基于圖像分析的貝類腹瀉性毒素的高通量檢測裝置及方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種高通量同時檢測貝類腹瀉性毒素的檢測裝置及技術(shù)，尤其涉及基 于圖像分析的貝類腹瀉性毒素的高通量檢測裝置及方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 貝類腹瀉性毒素是貝類從浮游藻類中聚集的有害有機物質(zhì)存于體內(nèi)蓄積而成，是 一類毒性很強的非蛋白毒素，食用后能使人中毒，甚至死亡。目前國內(nèi)貝類腹瀉性毒素檢測 方法通常使用方法是小鼠生物檢測法，液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用方法和傳統(tǒng)的Elisa試劑盒檢測 方法。小鼠生物檢測法個體差異性大導(dǎo)致毒性難以估計，液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用方法操作繁瑣 并且設(shè)備龐大，無法適應(yīng)現(xiàn)場檢測要求。傳統(tǒng)的Elisa試劑盒檢測方法所采用的檢測儀器 為酶標(biāo)儀，依舊存在著設(shè)備龐大而無法適應(yīng)現(xiàn)場檢測，并且酶聯(lián)反應(yīng)隨著孵化時間的不同 存在差異，酶標(biāo)儀采用的分時檢測的方式便造成了孔間檢測結(jié)果的差異。因此，海洋水產(chǎn)品 毒素檢測領(lǐng)域迫切需要一種能夠適應(yīng)現(xiàn)場快速檢測、操作簡便并且檢測成本低廉的貝類腹 瀉性毒素檢測裝置及方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種基于圖像分析的貝類腹瀉性毒 素的高通量檢測裝置及方法。
[0004] 本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的：一種基于圖像分析的貝類腹瀉性毒 素的高通量檢測裝置，該裝置包括：電源適配器、廣角鏡頭、智能移動設(shè)備、第一暗室、第二 暗室、商用試劑盒96孔檢測板、96孔檢測板裝載臺和冷光片；其中，第二暗室通過隔板分為 放置電源適配器的空間和檢測空間；所述檢測空間中具有可抽拉的96孔檢測板裝載臺，商 用試劑盒96孔檢測板通過卡槽固定在96孔檢測板裝載臺頂部，冷光片通過卡槽固定在96 孔檢測板裝載臺底部；電源適配器和冷光片連接；第一暗室通過透光隔板連接第二暗室的 檢測空間；在第一暗室的頂部開有圓孔，廣角鏡頭固定第一暗室頂部的圓孔正下方；智能 移動設(shè)備通過卡槽固定在第一暗室頂部外側(cè)，且其攝像頭可通過第一暗室的圓孔透過廣角 鏡頭，對第二暗室內(nèi)的商用試劑盒96孔檢測板進行圖像采集。
[0005] -種基于圖像分析的貝類腹瀉性毒素的高通量檢測方法，該方法包括以下步驟： (1)樣品前處理，制備貝類腹瀉性毒素待測樣品溶液，包括以下子步驟： (1. 1)取貝類生物，除去貝殼，用雙蒸水洗凈貝肉后均質(zhì)器均質(zhì)； (1.2)稱取I g均質(zhì)后的樣品加入6 ml體積濃度為80%的甲醇水溶液，得到混合溶 液； (1. 3)在4 °C下，將步驟1. 2得到的混合溶液以3500 r/min離心10分鐘，收集上清 液； (1. 4 )在步驟（1. 3 )殘留的貝肉組織中加2 ml體積濃度為80%的甲醇水溶液，在4 °C 下，以3500 r/min離心10分鐘，收集上清液，加入到步驟（1. 3)收集的上清液中； (I. 5)重復(fù)步驟（I. 4)，待收集的上清液達到10 ml時，用0. 45 um的濾膜過濾，得到濾 液； (1.6)取20ul濾液，用樣品稀釋緩沖液PBS稀釋到I ml，然后取100 ul作為待測樣品 溶液； (2) 使用商用試劑盒96孔檢測板進行檢測，具體包括以下子步驟： (2. 1)將 HRP 酶標(biāo)記物，OA 抗體溶液及 0 ppb、0. 2 ppb、0. 5 ppb、l ppb、2 ppb、5 ppb 的貝類腹瀉性毒素標(biāo)準(zhǔn)品置于室溫20-28 °C下，從鋁箔袋中取出微孔條； (2.2)分別取100 111的濃度為0口口13,0.2口口13,0.5口口13，1口口13,2口口13,5口口13的標(biāo)準(zhǔn)品 依次加到微孔條的微孔中； (2. 3)將步驟（1)得到的待測樣品溶液加到微孔條的其余微孔中； (2. 4)吸取50 ulHRP酶標(biāo)記物到微孔條的每個微孔中，然后加入50 UlOA抗體溶液到 每個微孔中，混勻，在20-28 °C下孵育60分鐘； (2. 5)孵育完后，將微孔中的溶液倒入水槽中，用配好的洗板緩沖液清洗，每個微孔至 少加入250 ul洗板緩沖液，震蕩后倒掉并倒置在吸水紙上拍打，重復(fù)三至四次；所述洗板 緩沖液為含有質(zhì)量濃度為〇. 05%的Tween-20的PBS溶液； (2. 6)在每個微孔中加入100 ul底物溶液，在20-28 °C下避光孵育30分鐘，此時準(zhǔn)備 好商用試劑盒96孔檢測板；所述底物溶液為TMB溶液； (3) 確定商用試劑盒檢測貝類腹瀉性毒素的標(biāo)定曲線：將步驟（2)中準(zhǔn)備好的商用試 劑盒96孔檢測板放置在96孔檢測板裝載臺上，96孔檢測板裝載臺推入第二暗室，然后智能 移動設(shè)備采集商用試劑盒96孔檢測板的圖像進行檢測，對采集的圖像進行處理，處理過程 包括以下子步驟： (3.1)切割出96孔檢測板上的微孔所對應(yīng)的子圖像，子圖像的孔內(nèi)像素范圍為 10X10 ； (3. 2)將子圖像轉(zhuǎn)換至顏色孔間RGB，提取子圖像中每個像素的R分量，并計算子圖像 像素R分量平均值； (3. 3)計算標(biāo)準(zhǔn)品溶液顏色比率CR，根據(jù)公式CR二（255 Ck) / (25 5 - C0)，其中，Ck 為0.2 ppb，0.5 ppb，l ppb，2 ppb，5 ppb的標(biāo)準(zhǔn)品孔的子圖像R分量平均值，Ctl為0 ppb 的標(biāo)準(zhǔn)品孔的子圖像R分量平均值； (3. 4)根據(jù)最小二乘法擬合曲線算法，擬合出顏色比率CR關(guān)于標(biāo)準(zhǔn)品濃度以10為底的 對數(shù)的標(biāo)定曲線，即商用試劑盒檢測貝類腹瀉性毒素的標(biāo)定曲線； (4) 檢測未知濃度的樣品溶液貝類腹瀉性毒素濃度：將步驟（1)得到的待測樣品溶液 加入到商用試劑盒96孔檢測板的微孔中，重復(fù)步驟（2. 4)-步驟（3. 2)，得到在該待測樣品 溶液濃度下的子圖像的R分量平均值，然后根據(jù)步驟（3. 3)的公式計算待測樣品溶液的CR 值，帶入步驟（3. 4)得到的商用試劑盒檢測貝類腹瀉性毒素的標(biāo)定曲線，計算出待測樣品溶 液貝類腹瀉性毒素的濃度，根據(jù)步驟（1)的稀釋倍數(shù)，即可得到I ml待測樣品溶液的貝類 腹瀉性毒素。
[0006] 本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明實現(xiàn)了貝類腹瀉性毒素現(xiàn)場快速檢測，具有快速、同 步、操作簡便、成本低廉和能夠適應(yīng)現(xiàn)場檢測等優(yōu)點。本發(fā)明較現(xiàn)有的貝類腹瀉性毒素檢測 方法上，具有操作步驟簡單，成本低廉，高通量同時快速檢測等優(yōu)點，克服現(xiàn)有方法無法現(xiàn) 場檢測的不足。根據(jù)以上優(yōu)點，本發(fā)明的裝置及方法可廣泛用于海洋水產(chǎn)品毒素檢測的相 關(guān)領(lǐng)域。
【附圖說明】
[0007] 圖1是本發(fā)明貝類腹瀉性毒素的高通量檢測裝置整體結(jié)構(gòu)圖； 圖2是本發(fā)明所使用的商用試劑盒96孔檢測板結(jié)構(gòu)圖； 圖3是本發(fā)明檢測貝類腹瀉性毒素算法流程圖； 圖4是本發(fā)明與酶標(biāo)儀檢測貝類腹瀉性毒素標(biāo)定結(jié)果對比圖； 圖中，電源適配器1、廣角鏡頭2、智能移動設(shè)備3、暗室頂部4、暗室底座5、商用試劑盒 96孔檢測板6、96孔檢測板裝載臺7、冷光片8。
【具體實施方式】
[0008] 以下結(jié)合附圖和具體實施例對本發(fā)明作進一步詳細描述，但并不是限制本發(fā)明。
[0009] 如圖1、2所示，本發(fā)明基于圖像分析的貝類腹瀉性毒素的高通量檢測裝置，包括： 電源適配器1、廣角鏡頭2、智能移動設(shè)備3、第一暗室4、第二暗室5、商用試劑盒96孔檢測 板6、96孔檢測板裝載臺7和冷光片8 ;其中，第二暗室5通過隔板分為放置電源適配器1的 空間和檢測空間；所述檢測空間中具有可抽拉的96孔檢測板裝載臺7,商用試劑盒96孔檢 測板6通過卡槽固定在96孔檢測板裝載臺7頂部，冷光片8通過卡槽固定在96孔檢測板 裝載臺7底部；電源適配器1和冷光片8連接；第一暗室4通過透光隔板連接第二暗室的檢 測空間；在第一暗室4的頂部開有圓孔，廣角鏡頭2固定第一暗室4頂部的圓孔正下方；智 能移動設(shè)備3通過卡槽固定在第一暗室4頂部外側(cè)，且其攝像頭可通過第一暗室4的圓孔 透過廣角鏡頭2,對第二暗室5內(nèi)的試劑盒96孔檢測板6進行圖像采集。
[0010] 一種應(yīng)用上述裝置檢測貝類腹瀉性毒素的方法，包括以下步驟： (1) 樣品前處理，制備貝類腹瀉性毒素待測樣品溶液，包括以下子步驟： (1. 1)取貝類生物，除去貝殼，用雙蒸水洗凈貝肉后均質(zhì)器均質(zhì)； (1.2) 稱取I g均質(zhì)后的樣品加入6 ml體積濃度為80%的甲醇水溶液，得到混合溶 液； (1. 3)在4 °C下，將步驟（1. 2)得到的混合溶液以3500 r/min離心10分鐘，收集上清 液； (1. 4 )在步驟（1. 3 )殘留的貝肉組織中加2 ml體積濃度為80%的甲醇水溶液，在4 °C 下，以3500 r/min離心10分鐘，收集上清液，加入到步驟（1. 3)收集的上清液中； (1. 5)重復(fù)步驟（1. 4)，待收集的上清液達到10 ml時，用0. 45 um的濾膜過濾，得到濾 液； (1.6)取20ul濾液，用樣品稀釋緩沖液PBS稀釋到I ml，然后取100 ul作為待測樣品 溶液； (2) 使用商用試劑盒96孔檢測板6進行檢測，具體包括以下子步驟： (2. 1)將 HRP 酶標(biāo)記物，OA 抗體溶液及 0 ppb、0. 2 ppb、0