專利名稱：對外周血白細胞中的樹突細胞表面具有特異性的單克隆抗體3－6－a的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種只與樹突細胞起反應的單克隆抗體3-6-A。更具體而言，單克隆抗體3-6-A與只在外周血白細胞中樹突細胞表面表達的DMα的細胞外區(qū)起反應。因此，本發(fā)明涉及與樹突細胞特異性表面標記相符合的單克隆抗體3-6-A的可應用性。
背景技術：
當通過胞飲或病菌感染接觸外來抗原時，樹突細胞(此后稱為DC)吞噬抗原，降解蛋白質(zhì)，并將其以結合在MHC II類分子上的肽的形式呈現(xiàn)在細胞表面。盡管在總PBL中DC不足1％，但DC向T細胞的抗原呈遞能力比單核細胞和巨噬細胞要強的多(Pierre等人，自然(Nature)388787(1987))。
一旦被外來抗原致敏，DC便返回淋巴結，分泌一種特異性C-C趨化因子。在淋巴結中，致敏的DC活化原初T細胞(Adema等人，自然387713(1997)；Ingulli E等人，實驗醫(yī)學雜志(J.Exp.Med.)1852133(1997))，誘導產(chǎn)生針對抗原的細胞免疫(Steinman R.M.，免疫學年評(Annu.Rev.Immunol.)，9271(1991))。據(jù)報道，DC在胸腺內(nèi)T細胞的正、負選擇方面起重要作用(Carlos A.，今日免疫學(Immunol.Today)18)。其它實驗顯示，DC分泌的趨化因子參與T細胞向淋巴結歸巢(Adema等人，自然387713(1997)；Ingulli等人，實驗醫(yī)學雜志，1852133(1997))。
此外，DC還具有誘導IL-12、活化癌細胞特異性CTL的能力，CTL能有效地抑制癌生成和癌細胞增殖(Gabrilovich等人，細胞免疫學(CellImmunol.)17011-9(1996)；Vezzio等人，國際免疫學(Int.Immunol)819963-70(1996)；Young等人，實驗醫(yī)學雜志1837-11(1996))。通過利用DC的這些功能，最近對DC用于癌癥免疫療法的開發(fā)進行了深入研究(Giboa等人，癌癥免疫學與免疫療法(Cancerimmunol.immunother.)，4682-87(1988)；Nestle等人，自然醫(yī)學(Nat.Med.)，4328(1998)；Song等人，實驗醫(yī)學雜志，1861247(1997))。
此外，DC已被證實在AIDS的發(fā)病中起關鍵作用(Fauci，科學，2621011(1993)；Pantaleo等人，自然，362355(1993)；Embretson等人，自然，362359(1993)；Haynes等人，科學(Science)，271324(1996))。感染HIV-1病毒的病人通常經(jīng)歷為期3-15年的無癥狀期，期間在病人的血流中僅見到微量的HIV-1病毒。但在淋巴結中DC周圍卻可見到大量的病毒和受感染的CD4+T細胞(Pantaleo等人，自然362355(1993))。這說明在整個臨床潛伏期，即使在血液中僅顯示微量病毒活動時，淋巴器官中的HIV復制是活躍的。他們對這一現(xiàn)象的解釋是在原發(fā)病毒血癥期間，DC接觸并感染了大量HIV-1，返回淋巴結，在此它們刺激原初T細胞，然后將病毒傳播給這些活化的CD4+T細胞。DC-介導的HIV-1傳播，引起CD4+T細胞的活動性感染以及淋巴結中T細胞短缺，隨之導致血流中CD4+T細胞缺乏，直至AIDS水平(Blauvelt等人，臨床研究雜志(J.Clin.Invest.)1002043(1997)；McCloskey等人，免疫學雜志(J.Immunol.)1581014(1997))。有一篇文獻報道，純化的原始CD4+T細胞在缺乏抗原呈遞細胞如DC或巨噬細胞時，并不受HIV-1感染，而且DC向CD4+T細胞傳播HIV-1的效率要比巨噬細胞高的多(Joo等人，韓國微生物學會雜志(J.Kor.Soc.Microbiol.)，3077(1995))。這些研究結果實例，具體證明了DC在AIDS的發(fā)展中起重要作用。
在過去的幾年中，DC因上述特性和特征而受到了免疫學家和有關科學家的高度重視。然而，由于存在以下限制因素，DC研究并沒有象在其它實驗中期望的那樣取得如此快速的進展。首先，在總的PBL中DC所占不足1％，而且在體外即使存在粒細胞巨噬細胞-集落刺激因子(GM-CSF)，其數(shù)量也不增長，而有報道認為GM-CSF能支持DC存活達6周(Marcowitz與Engleman，臨床研究雜志85955，1990)。第二，至今還沒有發(fā)現(xiàn)人類DC特異性表面標記。
有限的細胞數(shù)量以及DC特異性表面標記的缺乏，使之難以應用純化的、足夠數(shù)量的DC進行進一步實驗。然而，幾家實驗室仍堅持研究，結果DC的特征目前已被認可。到目前為止，已從PBL中純化出DC，這一般都是通過負選擇法進行的，該法在其它文獻中已有描述(Freudenthal等人，國家科學院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci)877698(1990))。在負選擇法中，通過下述實驗步驟，從PBL中去除其它免疫細胞如T細胞、B細胞、單核細胞和巨噬細胞，從而分離出DCFicoll梯度、E-玫瑰花環(huán)、黏附淘選、Fc淘選、三碘苯甲酰氨基葡萄糖梯度離心、以及抗體淘選方法。這些步驟太過費力和復雜，可能不適用于一般實驗室。
最近，有些研究人員嘗試通過在體外有細胞因子如GM-CSF和IL-4存在條件下，使骨髓干細胞(CD34+，CD11c+)或單核細胞分化而產(chǎn)生DC(Bender等人，免疫學方法雜志(J.Immunol.Methods)196121-135(1996))。最近大多數(shù)用于免疫療法的DC研究都利用這種方法制備DC。然而，這種方法也有其不足，它的費用較高，而且分化需要較長的時間。此外，盡管分化的細胞在形態(tài)學上象DC，但在其生物學功能方面，它們是不是真正的DC、以及用于免疫療法時在體內(nèi)能否代替真的DC，還是有爭議的。
因此，為了從實際出發(fā)研究DC，首先基本的是找到DC特異性表面標記并制備針對它的單克隆抗體。這些單克隆抗體不但在研究DC方面很有用處，而且也可用于從PBL中DC的正選擇。為此，已提出了幾種單克隆抗體，并將其用作DC檢測抗體。然而，它們中的大多數(shù)因有其自身的限制，并不太適用于從PBL中檢測和分離DC。例如，HB15分子(CD83)的單克隆抗體(mAB)就只與活化的DC起反應，而根本不與原初DC起反應。我們目前的研究已證明，與其它細胞特異性表面標記相比，CD83即使在活化的DC也沒有得到充分表達。此外，針對CD83的mAB的特異性無與活化的DC反應及與活化的單核細胞/巨噬細胞反應那樣高的特異性。然而，它一直被廣泛用于在體外鑒定源于單核細胞的DC(Fearnley等人，血液(Blood)，893708(1997)；Zhou等人，免疫學雜志，1543821(1995))。
此外，也有報道將CD11c和CD1a作為DC特異性表面標記(Gao等人，免疫學(Immunology)91135(1997)；Lardon等人，免疫學91553(1997)；Ruedl等人，免疫學2661801(1996))。但它們對DC的特異性存在一個問題。CD11c不但在DC上表達，而且也在巨噬細胞、粒細胞和NK細胞表達，而CD1a也見于胸腺細胞和郎罕細胞。這些結果在我們的實驗中也得到部分證實。我們發(fā)現(xiàn)CD11c在DC表面有大量表達，但在B細胞和單核細胞也有同等數(shù)量或較低數(shù)量的表達。而CD1a并不在原初DC表面表達。這些結果說明，CD1a、CD11c和CD83并不適合作為DC特異性表面標記。

發(fā)明內(nèi)容
考慮到這一背景，本發(fā)明的發(fā)明者制備了DC的cDNA文庫，并檢查文庫以尋找一種DC特異性表面標記。通過一系列實驗，如斑點提取(plaque-lifting)和DNA斑點示差雜交、序列測定以及定量RT-PCR，發(fā)明者發(fā)現(xiàn)，HLA-DMα/b(此后稱為DMα)基因只在PBL中的DC上表達(Bae等人，分子與細胞(Mol.Cells)，5569，1995)。制備了一種針對DMα細胞外區(qū)的單克隆抗體，后來稱之為3-6-A。同時檢測了Mab3-6-A以及其它提出的單克隆抗體對DC的特異性。
因此，本發(fā)明的一個目的就是提供一種新的單克隆抗體，它只識別PBL中的DC。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種雜交瘤細胞，它產(chǎn)生這種新的單克隆抗體。
為了制備一種針對PBL中DC上特異性表達的DMα蛋白質(zhì)的單克隆抗體，嘗試了讓DMα蛋白質(zhì)在大腸桿菌中表達，并將其接種到BALB/c小鼠進行免疫。然而，結果發(fā)現(xiàn)如此得到的單克隆抗體中，沒有一種能夠識別表達在DC或Raji細胞上的正常DMα(Kim等人，分子與細胞，6684(1996))。DMα在人類和小鼠之間有75％以上的氨基酸序列同源性，這提示應用重組h-DMα蛋白質(zhì)在BALB/c小鼠中制備抗人DMα單克隆抗體，可能是困難的。
Kim等人(分子與細胞，6684(1996))制備的單克隆抗體之所以不能識別表達在DC上的正常DMα的原因，被認為可歸咎于以下可能性。當以一種包涵體的形式表達時，因缺乏糖基化或結構破壞，重組DMα將會失去它的B細胞表位。
在本發(fā)明中，重組DMα蛋白質(zhì)是從一種桿狀病毒系統(tǒng)中獲得的。這種重組DMα蛋白質(zhì)被證明保持了表達在Raji細胞或DC上的正常DMα的抗原性以后，被用來制備單克隆抗體3-6-A。通過IsoStripTM試劑盒(Boehringer Mannheim)分析發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的單克隆抗體3-6-A是一種IgG1亞類，具有γ1同型κ鏈。
單克隆抗體3-6-A對DC和Raji細胞中表達的正常DMα顯示出很強的反應性，而且反應性具有很強的特異性，只針對原始免疫細胞中的DC。此外，還發(fā)現(xiàn)抗體3-6-A不但與細胞漿深染，而且也與DC的細胞表面深染。這些特性說明，PBL中只有DC在其細胞漿以及細胞表面表達相當數(shù)量的DMα。這一結果與以往的報道大不相同，這些報道認為DM蛋白質(zhì)屬于核內(nèi)體區(qū)室，只位于細胞漿(Karlsson等人，科學，2661569(1994)；Sanderson等人，科學，2661566(1994))。本發(fā)明者發(fā)現(xiàn)，這種差別是由于實驗中應用的細胞類型不同。實際上，Raji細胞只有在先固定和增加通透性后，才與3-6-A染色，如不固定則不著色，這說明在Raji細胞中DM只位于細胞漿，而不象以往報道的那樣位于細胞表面。這些結果強烈提示，DM表達類型有可能是細胞類型特異的。本發(fā)明者在全世界首先發(fā)現(xiàn)，DM只表達在PBL中的DC表面。
最近有幾項報道宣稱，DM作為一種侶伴蛋白質(zhì)在MHC II類-依賴抗原呈遞方面起重要作用(Morris等人，自然368551，1994；Karlsson等人，科學2991569，1994)。Sanderson等人(免疫學487，1996)報道，通過免疫共沉淀實驗，發(fā)現(xiàn)DM誘導CLIP從HLA-DR解離，促使肽與DR分子的結合。但本研究結果發(fā)現(xiàn)有相當數(shù)量的DM表達在DC表面，提示DM分子除了侶伴功能外，在DC中還發(fā)揮其它某些重要功能，至少是部分功能。首先，我們的結果強烈提示，DM分子可用作DC特異性表面標記。
本發(fā)明的單克隆抗體3-6-A不但可用于表達在DC表面的DM功能的研究，而且也可用來研制用于PBL中DC正選擇的工具。DC在免疫反應中起關鍵作用。特別是，DC是研究癌免疫療法的重要材料。因此，迫切需要研制一種純化DC的正選擇方法。正選擇工具一旦用單克隆抗體3-6-A建立，在本發(fā)明中研制出來，那么在探討DC介導的研究和癌免疫療法方面將會提供很大幫助。本發(fā)明的完成是通過在發(fā)明者的研究結果的基礎上制備了單克隆抗體3-6-A，并測試了它的特異性以及與DC的結合能力。
附圖簡述

圖1中的流程圖簡要顯示了用于單克隆抗體3-6-A制備和特征分析的步驟；圖2中的SDS-PAGE照片顯示了重組DMα在轉化的大腸桿菌中的表達；圖3中的照片顯示了High-5細胞轉染重組桿狀病毒DNA后產(chǎn)生重組病毒體而形成的陽性噬菌斑；圖4中的蛋白質(zhì)印跡照片顯示了重組DMα在桿狀病毒系統(tǒng)中的正常表達；圖5中的蛋白質(zhì)印跡照片顯示了小鼠抗重組DMα抗血清與Raji細胞中表達的真正DMα的反應性；圖6中的蛋白質(zhì)印跡照片顯示了單克隆抗體3-6-A與大腸桿菌和細胞中表達的DMα的反應性；圖7A中的熒光顯微鏡照片顯示了DC和Raji細胞的細胞漿和表面用單克隆抗體3-6-A染色；圖7B是Raji細胞在固定前或固定后用單克隆抗體3-6-A染色的FACS直方圖；圖8中的熒光顯微鏡照片顯示了與其它商品化DC特異性單克隆抗體用于染色純化的原始免疫細胞相比較，單克隆抗體3-6-A對DC的特異性；
圖9中的斑點印跡照片比較了單克隆抗體3-6-A與商品化DC特異性單克隆抗體對純化的DC的反應性和特異性；以及圖10中的FACS直方圖顯示了單克隆抗體3-6-A與各種純化的原始免疫細胞的反應性。
實施本發(fā)明的最佳方式要實現(xiàn)本發(fā)明的目的，首先將一個編碼DMα基因細胞外區(qū)609bp的DNA片段(相應于122-731堿基序列)克隆到桿狀病毒轉移載體pBlueBacHis2A中，以產(chǎn)生一個重組質(zhì)粒pBlueBacHis2A-DMα。這個重組質(zhì)粒與桿狀病毒全長DNA即Bac-N-Blue(Invitrogen)一起，共轉染到High-5細胞(Invitrogen)中，導致重組桿狀病毒Bac-N-Blue-DMα的產(chǎn)生，然后將其感染大量培養(yǎng)的High-5細胞。收獲感染High-5細胞，將其提取物置于Ni+-NTA柱(Qiangen)，純化重組DMα蛋白質(zhì)。用純化的重組DMα蛋白質(zhì)免疫BALB/c小鼠，取其脾細胞與小鼠骨髓瘤Sp2/0細胞雜交，產(chǎn)生出雜交瘤細胞KHB-DM，后者產(chǎn)生單克隆抗體3-6-A。現(xiàn)在通過培養(yǎng)雜交瘤細胞KHB-DM，可獲得單克隆抗體3-6-A。實施例1DC及其它原始免疫細胞的純化按照以往報道的步驟(Bae等人，分子與細胞，5，569，1995)，從韓國紅十字血庫提供的淡黃色細胞層或leukopak中純化DC及其它免疫細胞(T細胞、B細胞和單核細胞)。實施例2DC的mRNA提取和DMα-cDNA合成根據(jù)已知技術(Bae等人，分子與細胞，5，569，1995)，從在實施例1得到的DC中提取mRNA。將mRNA與1μg Oligo-dT引物在逆轉錄溶液(Rnase抑制物0.5μl，5×第一鏈合成反應緩沖液4μl，0.1mM DTT2μl，10mM dNTP 1μl)中37℃孵育2分鐘，隨后加入5個單位的AMV-逆轉錄酶。該溶液在37℃孵育40分鐘，然后再在45℃孵育30分鐘以合成cDNA。應用該cDNA作為模板以及表1所示的引物，通過PCR擴增DMα基因。
表1DMα的引物

PCR之進行是通過94℃/1分鐘、40℃/30秒和72℃/45秒的熱循環(huán)，重復5次，然后是94℃/1分鐘和72℃/1分鐘的熱循環(huán)25次，以便產(chǎn)生一個編碼DMα基因細胞外區(qū)(堿基序列12-732)的609bp DNA片段。實施例3DMα在大腸桿菌的克隆與表達在實施例2中用PCR擴增的DNA被BamHI和HindIII雙重消化，插入被相同的限制酶打開的質(zhì)粒pRSET/A(Invitrogen)中，產(chǎn)生一個重組質(zhì)粒pRSET-DMα。將這個重組pRSET-DMα轉化入大腸桿菌BL21(DE3)，然后將后者涂布在含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基上。將陽性菌落接種到M-9氨芐青霉素培養(yǎng)液(1％細菌用胰蛋白胨、Na2HPO4、KH2PO4、NaCl、NH4Cl、2M葡萄糖、0.5％二胺、1M MgSO4、1M CaCl2)中，攪拌培養(yǎng)。當培養(yǎng)物的吸光度達到0.5，加入最終濃度為1mM的IPTG，在37℃誘導蛋白質(zhì)表達，2小時。通過SDS-PAGE分析，鑒定重組DMα在轉化大腸桿菌中的表達，其中可在29kDa檢測到一條條帶(圖2)。在圖2中，泳道1是一個蛋白質(zhì)大小標志物，泳道1只用pRSET/A質(zhì)粒轉化的大腸桿菌BL21(DE3)的裂解產(chǎn)物；泳道2用重組DMα質(zhì)粒轉化的大腸桿菌BL21(DE3)的裂解產(chǎn)物；以及泳道3一種DMα蛋白質(zhì)樣本，它是在Ni+-NTA樹脂(Qianfen)幫助下從泳道2之重組細菌中純化出來的。實施例4表達DMα的重組桿狀病毒的構建綜合超前/滯后

<p>將在實施例6中獲得的DMα蛋白質(zhì)與等體積的弗氏佐劑(Sigma)混合，接種到5-6周齡的BALB/c小鼠，劑量為每只小鼠50μg。然后被接種的小鼠每隔3周分別接受同一抗原的第二次和第三次加強接種，劑量為每只小鼠25μg。第三次免疫后，從眼靜脈給每只BALB/c小鼠放血，以分析抗血清。實施例8抗血清與重組DMα的反應性將感染重組桿狀病毒Bac-N-Blue-DMα的High-5細胞制成勻漿，用SDS-PAGE分離獲自裂解細胞的蛋白質(zhì)。應用一種轉移溶液(48mMTris-HCl、39mM甘氨酸、20％甲醇、1.3mM SDS)，在一個半干燥凝膠印跡裝置(BioRad)中，將SDS-PAGE分離的蛋白質(zhì)轉移印跡到硝酸纖維素膜上。用blotto(5％(w/v)脫脂牛乳，0.02％NaN3，在PBS中)封閉印跡硝酸纖維素膜30分鐘，PBS洗3次，將其置于10ml PBS中(其中含5μl在實施例7中得到的抗血清)，室溫放置30分鐘。用PBS洗3次，將膜浸泡在含作為第二抗體的山羊抗小鼠IgG-堿性磷酸酶(Sigma)的PBS溶液中，然后，加入NBT/BCIP溶液〔50mg/ml NBT(氮藍四唑)66μl、50mg/ml BCIP(5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸)30μl，加入10ml AP緩沖液(100mM NaCl，5mM MgCl2，100mM Tris-HCl，pH9.5)〕作為酶反應底物，觀察結果。當在暗處看到一條由酶反應引起的條帶，即加入終止溶液(10mM Tris-Cl中含20mM EDTA，150mM NaCl，pH8.0)終止反應。
該蛋白質(zhì)印跡分析顯示，重組桿狀病毒Bac-N-Blue-DMα在High-5細胞中正常表達DMα，如圖4所示。在圖4中，泳道M是蛋白質(zhì)大小標記物，泳道1是未感染的High-5細胞裂解物，泳道2是野生桿狀病毒感染的High-5細胞裂解物，泳道3是重組桿狀病毒Bac-N-Blue-DMα感染的High-5細胞裂解物，泳道4是大腸桿菌BL21(DE3)裂解物—作為陰性對照，以及泳道5是表達重組DMα的重組大腸桿菌BL21(DE3)。實施例9抗血清與真正DMα的反應性蛋白質(zhì)印跡分析的方法與實施例8相似，使用1×106未處理的Raji細胞和1×106用濃度為100單位/mlγ-干擾素(Sigma)處理3天的Raji細胞。結果見圖5。在圖5中，泳道1是對照Jurkat細胞裂解物，泳道2是Raji細胞裂解物，以及泳道3是γ-干擾素處理的Raji細胞裂解物。
這一分析顯示，用重組DMα免疫的BALB/c小鼠的抗血清，能很好地與Raji細胞表達的真正DMα起反應。實施例10表達單克隆抗體的雜交瘤細胞的制備用脊柱脫位法將接受重組DMα(獲自實施例7中桿狀病毒系統(tǒng)的表達)免疫的小鼠處死，切除脾臟。將1.4×107個脾細胞懸浮于10ml富含葡萄糖的DMEM培養(yǎng)液中，與3×106小鼠骨髓瘤細胞SP2/O(Sp2/O-Ag14 KTCC CRL1581)混合，用富含葡萄糖的DMEM培養(yǎng)液沖洗。在細胞沉淀中加入50％PEG-4000溶液(Gibco BRL)1ml，1分鐘，以誘導細胞融合。以1ml/min的速率緩慢加入富含葡萄糖的DMEM培養(yǎng)液后，細胞充分混合，離心。將細胞沉淀懸浮在5ml 1×DMEM20％中，分置于多孔平板，每孔50μl，其中培養(yǎng)的小鼠巨噬細胞作為飼養(yǎng)細胞(Lane，H.D.編著，抗體實驗手冊(Antibody Lab.，Mannual).p220，1989)，然后培養(yǎng)1天。隨后，在每個孔中加入等體積的2×HAT培養(yǎng)基。在長時間的培養(yǎng)過程中，融合細胞形成集落。從18個孔中選擇在HAT培養(yǎng)基中形成集落的雜交瘤細胞。實施例11分泌與DMα起反應的單克隆抗體的雜交瘤細胞的鑒定將在實施例10中獲得的18個集落分別置于大量培養(yǎng)基中培養(yǎng)，應用ELISA、斑點免疫印跡雜交和蛋白質(zhì)印跡雜交對上清液進行分析。用在實施例3和6中制備的DMα包被96孔板，最終濃度為每孔0.5μg，4℃下過夜。平板用100μl含0.05％Tween20的PBS沖洗2次。每個孔中加入1％脫脂牛乳溶液(去離子水溶解，加有0.02％NaN3)90μl，置37℃下1小時。隨后，各孔中加入實施例7中的抗血清進行反應，37℃下1小時。沖洗后，加入第二抗體(山羊抗小鼠IgG-AP，1/1000稀釋)，37℃孵育2小時。沖洗2次后，每個孔中加入50μl堿性磷酸酶底物(10％二乙醇胺緩沖液1ml(二乙醇胺97ml，NaN30.2g(0.02％)，MgCl26H2O100mg(0.01％)，DDW 800ml；總共1L)中含對硝基苯基磷酸1mg)，37℃孵育30分鐘。反應完成后，用ELISA讀出器(Molecular Devices)在405nm測量吸光度。用與實施例8相同的方法進行蛋白質(zhì)印跡，斑點免疫印跡雜交則根據(jù)以往的方法(Kim等人，分子與細胞，6，684，1996)進行。
結果總結如下，見表3。在表3中，單克隆抗體與大腸桿菌和桿狀病毒系統(tǒng)中表達的重組DMα蛋白質(zhì)的反應性用ELISA和蛋白質(zhì)斑點印跡測定，而其與不同細胞中表達的真正DMα的反應性，則用斑點免疫印跡和蛋白質(zhì)印跡雜交測定。該實驗顯示，全部14種單克隆抗體都與大腸桿菌中表達的重組DMα起強烈反應，但除了單克隆抗體3-6-A外，余者都不與High-5細胞中表達的重組DMα起反應。蛋白質(zhì)印跡和斑點免疫印跡雜交測定發(fā)現(xiàn)，單克隆抗體3-6-A與PBL中的DC起強烈反應。此外，單克隆抗體3-6-A還在蛋白質(zhì)印跡雜交中與Raji細胞起強烈反應。蛋白質(zhì)印跡雜交偶可在B細胞級分中檢測到弱陽性反應。這種弱反應性提出了一個可能性，即活化的B細胞有可能表達DM。根據(jù)這些結果，從14種單克隆抗體中選擇出了針對DMα的單克隆抗體3-6-A。表達單克隆抗體3-6-A的雜交瘤細胞被命名為KHB-DM，貯存在韓國生物科學和生物技術研究所(Koran Research Institute of Bioscience andBiotechnology)的韓國典型培養(yǎng)物保藏中心(保藏號KCTC-0485BP)。實施例12單克隆抗體3-6-A與在DC和Raji細胞中表達的真正DMα的反應性在蛋白質(zhì)印跡雜交中測試了單克隆抗體3-6-A對重組DMα以及在Raji細胞和DC中正常表達的真正DMα的反應性。結果見圖6。如圖6所示，單克隆抗體3-6-A對Raji和DC中正常表達的34 kDa DMα具有高度反應性。在圖6中，泳道1是大腸桿菌BL21(DE3)裂解物的陰性對照，泳道2是表達DMα的大腸桿菌裂解物，泳道3是表達DMα的High-5細胞裂解物，泳道4是Raji細胞裂解物，以及泳道5是DC裂解物。
表3單克隆抗體與DMα的結合力

注結合力用ELISA、斑點免疫印跡和/或蛋白質(zhì)印跡雜交測定。
-結果與陰性對照相似+陽性結果，該符號的數(shù)目表示陽性信號的強度，只要405nm吸光度從基礎陽性值增加0.2，該符號就逐一增加，基礎陽性值是陰性對照的平均值加5SD(標準差)。++++用于表示ELISA值等于或高于4個符號的所有反應。
在蛋白質(zhì)印跡和斑點免疫印跡中，只有當檢測到的信號被清楚地重復時，才用‘+’這一符號。隨著強度增加，該符號的數(shù)目也增加。
±弱的或非重復性信號。實施例13單克隆抗體3-6-A的大量生產(chǎn)雜交瘤細胞KHB-DM以2×105個細胞/ml的密度接種到高葡萄糖DMEM20％培養(yǎng)基。4天后達到最大程度生長時，收獲培養(yǎng)上清作為單克隆抗體3-6-A的來源。此時，單克隆抗體的濃度約達40μg/ml培養(yǎng)基。
為了生產(chǎn)大量的單克隆抗體，將雜交瘤細胞置于小鼠腹腔內(nèi)培養(yǎng)。首先給BALB/c小鼠腹腔內(nèi)注射1ml降植烷(prestane)。一周后，每只小鼠接種5×106雜交瘤細胞。7-14天后，當小鼠腹腔充分腫脹時，用18號針頭連接10ml注射器抽取腹水，每只小鼠抽5-10ml，然后1,500轉/分離心10分鐘。獲得的上清液中加入0.02％NaN3，-70℃以下貯存。腹水中的單克隆抗體濃度為5-9mg/ml。實施例14單克隆抗體3-6-A的H和L鏈同種型分型應用同種型分型試劑盒IsoStripTM(Boehringer Mannheim)檢測了實施例11中雜交瘤細胞KHB-DM產(chǎn)生的單克隆抗體3-6-A的同種型。發(fā)現(xiàn)單克隆抗體3-6-A是IgG1同種型，具有κ-輕鏈。實施例15單克隆抗體3-6-A染色DC的細胞漿和表面顯微鏡載玻片用1mg/ml聚L-賴氨酸(Mw 400,000)溶液包被15分鐘，用去離子蒸餾水沖洗。如實施例1分離的Raji細胞(ATCC CCL86)和DC被稀釋至105細胞/ml，附著到聚L-賴氨酸包被的玻片上，然后用PBS沖洗。將在實施例13獲得的單克隆抗體(培養(yǎng)上清液)100μl加到有細胞附著的玻片上，置CO2孵箱1小時，然后用PBS沖洗3次。與第二抗體(抗小鼠IgG-FITC)在37℃ CO2孵箱反應30分鐘后，玻片用PBS沖洗2次，然后在熒光顯微鏡(Nikon E-600 Epi熒光顯微鏡)下觀察。
在用單克隆抗體3-6-A染色前，先將有DC附著的玻片浸于有機溶劑(50％甲醇和50％丙酮)中固定，以便用3-6-A染色DC細胞漿。固定后，應用與上文相同的方法，使DC被單克隆抗體3-6-A和第二抗體染色，在熒光顯微鏡下觀察。
在圖7A中，a組是DC的顯微鏡照片，顯微鏡(Nikon TMS)下放大400倍，b組是DC用PE偶聯(lián)的HLA-DR(Becton-Dikinson)染色作為對照的熒光顯微鏡照片，c組是DC分別用抗體3-6-A和FITC-偶聯(lián)的第二抗體結合并染色的照片，d組是首先固定、然后應用與c組中所示相同方法染色的DC照片，e組和f組分別是用相同方法染色的未固定和固定的Raji細胞的照片。
圖7B顯示了用單克隆抗體3-6-A和FITC偶聯(lián)的第二抗體染色的未固定和固定的Raji細胞的FACS結果。Raji細胞組分的一半用Cytofix/cytoperm CytostainTM試劑盒(Pharmingen)固定，方法按照銷售商手冊。未固定和固定的Raji細胞用單克隆抗體3-6-A在4℃處理30分鐘，PBS洗2次，然后在4℃用上述相同的FITC偶聯(lián)的第二抗體染色30分鐘。染色細胞用PBS洗2次，立即用FACStar(Becton-Dickinson)進行分析。在圖7B中，a組和b組分別是未固定和固定的Raji細胞的FACS結果。
正如圖7所明確顯示的那樣，DMα在DC表面及其細胞漿中有大量表達(圖7A c組和d組)，這與以前的報道不同，以前的報道堅持認為DM只是核內(nèi)體區(qū)室。而在染色前固定的Raji細胞也被3-6-A深染(圖7A f組和7B b組)。然而，未固定的Raji細胞根本不被同一個抗體染色(圖7A e組和7B a組)。從Raji細胞得到的結果提示，DM分子只位于Raji細胞的細胞漿，而不位于Raji細胞表面，正如以前的報道所提到的那樣(Karlsson等人，科學266；科學2661599-1573，1994；Sanderson等人，科學2661566-1569，1994)。實施例16單克隆抗體3-6-A對DC表面的特異性應用與實施例1相同的方法分離T細胞、B細胞、單核細胞和DC。每種細胞均用PBS稀釋至105個細胞/ml，用在實施例13獲得的單克隆抗體3-6-A(培養(yǎng)上清液)100μl，4℃下處理30分鐘。750g離心后，細胞沉淀用PBS洗2次，懸浮在200μl PBS中，用第二抗體抗小鼠IgG-FITC(Sigma)10μl(1μg)在4℃染色30分鐘。離心后，細胞沉淀用PBS洗2次，附著在包被玻片上。應用實施例15中提到的熒光顯微鏡分析染色細胞，結果見圖8。圖8中，T列代表T細胞，B列代表B細胞，Mc列代表單核細胞/巨噬細胞，DC列代表DC。將標本與各種不同的商品化單克隆抗體和單克隆抗體3-6-A反應，然后用FITC偶聯(lián)的第二抗體染色。
正如圖8底部所顯示的那樣，單克隆抗體3-6-A對DC具有高度反應性，但與其它免疫細胞根本不起反應。這些資料證實，DM分子只表達在原始免疫細胞中DC的表面。相反，廣泛用于DC分析的針對CD11c或CD83的抗體，對PBL中的DC就沒有這么高的特異性，如圖8所示。它們不但與DC起反應，而且也與B細胞和單核細胞起反應。尤其是，已知在活化DC組分中表達的CD83(Zhou L.J.，免疫學雜志149，735，1992)，它的單克隆抗體(抗-CD83Immunotech Co.)除了對原初DC有反應性外，對單核細胞也顯示了類似強度的反應性，盡管反應程度較弱。Fascin的單克隆抗體不能識別未固定的DC，而據(jù)報道稱Fascin只在DC的細胞漿中表達。圖8中明確顯示的這些資料再次證實，本發(fā)明制備的單克隆抗體3-6-A與任何其它常規(guī)單克隆抗體相比，對DC具有更高的特異性和更強的親和力。實施例17單克隆3-6-A與DC的親和力將單克隆抗體3-6-A與DC的親和力，與其它常規(guī)DC特異性單克隆抗體與DC的親和力進行了比較。應用與實施例1相同的方法分離DC，用單克隆抗體3-6-A及其它商品化單克隆抗體進行斑點免疫印跡雜交(Kim等人，分子與細胞，6，684，1996)。
按實施例1的方法分離的每一DC組分中含有105個細胞，分別應用1μg的下述各個單克隆抗體染色抗CD1a單克隆抗體(Becton-Dickinson)、抗CD11c單克隆抗體(Becton-Dickinson)、抗CD83單克隆抗體(Immunotech.Co.)、抗Fascin單克隆抗體(NIH AIDS研究和參照試劑項目惠贈)、以及單克隆抗體3-6-A，染色方法同實施例15。第一抗體處理的細胞用堿性磷酸酶偶聯(lián)的山羊抗小鼠IgG(Promega)染色，方法同實施例15，然后在一個斑點印跡裝置(Bio-Rad)的幫助下將其印跡到硝酸纖維素膜上。按實施例8所示方法對膜進行顯色反應。
斑點免疫印跡雜交結果見圖9。在圖9中，斑點印跡信號1、2、3、和4分別是DC用作為對照的抗CD1a、抗CD11c、抗CD83、和抗Fascin單克隆抗體染色的實驗結果。而斑點印跡信號5顯示的是用單克隆抗體3-6-A染色的DC組分。在所測試的單克隆抗體中，單克隆抗體3-6-A對DC的親和力最強(圖9之印跡5)，這與實施例16所顯示的結果是一致的。僅次于單克隆抗體3-6-A，對DC親和力最強的是抗CD11c抗體(圖9之印跡2)，但它也與單核細胞和B細胞組分起反應(圖8)。針對CD83或Fascin的抗體與原初DC不起反應。實施例18應用單克隆抗體3-6-A對原始免疫細胞進行FACS分析應用單克隆抗體3-6-A處理在實施例1中分離的原始免疫細胞，其中包括T細胞、B細胞、單核細胞和DC在內(nèi)，4℃下30分鐘。用PBS洗2次后，細胞用第二抗體山羊抗小鼠IgG-FITC(Sigma)處理，4℃下30分鐘。染色細胞用PBS沖洗2次，然后立即用FACStar plus(Becton-Dickinson)分析。
FACS分析結果見圖10。在圖10中，A組顯示了采用與實施例1相同方法純化的免疫細胞的FACS圖，而B組顯示的是從分離前先在RPMI10％培養(yǎng)基中培養(yǎng)1周的PBL中純化的免疫細胞的FACS圖。T細胞的FACS圖位于第1列，單核細胞第2列，B細胞第3列，DC第4列。如第1和第2列所示，無論是原始分離的還是從培養(yǎng)的PBL中分離的T細胞或單核細胞/巨噬細胞，都不與單克隆抗體3-6-A起反應。至于B細胞，如為原始分離的，根本不與單克隆抗體3-6-A起反應。相反，如果是從培養(yǎng)1周的PBL中分離的，則有少量的B細胞組分被單克隆抗體3-6-A染色(圖10之第3列)。而分離的DC組分中60％以上被單克隆抗體3-6-A深染。原始分離和培養(yǎng)1周后分離的細胞之間的FACS結果沒有大的差異(圖10之第4列)。這些FACS資料也證實，單克隆抗體3-6-A特異性地與原始免疫細胞中的DC起反應。實施例19應用抗血清檢測在大腸桿菌和桿狀病毒系統(tǒng)中表達的DMα之間的抗原性重復實施例7的同一步驟，從接受重組DMα蛋白質(zhì)免疫的小鼠中獲取抗血清(抗DMα多克隆抗體)，這種重組DMα蛋白質(zhì)是實施例3中的大腸桿菌和實施例6中的桿狀病毒系統(tǒng)產(chǎn)生的。應用該多克隆抗體對重組DMα和Raji細胞中表達的真正DMα進行蛋白質(zhì)印跡雜交。
從用大腸桿菌中表達的重組DMα免疫的小鼠中獲得的抗血清，能很好地識別大腸桿菌表達中的重組DMα，但不能識別Raji細胞中表達的真正DMα。相反，從用桿狀病毒系統(tǒng)表達的DMα免疫的小鼠中獲得的抗血清，不但與Raji細胞中表達的真正DMα起反應，而且也與重組DMα起反應。這一結果提示，大腸桿菌中表達的重組DMα在抗原性上有可能與正常DMα蛋白質(zhì)不同。有人認為，如果用大腸桿菌中表達的DMα免疫小鼠，這種差異可能會導致以前的技術不能制備能夠與正常DMα起反應的單克隆抗體(Kim等人，分子與細胞，6，684，1996)。
工業(yè)可應用性正如此前所描述的那樣，本發(fā)明的單克隆抗體3-6-A對DC和Raji細胞中正常表達的真正DMα顯示了強烈的反應性。尤其值得注意的是，單克隆抗體3-6-A對PBL中的DC具有很高的特異性和很強的結合力。單克隆抗體3-6-A不但在細胞漿而且也在細胞表面染色DC。由于在研究DM分子的功能方面是非常有用的，因此，本發(fā)明的單克隆抗體可用作DC特異性表面標記，看來其強度足以允許從PBL中對DC進行正選擇。本發(fā)明在生物醫(yī)學工業(yè)中將是非常有用的，將推動針對癌癥或其它慢性疾病免疫療法的研究進展。
權利要求
1.一種在雜交瘤細胞KHB-DM(KCTC-0485BP)中產(chǎn)生的單克隆抗體3-6-A，它對外周血白細胞中的樹突細胞表面具有高度特異性。
2.一種雜交瘤細胞KHB-DM，其保藏號為KCTC-0485BP，它產(chǎn)生權利要求1的單克隆抗體3-6-A。
3.一種重組質(zhì)粒pBlueBacHis2A-DMα，其包括一個609bp的DNA片段，該片段編碼DMα基因的細胞外區(qū)，該細胞外區(qū)相應于覆蓋122和732之間的堿基序列。
4.一種重組桿狀病毒Bac-N-Blue-DMα，它是通過將權利要求3的重組質(zhì)粒pBlueBacHis2A-DMα與一種桿狀病毒全長DNA Bac-N-Blue共同轉染到High-5細胞而制備的。
5.一種從標本中探測樹突細胞的方法，包括以下步驟使一種抗體與標本中樹突細胞表面表達的DMα蛋白質(zhì)結合，該抗體只與外周血白細胞中的樹突細胞特異性地起反應，該標本含有或預期含有樹突細胞；以及標記與樹突細胞表面表達的DMα結合的抗體，以檢測用該抗體染色的細胞。
6.權利要求5所示的方法，其中所述抗體是權利要求1的單克隆抗體3-6-A。
7.權利要求5所示的方法，其中所述標記步驟是這樣進行的用一種偶聯(lián)熒光異硫氰酸(FITC)的第二抗體染色有抗體附著的DMα蛋白質(zhì)或抗體包被的細胞，以及觀察細胞或以任何方式與樹突細胞相連的DMα蛋白質(zhì)。
全文摘要
在此公開了單克隆抗體3－6－A,它可與一種DMα的細胞外區(qū)以及雜交瘤細胞KHB－DM結合,其保藏號為KCTC－085BP,該雜交瘤細胞產(chǎn)生單克隆抗體3－6－A。該單克隆抗體顯示了很強的結合力,而且只對外周血中的樹突細胞具有特異性。
文檔編號G01N33/53GK1275161SQ99801328
公開日2000年11月29日 申請日期1999年4月29日 優(yōu)先權日1998年6月27日
發(fā)明者裴容洙, 崔范奎 申請人:裴容洙