一種同時測定小麥中抗倒酯及抗倒酸殘留量的hplc方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種同時測定小麥中抗倒酯及抗倒酸殘留量的HPLC方法，將小麥樣品制備好后，采用乙腈振蕩提取，抽濾濃縮至近干，經(jīng)酸性色譜甲醇定容后，加入硅膠和無水硫酸鎂分散固相萃取凈化后，渦旋，離心，過微孔濾膜，形成樣品溶液；樣品溶液采用帶紫外檢測器的高效液相色譜儀測定，色譜柱為Agilent Zorbax色譜柱，柱溫為35℃，流速為0.6mL/min，進樣量為20uL，流動相為甲醇和質(zhì)量濃度為0.1％磷酸水溶液組成的混合溶液，甲醇和磷酸水溶液的體積比為65：35，波長為280nm，外標法定量測定抗倒酯和抗倒酸的含量。
【專利說明】
一種同時測定小麥中抗倒酯及抗倒酸殘留量的HPLC方法
技術領域
[0001] 本發(fā)明涉及一種農(nóng)藥及其代謝物殘留量的分析方法，具體涉及一種利用高效液相 色譜儀同時測定小麥中抗倒酯及其代謝物抗倒酸殘留量的方法。
【背景技術】
[0002] 抗倒酯英文通用名稱：trinexapac-ethyl，化學名稱:4一環(huán)丙基(羥基）亞甲基一 3，5-二氧代環(huán)己烷羧酸乙酯，化學分子式:C 13H1605，由汽巴-嘉基公司開發(fā)而成，屬環(huán)己烷 羧酸類植物生長調(diào)節(jié)劑，為赤霉素生物合成抑制劑，通過降低赤霉素的含量控制植物生長。 抗倒酯可被植物莖、葉迅速吸收，根部吸收很少。可在禾谷類作物、小麥、甘蔗等多種作物上 使用。有文獻報道于小麥分蘗末期進行葉面噴霧處理1次，有效的降低小麥株高，可防止小 麥倒伏。
[0003] 中國暫未制定小麥上抗倒酯和抗倒酸的最大殘留限量值(MRL)，日本規(guī)定小麥上 抗倒酯為〇. 6mg/kg，歐盟規(guī)定了大麥、黑麥和小麥上的抗倒酸為0.5mg/kg。
[0004] 《分析試驗室2014,33(6)》公開了用超高效液相色譜一串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定小麥 和土壤中抗倒酯及其代謝物殘留量的方法?！禟orean Journal of Environmental Agriculture 2015;34(4)》公開了用超高效液相色譜一串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定農(nóng)產(chǎn)品中的抗 倒酯及其代謝物抗倒酸的方法。
[0005] 超高效液相色譜一串聯(lián)質(zhì)譜儀價格高昂，且平時維護費用較高，而高效液相色譜 儀(HPLC)以其高靈敏度和高精度的技術優(yōu)勢，目前仍然是我國大多數(shù)實驗室分析環(huán)境介質(zhì) 和各種作物體中抗倒酯及其代謝物殘留量的首選方法，但是，國內(nèi)外鮮有采用HPLC同時測 定抗倒酯及其代謝物抗倒酸在小麥和土壤等基質(zhì)中殘留量的研究。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明目的是提供一種能利用高效液相色譜儀同時測定小麥中抗倒酯及其代謝 物抗倒酸殘留量的方法。
[0007] 本發(fā)明提供的基于高效液相色譜儀的同時測定小麥中抗倒酯及其代謝物抗倒酸 殘留量的方法，包括以下步驟：
[0008] 步驟一混合標準溶液的配制及測定
[0009] 分別準確稱取抗倒酯和抗倒酸標準品，用色譜甲醇溶解并配制成單獨標準母液， 然后采用梯度稀釋法分別取抗倒酯和抗倒酸標準母液配制成抗倒酯和抗倒酸的混合標準 溶液，分別配制5 - 7檔質(zhì)量濃度為0.05~5.00mg/L的抗倒酯和抗倒酸的混合標準溶液，并 采用外標法定量分別注入HPLC中進行測定，以各混合標準溶液抗倒酯、抗倒酸的質(zhì)量濃度C 為橫坐標、相應的色譜峰面積A1為縱坐標分別繪制抗倒酯、抗倒酸的標準工作曲線，得到抗 倒酯、抗倒酸回歸方程:抗倒酯A1 = 84.929C+0.3868，抗倒酸A1 = 79.991C-0.4275，且回歸 方程的相關系數(shù)R2>〇.999 6，其中HPLC測定色譜條件為:高效液相色譜儀為帶紫外檢測器 的高效液相色譜儀，色譜柱為長度250mm，內(nèi)徑4.6mm，粒徑為5um的Agilent Zorbax C-18色 譜柱，柱溫為35°C，流速為0.6mL/min，進樣量為20uL，流動相為甲醇和質(zhì)量濃度為0.1 %磷 酸水溶液組成的混合溶液，甲醇和磷酸水溶液的體積比為65:35，波長為280nm;
[0010] 步驟二樣品前處理
[0011] 將采集的小麥進行剪碎或粉碎后，形成質(zhì)量為m的小麥樣品；
[0012] 步驟三抗倒酯和抗倒酸的提取
[0013] 準確稱取步驟二制備好的小麥樣品置于容器中，加入乙腈使其淹沒小麥樣品，并 用磷酸溶液調(diào)節(jié)其pH值至酸性，在30°C~35°C下振蕩提取30min~60min，之后經(jīng)布氏漏斗 減壓抽濾，再用乙腈分兩次洗滌殘渣，收集全部濾液并放在旋轉蒸發(fā)儀上于45°C濃縮至近 干形成小麥提取濃縮液；
[0014] 步驟四小麥提取濃縮液的凈化
[0015] 將步驟三制備的小麥提取濃縮液用酸性色譜甲醇定容為V體積后，轉入離心管中， 再加入硅膠和無水硫酸鎂，在渦旋混合儀上渦旋，然后在離心機上以3800r/min離心，取上 清液過0.45μπι微孔濾膜，形成樣品溶液，待HPLC檢測；
[0016] 步驟五樣品溶液中抗倒酯和抗倒酸殘留量測定結果的計算
[0017] 采用外標法，運用步驟一測定混合標準溶液的色譜條件對樣品溶液進行HPLC測 定，測得樣品溶液中抗倒酯或抗倒酸的色譜峰面積Α2,代入殘留量計算公式，求得樣品溶液 中抗倒酯及其代謝物抗倒酸的質(zhì)量濃度，即得樣品溶液中抗倒酯及其代謝物抗倒酸的殘留 量，其中殘留量計算公式如下：
[0019]式中:Χ-樣品溶液中抗倒酯或抗倒酸的殘留量，mg/kg;
[0020] C 一混合標準溶液中抗倒酯或抗倒酸的濃度，mg/L;
[0021] V-樣品最終定容體積，ml;
[0022] A1 -混合標準溶液中的抗倒酯或抗倒酸的峰面積；
[0023] A2-樣品溶液中的抗倒酯或抗倒酸的峰面積；
[0024] m-樣品質(zhì)量，g。
[0025] 所述小麥為小麥植株或小麥麥粒，所述小麥植株剪碎為0.5cm后形成小麥樣品，所 述小麥麥粒經(jīng)植物粉碎機粉碎并過20目篩形成小麥樣品。
[0026]所述步驟二中將乙腈淹沒的小麥樣品用磷酸溶液調(diào)節(jié)其pH值至3.0~3.5。
[0027] 所述酸性色譜甲醇通過在每10mL色譜甲醇中加1滴分析純磷酸而制得。
[0028]所述高效液相色譜儀為美國安捷倫公司生產(chǎn)的1260型高效液相色譜儀。
[0029] 本發(fā)明人利用抗倒酯和抗倒酸在酸性條件下離解減弱而溶于有機溶劑的特點，對 小麥麥粒和小麥植株中殘留的抗倒酯和抗倒酸進行同時提取、凈化并采用HPLC進行分離與 檢測。該方法線性相關系數(shù)均大于0.9996，最小檢出量均為2.0 X10_9g，平均回收率在 73.12-105.45%之間，相對標準偏差(RSD)在5.54-10.31 %范圍內(nèi)，方法的靈敏度、準確度 和精密度都符合農(nóng)藥殘留檢測的要求。
【附圖說明】
[0030] 圖1抗倒酯和抗倒酸混合標準溶液(5mg/kg)的色譜分離圖。
[0031]圖2麥粒的空白樣品色譜圖。
[0032]圖3麥粒添加 0.50mg/kg的色譜分離圖。
[0033]圖4小麥植株空白樣品色譜圖。
[0034]圖5小麥植株添加 0.50mg/kg的色譜分離圖。
【具體實施方式】
[0035]下面的實施例是對本發(fā)明的進一步詳細描述。
[0036] 實施例1:
[0037] (1)樣品前處理
[0038]小麥植株樣品：采集的小麥植株樣品，經(jīng)剪碎為0.5cm左右。麥粒樣品:將上述采回 的麥粒樣品經(jīng)植物粉碎機粉碎并過20目篩。
[0039] (2)抗倒酯及其代謝物抗倒酸的提取
[0040]準確稱取已制備好的小麥植株（或麥粒樣品）樣品10. 〇g，置于250mL具塞三角瓶 中，加入40mL乙腈，并用適量的磷酸溶液調(diào)節(jié)其pH值至酸性(pH值為3.0~3.5)，在35°C下振 蕩提取30min~60min，之后經(jīng)布氏漏斗減壓抽濾，再用30mL乙腈分兩次洗滌殘渣，收集全部 濾液轉入250mL磨口三角瓶中，在旋轉蒸發(fā)儀(45°C)上濃縮至近干，形成提取濃縮液。
[0041 ] (3)提取濃縮液的凈化
[0042]將提取濃縮液利用硅膠進行分散固相萃取凈化，具體操作是將上述小麥植株或麥 粒樣品的提取濃縮液用酸性色譜甲醇（10mL色譜甲醇中加1滴分析純的磷酸）定容至2.OmL 后，轉入5. OmL離心管中，再加入0.2g硅膠和0.05g無水硫酸鎂，在渦旋混合儀上渦旋2min， 然后在離心機上以3800r/min離心2min，取上清液過0.45μηι微孔濾膜，形成樣品溶液，待 HPLC檢測。
[0043] (4)混合標準溶液的配制
[0044]分別準確稱取抗倒酯（純度為99.0 % )和抗倒酸（純度為99.0%)標準品各 O.lOlOg，用色譜甲醇溶解并配制成質(zhì)量濃度為l〇〇〇.〇mg/L的單獨標準母液。然后采用梯度 稀釋法分別取抗倒酯和抗倒酸的標準母液配制成抗倒酯和抗倒酸的混合標準溶液，分別配 制抗倒酯和抗倒酸的質(zhì)量濃度均為〇. 05、0.10、0.50、1.00、5.00mg/L的混合標準溶液，并分 別注入HPLC中進行測定，分別以抗倒酯、抗倒酸的質(zhì)量濃度(x，mg/L)為橫坐標、相應的色譜 峰面積(y)為縱坐標分別繪制抗倒酯、抗倒酸的標準工作曲線，進而得到抗倒酯、抗倒酸的 回歸方程和相關系數(shù)如表1所示。根據(jù)信噪比RSN=3,測得各物質(zhì)的最小檢出量。
[0045] 表1抗倒酯和抗倒酸的回歸方程、相關系數(shù)和最低檢測濃度
[0046]
[0047] 由表1可知，各物質(zhì)在一定線性范圍內(nèi)的峰面積與質(zhì)量濃度呈良好的線性關系，相 關系數(shù)均大于0.9996。同時最低檢測限（最低檢測濃度和最小檢出量)表明，此方法可以檢 測到含量較低的物質(zhì)。因此該方法可對樣品進行準確分析且具有較高的靈敏度。
[0048] (5)高效液相色譜分析
[0049]由此確定抗倒酯和抗倒酸HPLC測定的色譜條件如下：高效液相色譜儀：1260型高 效液相色譜儀(美國安捷倫公司）紫外檢測器；色譜柱:Agilent Zorbax色譜柱（250mmX 4.6mm，5. Oum);柱溫:35°C ;流速:0.6mL/min;進樣量:20uL;流動相為甲醇:0.1 %磷酸水溶 液（65:35，￥八）；波長：28〇11111〇
[0050]在上述色譜分析條件下，標準物質(zhì)抗倒酸的相對保留時間為6.9min左右，抗倒酯 的相對保留時間為12.4min左右(見圖1)。
[0051 ] (6)回收率和精密度
[0052] 分別向小麥植株和麥粒樣品中添加抗倒酯和抗倒酸的混合標準溶液，使抗倒酯和 抗倒酸的質(zhì)量濃度分別為〇. 10、〇. 50和5.00mg/kg，共3檔濃度，每檔濃度重復5次，用上述選 定的色譜條件分析與檢測測定其回收率，結果見表2。
[0053] 表2抗倒酯及抗倒酸在小麥植株和麥粒中的加標回收率及其相對標準偏差(n = 5)
[0054]
[0055] 由此可見，本發(fā)明建立了 HPLC法同時檢測小麥中抗倒酯及其代謝物，該方法線性 相關系數(shù)均大于〇. 9996，最小檢出量均為2.0 X 10_9g，最小檢測濃度均為0.05mg/kg，平均回 收率在73.12-105.45%之間，相對標準偏差(RSD)在5.54-10.31 %范圍內(nèi)，方法的靈敏度、 準確度和精密度都符合農(nóng)藥殘留檢測的要求。
[0056] (7)樣品溶液中抗倒酯或抗倒酸殘留量測定結果的計算
[0057] 運用上述色譜條件對樣品溶液進行HPLC測定，測得樣品溶液中抗倒酯和抗倒酸的 色譜峰面積，代入殘留量計算公式，求得樣品溶液中抗倒酯及其代謝物抗倒酸的質(zhì)量濃度， 即得樣品溶液中抗倒酯及其代謝物抗倒酸的殘留量。殘留量計算公式如下：
[0059] 式中:X -樣品溶液中抗倒酯或抗倒酸的殘留量，mg/kg;
[0060] C 一混合標準溶液中抗倒酯或抗倒酸的濃度，mg/L;
[0061 ] V-樣品最終定容體積(提取濃縮液凈化中的定容體積），ml;
[0062] A1 -混合標準溶液中的抗倒酯或抗倒酸的峰面積；
[0063] A2-樣品溶液中的抗倒酯或抗倒酸的峰面積；
[0064] m-樣品前處理后的樣品質(zhì)量，g。
[0065] (8)實際樣品的測定
[0066] 采用上述方法對2015年采集于湖南省長沙市東岸鄉(xiāng)施以不同含量抗倒酯、不同施 藥次數(shù)的小麥植株和麥粒樣品進行抗倒酯及其代謝物抗倒酸殘留量檢測，部分結果見表3- 4〇
[0067] 表3抗倒酯在小麥麥桿和麥粒中的殘留量
[0068]
[0069]注:ND系指抗倒酯在麥桿和麥粒中的殘留量低于其最小檢測濃度(0.10mg/kg)，其 中麥桿以風干麥桿重量計。
[0070] 表4抗倒酸在小麥麥桿和麥粒中的殘留量
[0071]
[0072]注:ND系指抗倒酸在麥桿和麥粒中的殘留量低于其最小檢測濃度(0.10mg/kg)，其 中麥桿以風干麥桿重量計。
【主權項】
1. 一種同時測定小麥中抗倒酯及抗倒酸殘留量的HPLC方法，其特征在于包括： 步驟一混合標準溶液的配制及測定 分別準確稱取抗倒酯和抗倒酸標準品，用色譜甲醇溶解并配制成單獨標準母液，然后 采用梯度稀釋法分別取抗倒酯和抗倒酸標準母液配制成抗倒酯和抗倒酸的混合標準溶液， 分別配制5 - 7檔質(zhì)量濃度為0.05~5.OOmg/L的抗倒酯和抗倒酸的混合標準溶液，并采用外 標法定量分別注入HPLC中進行測定，以各混合標準溶液抗倒酯、抗倒酸的質(zhì)量濃度C為橫坐 標、相應的色譜峰面積A1為縱坐標分別繪制抗倒酯、抗倒酸的標準工作曲線，得到抗倒酯、 抗倒酸回歸方程:抗倒酯A1 = 84.929C+0.3868，抗倒酸A1 = 79.991C-0.4275，且回歸方程的 相關系數(shù)R2>〇.999 6，其中HPLC測定色譜條件為:高效液相色譜儀為帶紫外檢測器的高效 液相色譜儀，色譜柱為長度250mm，內(nèi)徑4.6mm，粒徑為5um的Agilent Zorbax C-18色譜柱， 柱溫為35°C，流速為0.6mL/min，進樣量為20uL，流動相為甲醇和質(zhì)量濃度為0.1 %磷酸水溶 液組成的混合溶液，甲醇和磷酸水溶液的體積比為65:35，波長為280nm; 步驟二樣品前處理 將采集的小麥進行剪碎或粉碎后，形成質(zhì)量為m的小麥樣品； 步驟三抗倒酯和抗倒酸的提取 準確稱取步驟二制備好的小麥樣品置于容器中，加入乙腈使其淹沒小麥樣品，并用磷 酸溶液調(diào)節(jié)其pH值至酸性，在30°C~35°C下振蕩提取30min~60min，之后經(jīng)布氏漏斗減壓 抽濾，再用乙腈分兩次洗滌殘渣，收集全部濾液并放在旋轉蒸發(fā)儀上于45°C濃縮至近干形 成小麥提取濃縮液； 步驟四小麥提取濃縮液的凈化 將步驟三制備的小麥提取濃縮液用酸性色譜甲醇定容為V體積后，轉入離心管中，再加 入硅膠和無水硫酸鎂，在渦旋混合儀上渦旋，然后在離心機上以3800r/min離心，取上清液 過0.45μπι微孔濾膜，形成樣品溶液，待HPLC檢測； 步驟五樣品溶液中抗倒酯和抗倒酸殘留量測定結果的計算 采用外標法，運用步驟一測定混合標準溶液的色譜條件對樣品溶液進行HPLC測定，測 得樣品溶液中抗倒酯或抗倒酸的色譜峰面積A2,代入殘留量計算公式，求得樣品溶液中抗 倒酯及其代謝物抗倒酸的質(zhì)量濃度，即得樣品溶液中抗倒酯及其代謝物抗倒酸的殘留量， 其中殘留量計算公式如下：式中:X-樣品溶液中抗倒酯或抗倒酸的殘留量，mg/kg; C 一混合標準溶液中抗倒酯或抗倒酸的濃度，mg/L; V-樣品最終定容體積，ml; A1 -混合標準溶液中的抗倒酯或抗倒酸的峰面積； A2-樣品溶液中的抗倒酯或抗倒酸的峰面積； m-樣品質(zhì)量，g。2. 根據(jù)權利要求1所述的一種同時測定小麥中抗倒酯及抗倒酸殘留量的HPLC方法，其 特征在于，所述小麥為小麥植株或小麥麥粒，所述小麥植株剪碎為0.5cm后形成小麥樣品， 所述小麥麥粒經(jīng)植物粉碎機粉碎并過20目篩形成小麥樣品。3. 根據(jù)權利要求1所述的一種同時測定小麥中抗倒酯及抗倒酸殘留量的HPLC方法，其 特征在于，所述步驟二中將乙腈淹沒的小麥樣品用磷酸溶液調(diào)節(jié)其pH值至3.0~3.5。4. 根據(jù)權利要求1所述的一種同時測定小麥中抗倒酯及抗倒酸殘留量的HPLC方法，其 特征在于，所述酸性色譜甲醇通過在每10mL色譜甲醇中加1滴分析純磷酸而制得。5. 根據(jù)權利要求1所述的一種同時測定小麥中抗倒酯及抗倒酸殘留量的HPLC方法，其 特征在于，所述高效液相色譜儀為美國安捷倫公司生產(chǎn)的1260型高效液相色譜儀。
【文檔編號】G01N30/02GK105866266SQ201610180245
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年3月28日
【發(fā)明人】楊麗華, 龔道新, 羅海峰, 陸賽勤, 申浩
【申請人】湖南農(nóng)業(yè)大學