rgll8、Arg292和Arg371)之間的 強(qiáng)靜電作用。
[0013] 溶液相的神經(jīng)氨酸酶抑制測定通常使用熒光底物2'-(4-甲基傘形酮 基）-a -D-乙?；?神經(jīng)氨酸，其被神經(jīng)氨酸酶裂解而獲得可使用熒光計(jì)定量的熒光 產(chǎn)物（Potier等人，Anal. Biochem. 94:287-296 (1979))，然而，該測定法不適于高通 量模式。此外，由于抗病毒株的快速出現(xiàn)（參見，McKimm-Breschkin, J. L. Antiviral Res. 2000, 47, 1-17)，仍需要尋找新型流感病毒的神經(jīng)氨酸酶抑制劑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0014] 2008年奧司他韋耐藥性HlNl流感病毒的世界范圍的涌現(xiàn)推動了對耐藥性突變體 的研宄和對研發(fā)快速測試奧司他韋易感性的需求。在潛在流行奧司他韋耐藥性HlNl病毒 期間，需要用于快速評估就診患者樣本的奧司他韋易感性的"即時(shí)檢驗(yàn)"（point-of-care) 測試法，這將有益于治療方案的確定。
[0015] 本文記載了新型膦酸酯化合物。所述化合物作為神經(jīng)氨酸酶抑制劑具有對抗 H1N1、H5N1和H3N2流感病毒的野生型和奧司他韋耐藥性病毒株的活性。在一些實(shí)施方案 中，奧司他韋耐藥性流感病毒株在神經(jīng)氨酸酶中含有H274Y突變。本公開內(nèi)容還提供了通 過唾液酸生成新型膦酸酯化合物的對映選擇性合成途徑。
[0016] 根據(jù)本公開內(nèi)容的特點(diǎn)，公開了根據(jù)式⑴的化合物，
[0017]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種用于測定奧司他韋耐藥性流感病毒存在的方法，所述方法包括以下步驟： (a) 提供疑似包括奧司他韋耐藥性流感病毒或病毒顆粒的樣品； (b) 在存在和不存在羧酸奧司他韋（0C)的情況下，使所述樣品與含有流感神經(jīng)氨酸酶 識別單位（R)的結(jié)合分子接觸；和 (c) 測定存在和不存在奧司他韋的情況下，結(jié)合分子與所述流感病毒或病毒顆粒在結(jié) 合上的差別； 其中，在奧司他韋存在下，相比于接觸奧司他韋敏感型流感病毒對照時(shí)識別單位（R) 結(jié)合水平的降低，如所述樣品未出現(xiàn)結(jié)合水平的降低，表明該樣品中存在奧司他韋耐藥性 流感病毒。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述奧司他韋耐藥性流感病毒包括神經(jīng)氨酸酶 (NA)蛋白的氨基酸位點(diǎn)274的突變。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述流感突變體對神經(jīng)氨酸酶抑制劑藥物有耐 藥性，但是對本發(fā)明所述的識別單位（R)仍具敏感性。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中，所述含流感病毒的樣品選自以下組成的組：粘 液、唾液、呼吸分泌物、洗喉液、洗鼻液、脊髓液、痰、尿、精液、汗、糞、血漿、血、支氣管肺泡 液、陰道液、淚液和組織活檢。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述識別單位（R)與所述流感病毒的結(jié)合受同時(shí) 與羧酸奧司他韋結(jié)合的競爭性抑制。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中，所述識別單位（R)選自扎那米韋、或零流感胍單 酯、或磷雜扎那米韋或其單酯、和它們的鹽、酯和衍生物。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述識別單位（R)偶聯(lián)至可檢測的傳感單元 ⑶。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中，所述識別單位（R)通過連接部（L)偶聯(lián)至所述傳 感單元，以使所述結(jié)合分子具有R-L-S結(jié)構(gòu)。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中，所述連接部（L)選自脂肪族鏈、三唑、水溶性連接 部和乙二醇連接部。
10. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中，所述傳感單元是可檢測部分，其選自熒光標(biāo)記、 金標(biāo)記、酶標(biāo)記、放射性標(biāo)記、量子點(diǎn)標(biāo)記、生物素-抗生物素蛋白類標(biāo)記和蛋白標(biāo)記。
11. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中，所述熒光標(biāo)記選自以下組成的組：熒光素、 BODIPY、AlexaFluor、Cy3、Cy5、OregonGreen、四甲基若丹明、若丹明紅、德克薩斯紅、P比 啶基噁唑、苯并噁二唑衍生物、NBD鹵化物、碘代乙酰胺類、SBD;瑩黃、碘代乙酰胺；芪、香豆 素、萘、氮丙啶、dapoxyl、花、bimanes、咕噸、花青、花、酞菁染料、藻膽蛋白、方酸菁染料、能 量轉(zhuǎn)移染料組合，和它們的衍生物。
12. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述R-L-S分子選自以下化合物： BM1 :扎那米韋-(三唑連接部）-生物素
BM2 :扎那米韋-(三唑連接部）-熒光素
BM3 :扎那米韋-(乙二醇連接部）-生物素
其中，x= 1至4， BM4 :扎那米韋-(乙二醇連接部）-熒光素
BM5 :(零流感胍）-(脂肪族鏈連接部）-生物素
其中，X= 1至4， BM6 :(零流感胍）-(乙二醇連接部）-熒光素
BM7 :磷雜扎那米韋-(三唑連接部）-生物素
BM8 :磷雜扎那米韋-(乙二醇連接部）-熒光素
BM9 :(磷雜扎那米韋單酯）-(乙二醇連接部）-生物素
其中，X= 1至4,和 BM10 :(磷雜扎那米韋單酯）-(乙二醇連接部）-熒光素
其中，x= 1至4。
13. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，R是磷雜扎那米韋或其衍生物。
14. 根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中，競爭性結(jié)合羧酸奧司他韋的化合物R是式（I) 化合物，
其中，A是PO(OR) (OR5)，其中，R和R5獨(dú)立地選自H、C1-C10烷基、芳基、芳烷基和X， 其中，X是陽性抗衡離子，其選自由如下組成的組：銨、甲基銨、二甲基銨、三甲基銨、四甲基 銨、乙醇銨、二環(huán)己銨、胍、乙二銨陽離子、鋰陽離子、鈉陽離子、鉀陽離子、銫陽離子、鈹陽離 子、鎂陽離子、鈣陽離子和鋅陽離子，其中，B是NHR6、NH3+Y_、R6N(C=NH)顯2或R6N(C=NH2+) NH2Y'其中，R6表示氫、C1-C10烷基、芳基、或芳烷基、其中，是陰性抗衡離子，其選自由如 下組成的組：氯離子、溴離子、碘離子、乙酸根離子、三氟乙酸根離子、磷酸根離子、二磷酸根 離子、硝酸根離子、硫酸根離子、苯磺酸根離子、苯甲酸根離子、水楊酸根離子、羥萘酸根離 子、延胡索酸根離子、馬來酸根離子、乳酸根離子、蘋果酸根離子、琥珀酸根離子、酒石酸根 離子、檸檬酸根離子、谷氨酸根離子、葡糖酸根離子和硬脂酸根離子，其中，R1是CH3或CF3; 其中，R2是H、C1-C10烷基或0 =C-NHR7,其中，R7表示連有功能性部分如生物素、熒光團(tuán) 和抗炎劑的連接部，且其中，R3和R4獨(dú)立為氫、C1-C10烷基或0 =C-R8,其中其中R8表示 C1-C10烷基、芳基、或芳烷基。
15. 根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中競爭性結(jié)合羧酸奧司他韋的化合物R是選自以 下化合物或其衍生物：
【專利摘要】本發(fā)明提供了用于檢測耐藥病原菌和治療其感染的方法和組合物。還提供了用于利用非奧司他韋流感病毒神經(jīng)氨酸酶抑制劑和羧酸奧司他韋通過競爭性結(jié)合分析來檢測奧司他韋耐藥性流感病毒的方法。本發(fā)明公開了偶聯(lián)至傳感器且用于本發(fā)明方法中的流感病毒神經(jīng)氨酸酶抑制劑。還公開了作為對抗H1N1、H5N1和H3N2病毒的野生型和奧司他韋耐藥性的流感病毒的神經(jīng)氨酸酶抑制劑的新型膦酸酯化合物。本發(fā)明還提供了通過唾液酸制備這些膦酸酯化合物的對映選擇性合成途徑。
【IPC分類】G01N33-50, G01N33-569
【公開號】CN104777301
【申請?zhí)枴緾N201510157505
【發(fā)明人】翁啟惠, 方俊民, 鄭義循, 謝俊結(jié)
【申請人】中央研究院
【公開日】2015年7月15日
【申請日】2011年5月10日
【公告號】CA2835489A1, CN103068378A, EP2568976A2, EP2568976B1, US20130225532, WO2011143262A2, WO2011143262A3