一種吡噻菌胺殘留量的gc-ms/ms測(cè)定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種吡噻菌胺殘留量的GC-MS/MS測(cè)定方法，更具體地說(shuō)是采用氣相色 譜串聯(lián)質(zhì)譜(GC-MS/MS)定性定量測(cè)定糧谷、豬肉、牛肉、羊肉、雞肉等動(dòng)物肌肉及制品等復(fù) 雜基質(zhì)的動(dòng)植物源性食品中殘留的吡噻菌胺含量的方法，屬于農(nóng)藥殘留量的測(cè)定技術(shù)領(lǐng) 域。
【背景技術(shù)】
[0002]吡噻菌胺(Penthiopyrad)是日本三井化學(xué)公司研發(fā)的新穎酰胺類(lèi)殺菌劑，英文通 用名為 penthiopyrad，試驗(yàn)代號(hào)：MTF-753，商品名為 Afetofluapro XAS 登錄號(hào)：183675-82-3,化學(xué)名稱為(RS)-N-[2-(l，3-二甲基丁基)-3-噻吩基]-甲基-3-(三氟甲基)-1Η-吡唑-4-甲酰胺，化學(xué)結(jié)構(gòu)式為：
[0003] 吡噻菌胺與現(xiàn)有的羧酰胺類(lèi)殺菌劑有不同的殺菌譜，除了與現(xiàn)有羧酰胺類(lèi)殺菌劑 一樣對(duì)擔(dān)子菌有效外，其對(duì)子囊菌、不完全菌亦有效，現(xiàn)被推薦用于防治對(duì)其他殺菌劑具抗 性的灰霉病和白粉病。該藥劑通常使用的有效成分劑量為100~200g/hm 2,其被廣泛應(yīng)用于 果樹(shù)、蔬菜、草坪等眾多作物，防治銹病、菌核病、灰霉病、霜霉病、蘋(píng)果黑星病和白粉病。 Penthiopyrad于2008年在日本獲得首次批準(zhǔn)，用于果樹(shù)、蔬菜和觀賞植物，后又于2011年11 月在加拿大獲準(zhǔn)登記。商標(biāo)名為Vertisan和Fontelis(均以penthiopyrad 200g/L為其活性 成分）和Treoris (penthiopyrad 100g/L+chlorothalonil (百菌清）250g/L)的3個(gè)產(chǎn)品主要 用在果樹(shù)、蔬菜和田間作物上，在實(shí)際應(yīng)用發(fā)現(xiàn)吡噻菌胺具有很廣闊的應(yīng)用前景。
[0004] 隨著吡噻菌胺的登記、推廣和使用，作為我國(guó)主要出口市場(chǎng)的歐盟、加拿大和澳大 利亞等國(guó)家制定了其在蔬菜、水果、糧谷和畜產(chǎn)品等食品農(nóng)產(chǎn)品中的最大允許殘留量 (MRL)，加拿大規(guī)定吡噻菌胺在果蔬、堅(jiān)果、糧谷及畜產(chǎn)品等動(dòng)物源性食品中的MRL為0.01~ 30mg/kg;澳大利亞規(guī)定吡噻菌胺在果蔬、堅(jiān)果、糧谷及畜產(chǎn)品等動(dòng)物源性食品中的MRL為 0.01~5mg/kg;歐盟規(guī)定吡噻菌胺在果蔬、堅(jiān)果、糧谷及畜產(chǎn)品等動(dòng)物源性食品中的MRL為 0.01~30mg/kg;歐盟、日本等國(guó)家規(guī)定若田間使用農(nóng)藥沒(méi)有在該國(guó)家登記，沒(méi)有制定相應(yīng) 的殘留限量標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，出口至其國(guó)家的食品農(nóng)產(chǎn)品包括畜禽肉等動(dòng)物源性食品中殘留限量均 實(shí)行0.01mg/L的"一律標(biāo)準(zhǔn)"。
[0005] 現(xiàn)階段，對(duì)吡噻菌胺殘留量測(cè)定方法的研究較少，報(bào)道的檢測(cè)方法主要為蔬菜和 水果中吡噻菌胺殘留檢測(cè)方法，這些檢測(cè)方法均采用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)測(cè)定蔬 菜和水果中吡噻菌胺殘留量的檢測(cè)方法，使用LC-MS/MS測(cè)定食品農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留具有快 速、簡(jiǎn)便、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，但由于其價(jià)格較昂貴，很多檢測(cè)機(jī)構(gòu)、企業(yè)或科研院所未配置該 儀器或配置臺(tái)數(shù)較少，由于不同的化合物采用LC-MS/MS檢測(cè)時(shí)，需使用不同的流動(dòng)相或色 譜柱，這樣需要不斷更換色譜柱、流動(dòng)相并耗費(fèi)比較長(zhǎng)的時(shí)間對(duì)系統(tǒng)進(jìn)行平衡，這一定程度 上制約了 LC-MS/MS的應(yīng)用。使用氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(GC-MS/MS)分析食品農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留 具有快速、簡(jiǎn)便、靈敏度高、選擇性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，可實(shí)現(xiàn)幾百種農(nóng)藥的多殘留分析，但迄今為止 未見(jiàn)食品農(nóng)產(chǎn)品中吡噻菌胺殘留量的GC-MS/MS檢測(cè)方法的報(bào)道，由于糧谷、動(dòng)物源性食品 等食品農(nóng)產(chǎn)品基質(zhì)比較復(fù)雜，須建立凈化效果良好的樣品前處理方法和儀器分析條件才能 滿足檢測(cè)要求，因此，建立氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(GC-MS/MS)定性和定量分析糧谷和動(dòng)物源性 食品中吡噻菌胺殘留量的檢測(cè)方法具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種吡噻菌胺殘留量的GC-MS/MS測(cè)定方法，主要用于測(cè)定糧 谷、動(dòng)物源性食品等復(fù)雜基質(zhì)食品農(nóng)產(chǎn)品中吡噻菌胺殘留量。
[0007] 為實(shí)現(xiàn)以上目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：一種吡噻菌胺殘留量的GC-MS/MS 測(cè)定方法，包括如下步驟：
[0008] (1)提取 稱取混勻樣品于具塞離心管中，加入適量水復(fù)蘇后，定量加入乙腈或含1 %乙酸的乙腈 溶液均質(zhì)或振蕩超聲提取，然后加入氯化鈉或乙酸鈉中的一種和無(wú)水硫酸鎂，劇烈渦旋 lmin后離心。
[0009] (2)凈化 移取一定體積樣品提取液，濃縮至lmL左右，經(jīng)C18/PSA固相萃取柱凈化，乙腈洗脫，收 集洗脫液，取部分洗脫液濃縮至干后，用體積比為1/1的丙酮/正己烷混合溶劑溶解定容，過(guò) 膜后，待氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(GC-MS/MS)檢測(cè)。
[0010] (3)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制 將不含吡噻菌胺的同種類(lèi)基質(zhì)空白樣品按上述步驟（1)、（2)處理時(shí)，得樣品提取凈化 殘?jiān)?，加入適量溶劑和標(biāo)準(zhǔn)溶液，渦旋混勻，配制成至少3個(gè)濃度的吡噻菌胺系列標(biāo)準(zhǔn)工作 液。
[0011] (4)氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(GC-MS/MS)測(cè)定 將步驟(3)中的各濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)行GC-MS/MS測(cè)定，以標(biāo)準(zhǔn)工作液的色譜峰 面積對(duì)其相應(yīng)濃度進(jìn)行回歸分析，得到標(biāo)準(zhǔn)工作曲線;在相同條件下將步驟(2)中凈化后的 樣品液注入GC-MS/MS進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得樣品液中吡噻菌胺的色譜峰面積，代入標(biāo)準(zhǔn)工作曲線， 得到樣品液中吡噻菌胺含量，然后根據(jù)樣品液所代表試樣的質(zhì)量計(jì)算得到樣品中吡噻菌胺 殘留量。若上機(jī)溶液中吡噻菌胺殘留量超過(guò)線性范圍上限，需用定容溶劑將上機(jī)溶液濃度 稀釋至線性范圍之內(nèi)。
[0012] 步驟(1)中樣品若為含水量較少的樣品，提取前須加適量水充分浸潤(rùn)。
[0013] 步驟（1)中采用乙腈提取時(shí)加入氯化鈉鹽析，采用含1%乙酸的乙腈溶液提取時(shí)加 入乙酸鈉鹽析。
[0014] 步驟(2)中進(jìn)行C18/PSA固相萃取凈化，乙腈洗脫時(shí)，洗脫體積為6~8mL。
[0015] 步驟(4)中氣相色譜條件為:色譜柱:HP-5MS毛細(xì)管色譜柱，柱長(zhǎng)30m，內(nèi)徑0.25mm， 膜厚0.25μπι;進(jìn)樣口溫度250°C ;載氣：He，不分流模式進(jìn)樣，進(jìn)樣量：lyL;恒流模式，流速 1.2mL/min;升溫程序:初溫60°C保持2min，以每分鐘20°C的速度升至200°C，然后以每分鐘2 °C的速度升至220°C，再以每分鐘20°C的速度升至280°C，保持lOmin;傳輸線溫度:290°C。
[0016] 步驟(4)中質(zhì)譜條件為：電離模式：電子轟擊電離(EI，70eV);離子源溫度280°C;碰 撞氣:氬氣;多反應(yīng)監(jiān)測(cè)掃描方式MRM，監(jiān)測(cè)參數(shù)為：
[0017] 步驟(4)中測(cè)定樣液和基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液時(shí)，若樣液中農(nóng)藥色譜峰保留時(shí)間與標(biāo) 準(zhǔn)溶液中相應(yīng)農(nóng)藥保留時(shí)間相一致，并且在扣除背景后的樣品質(zhì)譜圖中，所選擇的離子均 出現(xiàn)，而且離子豐度比與標(biāo)準(zhǔn)溶液的離子豐度比相一致，則可判斷樣液中存在這種農(nóng)藥;若 上述兩個(gè)條件不能同時(shí)滿足，則判斷不含該種農(nóng)藥。
[0018] 本發(fā)明的有益效果在于：
[0019] 本發(fā)明利用分散固相萃取技術(shù)，建立了簡(jiǎn)便、快速并能有效避免樣品中基質(zhì)干擾 的樣品前處理方法，將此前處理方法結(jié)合GC-MS/MS應(yīng)用于糧谷、動(dòng)物源性食品中吡噻菌胺 定性確證和定量檢測(cè)，平均回收率為86.4%~95.3%，平均相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為5.0%~ 8.7%，檢出限低于0.25yg/kg，具有操作簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確、靈敏度高及重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn)。能 滿足美國(guó)、歐盟、日本等國(guó)家對(duì)相應(yīng)產(chǎn)品安全檢測(cè)的技術(shù)要求，為保障我國(guó)人民食品安全及 對(duì)外出口貿(mào)易健康發(fā)展提供有力的技術(shù)支撐。
【附圖說(shuō)明】
[0020] 圖1為添加在空白豬肉基質(zhì)中的吡噻菌胺標(biāo)液的GC-MS/MS選擇離子色譜圖。
[0021] 圖2為不含吡噻菌胺的豬肉空白樣品的GC-MS/MS選擇離子色譜圖。
[0022] 圖3為以不含吡噻菌胺的豬肉空白樣品為基質(zhì)配制的吡噻菌胺標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0023] 現(xiàn)以以下實(shí)施實(shí)例來(lái)說(shuō)明本發(fā)明，但并不是限制本發(fā)明的范圍。
[0024]實(shí)施例中使用的儀器與試劑
[0025] T18Basic均質(zhì)器（IKA，Germany) ;CR21GHI離心機(jī)（日立，Japan) ;MS3基本型旋禍混 合器（IKA，Germany);TurboVap LV型樣品自動(dòng)濃縮儀（Caliper，USA) ;7890N氣相色譜-5977C質(zhì)譜儀(Agilent，USA);C18/PSA固相萃取柱(6mL，500mg/500mg)購(gòu)于天津博納艾杰爾 科技有限公司。
[0026] 試劑
[0027] 乙腈、丙酮、正己燒（HPLC級(jí)，Merke，Germany);乙酸（HPLC級(jí)，CNW，Germany);無(wú)水 硫酸鎂、氯化鈉和乙酸鈉為分析純，均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。
[0028] 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì):純度98.0 %，購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。
[0029] 實(shí)施例1:小麥中吡噻菌胺殘留量的檢測(cè)
[0030] (1)樣品前處理 [0031 ] 提取 稱取經(jīng)充分混勾的5g小麥樣品（研磨成面粉)于50mL離心管中，加入20mL水復(fù)蘇30min 后，準(zhǔn)確加入20mL含1 %乙酸的乙腈溶液，振蕩提取20min，超聲提取5min，加入3g無(wú)水硫酸 鎂和2g乙酸鈉，禍旋lmin后，7000r/min離心5min。離心后，取8mL乙腈提取液于40°C旋蒸或 氮?dú)獯抵两?，加入lmL乙腈渦旋后，待凈化。
[0032] 凈化 用5mL乙腈預(yù)洗C18/PSA固相萃取柱，當(dāng)液面到達(dá)吸附劑的頂部時(shí)，將上述提取溶液轉(zhuǎn) 入柱中，用2mL乙腈洗滌試管，并將洗滌液移入SPE柱中，待溶液達(dá)到吸附劑頂部時(shí)，加入4mL 乙腈至柱子上進(jìn)行洗脫，洗脫液全部接收到定量試管中，用乙腈定容至10mL，取lmL凈化液 用氮?dú)獯蹈珊螅皿w積比為1/1的丙酮/正己烷混合溶劑定容至lmL，過(guò)0.22μπι濾膜后，待GC-MS/MS測(cè)定。
[0033] (2)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制 準(zhǔn)確稱取25 ± 0. lmg標(biāo)準(zhǔn)品于25mL容量瓶中，用乙腈溶解，定容得1000.0 yg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ) 備液;移取l.OmL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液置于100mL容量瓶中，用體積比為1/1的丙酮/正己烷混合溶劑 定容得到10.〇yg/mL標(biāo)準(zhǔn)