一種嗜堿性粒細(xì)胞激活、脫顆粒的鑒定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及過(guò)敏性疾病診斷的技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種嗜堿性粒細(xì)胞激活、脫顆粒的鑒定方法。
【背景技術(shù)】
[0002]變態(tài)反應(yīng)性疾病發(fā)病率占世界總?cè)丝诘?0%以上，被世界衛(wèi)生組織列為21世紀(jì)的四大非感染性疾病之一。隨著工業(yè)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，生態(tài)環(huán)境的改變，近年來(lái)此類疾病日益增多，成為常見(jiàn)病、多發(fā)病，是我國(guó)健康及經(jīng)濟(jì)發(fā)展領(lǐng)域需要解決的重大問(wèn)題。
[0003]有史以來(lái)，疾病的定義及診斷方案絕大多數(shù)都是由發(fā)達(dá)國(guó)家提出的。2011年何韶衡、張慧云在東京舉行的首屆中-日-韓三國(guó)過(guò)敏年度交流會(huì)上，在國(guó)內(nèi)外率先對(duì)沿用了近40年的過(guò)敏性疾病的定義進(jìn)行了修正商榷，將原來(lái)的“過(guò)敏性疾病是一組由IgE介導(dǎo)的疾病”修改為“是一組由肥大細(xì)胞/嗜堿性粒細(xì)胞(MC/Bas)介導(dǎo)的疾病”。而IgE介導(dǎo)的過(guò)敏性疾病只是其中的一個(gè)亞型，從而修正了人們對(duì)過(guò)敏性疾病認(rèn)識(shí)的偏差。這是因?yàn)檫^(guò)敏反應(yīng)(速發(fā)型超敏反應(yīng))的根本問(wèn)題是激活后的初始效應(yīng)細(xì)胞一MC/Bas釋放炎癥性介質(zhì)，從而啟動(dòng)炎癥的病理生理過(guò)程，導(dǎo)致臨床癥狀的出現(xiàn)?；谠小斑^(guò)敏性疾病是一組由IgE介導(dǎo)的疾病”的定義，國(guó)外一些專家人為的把那些非IgE介導(dǎo)的過(guò)敏性疾病下了個(gè)“類過(guò)敏反應(yīng)”的定義，即“類過(guò)敏反應(yīng)”臨床表現(xiàn)與過(guò)敏反應(yīng)相同、治療方法相同，但是血液中的IgE水平不增高。使人們對(duì)過(guò)敏性疾病認(rèn)識(shí)的偏差進(jìn)一步加大。我們對(duì)過(guò)敏性疾病的新定義必將使人們重新認(rèn)識(shí)此類疾病，將會(huì)大大提高過(guò)敏性疾病的預(yù)防和診治水平。
[0004]也是基于“過(guò)敏性疾病是一組由IgE介導(dǎo)的疾病”的定義，目前臨床上血清中過(guò)敏原特異性IgE水平的檢測(cè)幾乎成了過(guò)敏性疾病的唯一診斷方法，甚至有人錯(cuò)誤的認(rèn)為這項(xiàng)檢測(cè)是過(guò)敏性疾病診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”，使人們對(duì)過(guò)敏性疾病認(rèn)識(shí)的偏差進(jìn)一步加大，完全忘記了過(guò)敏性疾病診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”是過(guò)敏原特異性激發(fā)試驗(yàn)這一客觀事實(shí)。由于特異性IgE檢測(cè)的臨床意義在于告訴IgE依賴性過(guò)敏患者對(duì)哪一種常見(jiàn)過(guò)敏原過(guò)敏，而對(duì)非IgE依賴性過(guò)敏反應(yīng)如絕大多數(shù)藥物過(guò)敏反應(yīng)、80%以上的食物過(guò)敏、大多數(shù)哮喘的患者、自然環(huán)境中的小分子如汽車尾氣、乙醇等物質(zhì)過(guò)敏無(wú)任何診斷意義，因此臨床上急需研宄出對(duì)過(guò)敏性疾病有定性診斷價(jià)值的方法，從而幫助醫(yī)生對(duì)藥物過(guò)敏還是藥物不良反應(yīng)，食物過(guò)敏還是其它原因的腹瀉、過(guò)敏性哮喘還是內(nèi)源性哮喘等進(jìn)行鑒別診斷。
[0005]過(guò)敏原特異性激發(fā)試驗(yàn)分為體內(nèi)激發(fā)試驗(yàn)和體外激發(fā)試驗(yàn)兩種，前者是過(guò)敏性疾病診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但是有一定風(fēng)險(xiǎn)，甚至能誘發(fā)重度過(guò)敏反應(yīng)，臨床上很少開(kāi)展；后者(包括過(guò)敏原特異性肥大細(xì)胞激發(fā)試驗(yàn)和過(guò)敏原特異性嗜堿性粒細(xì)胞激發(fā)試驗(yàn)兩種)在臨床意義上雖然不如前者直接，但是無(wú)風(fēng)險(xiǎn)，因此獲得廣泛的認(rèn)可。但是，人們經(jīng)過(guò)數(shù)十年的無(wú)數(shù)次努力，始終無(wú)法獲得可靠的體外激發(fā)試驗(yàn)方法。多年來(lái)，作為肥大細(xì)胞脫顆粒的特異性標(biāo)記物，組胺受到了極大的關(guān)注，但是令人遺憾的是組胺檢測(cè)系統(tǒng)不僅較昂貴、功能單一，而且較難獲得穩(wěn)定數(shù)據(jù)，目前在臨床上很難開(kāi)展。此外，由于肥大細(xì)胞位于組織中，而除過(guò)敏性鼻炎患者的鼻腔灌洗液外，很難獲取過(guò)敏患者的肥大細(xì)胞進(jìn)行激發(fā)試驗(yàn)，所以根本無(wú)法用于臨床診斷。
[0006]過(guò)敏原特異性嗜堿性粒細(xì)胞激發(fā)試驗(yàn)是目前唯一有潛力應(yīng)用于過(guò)敏性疾病臨床檢測(cè)的激發(fā)試驗(yàn)方法。不難理解，這個(gè)激發(fā)試驗(yàn)方法有三個(gè)基本要求，其一為嗜堿性粒細(xì)胞的特異性識(shí)別，其二為嗜堿性粒細(xì)胞激活、脫顆粒的鑒定，其三為特異性的過(guò)敏原。但是令人遺憾的是到目前為止尚未有一種可靠的、重復(fù)性好的在全血中特異性鑒定嗜堿性粒細(xì)胞激活、脫顆粒狀態(tài)的方法，導(dǎo)致過(guò)敏原特異性嗜堿性粒細(xì)胞激發(fā)試驗(yàn)無(wú)法開(kāi)展。我們最近的研宄發(fā)現(xiàn)如果同時(shí)檢測(cè)CD123、HLA-DR、CCR3，CCR3+CD123+HLA-DR-細(xì)胞群98-100%是嗜堿性粒細(xì)胞，從而率先基本上解決了嗜堿性粒細(xì)胞的特異性免疫識(shí)別問(wèn)題，但是沒(méi)有解決嗜堿性粒細(xì)胞激活、脫顆粒的鑒定問(wèn)題。
[0007]近10年來(lái)，人們發(fā)現(xiàn)⑶203c可作為嗜堿性粒細(xì)胞激活的標(biāo)記物，并逐漸被應(yīng)用于臨床實(shí)驗(yàn)研宄。由于血液中僅有嗜堿性粒細(xì)胞表達(dá)CD203c，所以嗜堿性粒細(xì)胞CD203c的表達(dá)變化，應(yīng)當(dāng)能準(zhǔn)確反映其激活狀態(tài)。CD63是一種溶酶體糖蛋白。表達(dá)于嗜堿性粒細(xì)胞、活化血小板、單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞上。CD63分子主要存在于溶酶體膜上，在嗜堿性粒細(xì)胞脫顆粒時(shí)移行到細(xì)胞膜表面，所以檢測(cè)CD63分子表達(dá)變化，可代表嗜堿性粒細(xì)胞脫顆粒狀態(tài)。因而如果同時(shí)檢測(cè)⑶123、HLA-DR、CCR3，⑶203c和/或⑶63，其中CCR3+CD123+HLA-DR-CD203c+ 或 CCR3+CD123+HLA-DR-CD63+ 細(xì)胞群分別代表激活或脫顆粒的嗜堿性粒細(xì)胞的數(shù)量，為過(guò)敏原特異性嗜堿性粒細(xì)胞激發(fā)試驗(yàn)進(jìn)一步打下了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明所解決的技術(shù)問(wèn)題在于提供一種嗜堿性粒細(xì)胞激活、脫顆粒的鑒定方法，以解決上述【背景技術(shù)】中的問(wèn)題。
[0009]本發(fā)明所解決的技術(shù)問(wèn)題采用以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn):一種嗜堿性粒細(xì)胞激活、脫顆粒的鑒定方法，包括如下步驟:
[0010](I)首先按照9:1的比例，用9倍的超純水將試劑盒中的濃縮的紅細(xì)胞裂解液儲(chǔ)存液稀釋到工作狀態(tài)；同樣地用9倍的超純水將試劑盒中的濃縮的磷酸鹽緩沖液的儲(chǔ)存液稀釋到工作狀態(tài)。注意:紅細(xì)胞裂解液建議現(xiàn)用現(xiàn)配。
[0011](2)按一定的順序?qū)⒃囼?yàn)樣本編號(hào)，并標(biāo)記好試驗(yàn)所需的流式上樣管；
[0012](3)在每個(gè)流式上樣管內(nèi)加入所需的抗體組合:
[0013]組合1:抗人CD123、抗人CCR3、抗人HLA-DR、抗人CD203c熒光標(biāo)記流式抗體組合，如FITC標(biāo)記的抗人CD123、APC標(biāo)記的抗人CCR3、APC/Cy7標(biāo)記的抗人HLA-DR，PE標(biāo)記的抗人CD203c，用量為每人份四種抗體各5 μ L，以鑒定嗜堿性粒細(xì)胞激活狀態(tài)；
[0014]組合2:抗人⑶123、抗人CCR3、抗人HLA-DR、抗人⑶63熒光標(biāo)記流式抗體組合，如FITC標(biāo)記的抗人CD123、APC標(biāo)記的抗人CCR3、APC/Cy7標(biāo)記的抗人HLA_DR，PE標(biāo)記的抗人CD63，用量為每人份四種抗體各5 μ L，以鑒定嗜堿性粒細(xì)胞脫顆粒狀態(tài)；
[0015]組合3:抗人0)123、抗人0^3、抗人!11^-01?、抗人0)203(3、抗人0)63熒光標(biāo)記流式抗體組合，如FITC標(biāo)記的抗人CD123、APC標(biāo)記的抗人CCR3、APC/Cy7標(biāo)記的抗人HLA-DR，PE標(biāo)記的抗人⑶203c、PE/Cy7標(biāo)記的抗人⑶63，用量為每人份五種抗體各5 μ L，以鑒定嗜堿性粒細(xì)胞激活和脫顆粒狀態(tài)；
[0016](4)患者全血低速漩渦混勻后，用加樣槍吸取混合好的25 μ L至125 μ L全血加到標(biāo)記好的流式管內(nèi)，漩渦振蕩器上低速漩渦混勻3?5s，室溫避光孵育15min ;
[0017](5)孵育結(jié)束后，每個(gè)樣本管內(nèi)加入ImL的紅細(xì)胞裂解液，漩渦振蕩器上低速漩渦混勻3?5s，室溫避光孵育1min ；
[0018](6)孵育結(jié)束后，1200rpm/min轉(zhuǎn)速離心6min，離心結(jié)束后，棄去上清液，加入ImL的PBS緩沖液，以同樣的速度離心，(離心結(jié)束取樣操作時(shí)，應(yīng)避免劇烈晃動(dòng)引起細(xì)胞沉淀懸浮);
[0019](7)離心后，以同樣的方式去上清液，加入300 yL的PBS緩沖液，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。
[0020](8)用不同流式細(xì)胞儀相應(yīng)的分析軟件分析嗜堿性粒細(xì)胞的計(jì)數(shù)及平均熒光強(qiáng)度。
[0021]所述紅細(xì)胞裂解液由美國(guó)BD公司提供，如用其他公司的紅細(xì)胞裂解液請(qǐng)根據(jù)試劑說(shuō)明書進(jìn)行稀釋。
[0022]所述熒光標(biāo)記流式抗體包括FITC、APC、APC/Cy7、PE、PE/Cy7或PerCP熒光標(biāo)記的抗人CD 123、抗人CCR3、抗人HLA-DR、抗人CD203c和抗人CD63抗體。
[0023]所述的抗體組合為任何熒光標(biāo)記的抗人⑶123、抗人CCR3、抗人HLA-DRJ^A⑶203c、抗人⑶63五種抗體組合。
[0024]所述的抗體組合為任何熒光標(biāo)記的抗人⑶123、抗人CCR3、抗人HLA-DRd^A⑶203c四種抗體組合。
[0025]所述的抗體組合為任何熒光標(biāo)記的抗人⑶123、抗人CCR3、抗人HLA-DR、抗人⑶63四種抗體組合。
[0026]所述的抗體組合為任何分子標(biāo)記的抗人⑶123、抗人CCR3、抗人HLA-DR、抗人⑶203c、抗人⑶63五種抗體組合。
[0027]所述的抗體組合為任何分子標(biāo)記的抗人⑶123、抗人CCR3、抗人HLA-DR、抗人⑶203c四種抗體組合。
[0028]所述的抗體組合為任何分子標(biāo)記的抗人⑶123、抗人CCR3、抗人HLA-DR、抗人⑶63四種抗體組合。
[0029]與已公開(kāi)技術(shù)相比，本發(fā)明存在以下優(yōu)點(diǎn):
[0030](I)能將外周血98-100%的嗜堿性粒細(xì)胞與其他種類細(xì)胞分辨出來(lái)；
[0031](2)無(wú)需分離純