng)、檢測(cè)效率高，為體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)研究提供了準(zhǔn)確、可靠、快速的分析方 法。
[0049]以上對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方式作了詳細(xì)說明，但本發(fā)明不限于所描述的實(shí)施方式。對(duì) 于本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言，在不脫離本發(fā)明原理和精神的情況下，對(duì)這些實(shí)施方式進(jìn)行多 種變化、修改、替換和變型，仍落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種利用超高液相色譜串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜檢測(cè)右旋酮洛芬氨丁三醇溫敏水凝膠中入 血成分的方法，其特征在于，包括以下步驟:將待測(cè)樣品經(jīng)處理后，采用超高液相色譜-串聯(lián) 四級(jí)桿質(zhì)譜檢測(cè)。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用超高液相色譜串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜檢測(cè)右旋酮洛芬氨丁 三醇溫敏水凝膠中入血成分的方法，其特征在于，所述待測(cè)樣品的處理方法包括以下步驟： 精密量取血漿50此，置于1.5mL管中，先補(bǔ)加50yL甲醇，再依次加入內(nèi)標(biāo)物質(zhì)布洛芬30yL，甲 醇200yL，禍混2min，超聲 10min，4°C、15000r · min-1 離心10min，取上清液于2mL管中，45°C氮 吹儀吹干，500yL甲醇復(fù)溶，渦混，超聲，離心，取上清液，得待測(cè)樣品，備用。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用超高液相色譜串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜檢測(cè)右旋酮洛芬氨丁 三醇溫敏水凝膠中入血成分的方法，其特征在于， 所述色譜的條件為：色譜柱:Waters BEH (：18柱，規(guī)格為2.1mmX50mm，1.7ym;柱溫:45 °C ;流速:0.35mL/min;流動(dòng)相:A相:0.1 %甲酸乙腈，B相:0.1 %甲酸水;進(jìn)樣體積：lyL; 所述質(zhì)譜的條件為：電噴霧電離源；離子源溫度：120°C;毛細(xì)管電離電壓：3kV;去溶劑 氣:N2,流速650L · h-S反吹氣:N2,流速:50L · h-S去溶劑氣溫度:350°C;碰撞氣:Ar，流速： 0.16mL ?mirT1;質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集及處理軟件為MassLynx V4.1工作站，掃描方式為多反應(yīng)離子 監(jiān)測(cè)，入血成分右旋酮洛芬氨丁三醇及內(nèi)標(biāo)物質(zhì)布洛芬用于定量分析的監(jiān)測(cè)離子反應(yīng)分別 為m/z 255.1 - 104.7、m/z 417.0-267.0。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種利用超高液相色譜串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜檢測(cè)右旋酮洛芬氨丁 三醇溫敏水凝膠中入血成分的方法，其特征在于，所述色譜中采用流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，洗 脫時(shí)間為〇~2min時(shí)，A相的體積百分比為30 %，B相的體積百分比為70% ; 211^11<洗脫時(shí)間 <3min，A相的體積百分比為95% %，B相的體積百分比為5% ;洗脫時(shí)間2 3min時(shí)，A相的體 積百分比為30%，B相的體積百分比為70%。
【文檔編號(hào)】G01N30/02GK105866273SQ201610200423
【公開日】2016年8月17日
【申請(qǐng)日】2016年4月1日
【發(fā)明人】黃勇, 鄭林, 王永林, 李勇軍, 蘭燕宇, 王愛民, 廖尚高, 楊暢, 孫佳, 李月婷, 陸苑, 陳思穎, 鞏仔鵬
【申請(qǐng)人】貴州醫(yī)科大學(xué)