本發(fā)明涉及用于輔助檢測受試者的肝細(xì)胞癌(hcc)的體外方法。該方法可以包括確定獲自所述受試者的樣品中附接至觸珠蛋白(即具有seq?id?no:1中給出的序列的觸珠蛋白的β-鏈)的一種或多種n-聚糖結(jié)構(gòu)的量，以及將所述一種或多種聚糖結(jié)構(gòu)的量與所述一種或多種聚糖結(jié)構(gòu)的參考量進(jìn)行比較，其中相對于所述一種或多種聚糖結(jié)構(gòu)的參考量，所述患者的樣品中所述一種或多種聚糖結(jié)構(gòu)的量改變指示hcc。此外，本發(fā)明涉及附接至觸珠蛋白的一種或多種聚糖結(jié)構(gòu)或者源自觸珠蛋白的糖肽與afp和/或pivka-ii的組合在檢測hcc中的用途。

背景技術(shù)：

1、肝癌是全球第七大常見癌癥，并且是第二大癌癥死亡原因。2012年發(fā)病率和死亡率分別為每100,000人10.1例和9.5例。

2、肝細(xì)胞癌(hcc)是全球原發(fā)性肝癌的主要組織學(xué)類型，占總負(fù)擔(dān)的70％至85％。已知諸如肝纖維化和肝硬化的基礎(chǔ)肝病是發(fā)展hcc的主要風(fēng)險(xiǎn)因素。對于早期診斷的患者，可以通過切除、肝移植或射頻局部消融來治療hcc。

3、如果早期診斷出這種惡性腫瘤，則hcc患者的5年存活率可能高達(dá)70％。然而，hcc患者的5年存活率隨著疾病診斷的越晚而顯著下降，并且如果在疾病晚期診斷出hcc，則hcc患者的5年存活率將降至僅15％(tsuchiya?n,sawada?y,endo?i等人biomarkers?for?theearly?diagnosis?of?hepatocellular?carcinoma.world?j?gastroenterol.2015；21(37):10573-83；siegel?r,naishadham?d,jemal?a.cancer?statistics,2013.ca:acancer?journal?for?clinicians.2013；63(1):11-30)。由于缺乏癥狀，超過60％的hcc患者在晚期才被診斷，此時(shí)已發(fā)生轉(zhuǎn)移(altekruse?sf,mcglynn?ka,reichmanme.hepatocellular?carcinoma?incidence,mortality,and?survival?trends?in?theunited?states?from?1975to?2005.journal?of?clinical?oncology:official?journalof?the?american?society?of?clinical?oncology.2009；27(9):1485-91)。因此，開發(fā)一種無創(chuàng)的早期hcc診斷hcc測試對于降低死亡率和增加hcc治療的效率/成功率至關(guān)重要。

4、用于診斷hcc的最常見方法是超聲檢測、諸如計(jì)算機(jī)軸向斷層掃描(cat掃描)或磁共振成像(mri)的成像技術(shù)以及血清學(xué)生物標(biāo)志物。然而，超聲檢測的預(yù)后價(jià)值差，因?yàn)樗枰辽?cm的腫瘤塊，并且成像技術(shù)對基于每個(gè)病灶的靈敏度差且成本高。另一方面，近年來一直致力于發(fā)現(xiàn)新的血液生物標(biāo)志物，這些生物標(biāo)志物可以用于監(jiān)測用于早期檢測高?；颊叩膆cc的項(xiàng)目(yang?jd.detect?or?not?to?detect?very?early?stagehepatocellular?carcinoma？the?western?perspective.clin?mol?hepatol.2019；25(4):335-43)。

5、目前的一些醫(yī)療指南建議每6個(gè)月使用超聲或其他成像方式對高?；颊哌M(jìn)行監(jiān)測。然而，成像方法的局限性包括對早期腫瘤的靈敏度差、操作者依賴性以及在患有肥胖或非酒精性脂肪性肝炎的患者中的質(zhì)量較低。腫瘤生物標(biāo)志物afp的輔助使用可能會(huì)改善檢測率，但檢測小腫瘤的靈敏度有限。

6、觸珠蛋白(hp)是一種急性期糖蛋白，具有四個(gè)n-糖基化位點(diǎn)。與許多其他炎癥標(biāo)志物和許多其他腫瘤相關(guān)生物標(biāo)志物一樣，已偶爾提到hp可能是hcc領(lǐng)域的候選標(biāo)志物(tai?c-s,lin?y-r,teng?t-h,lin?p-y,tu?sj,chou?c-h,huang?y-r,huang?w-c,weng?s-l,huang?hd,chen?y-l,chen?wl.haptoglobin?expression?correlates?with?tumordifferentiation?and?five-year?overall?survival?rate?in?hepatocellularcarcinoma.plos?one?2017；12(2):e0171269)。血清觸珠蛋白的異常糖基化，尤其是糖基化位點(diǎn)asn241上的異常糖基化，最近已被證明與胃癌的發(fā)生相關(guān)(jeong?s,kim?u,oh?mj,namj,park?sh,choi?yj,lee?dh,kim?j,an?hj.detection?of?aberrant?glycosylation?ofserum?haptoglobin?for?gastric?cancer?diagnosis?using?a?middle-up-downglycoproteome?platform.j.pers.med.2021；11:575)。針對其他類型的癌癥，也已報(bào)道了觸珠蛋白的特異性糖基化變化，該癌癥包括肝癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、胰腺癌和結(jié)腸癌(oh?mj,lee?sh,kim?u,an?hj.in-depth?investigation?of?altered?glycosylation?inhuman?haptoglobin?associated?cancer?by?mass?spectrometry.mass?spec?rev.2021；1–23)。

7、ramachandran?p.等人(2022)最近描述了非酒精性脂肪性肝炎和肝細(xì)胞癌中的血清糖蛋白標(biāo)志物。該研究還包括基于質(zhì)譜法的觸珠蛋白的氨基酸殘基位置184、207、211和241處的聚糖評估(ramachandran,gege?xu,hector?h.huang,rachel?rice,bo?zhou,klauslindpaintner和daniel?serie?journal?of?proteome?research?2022?21(4),1083-1094.doi:10.1021/acs.jproteome.1c00965)。

8、甲胎蛋白(afp)是最成熟的hcc血液生物標(biāo)志物。然而，即使是afp對于hcc的早期檢測也表現(xiàn)出次優(yōu)的靈敏度和特異性。此外，據(jù)報(bào)道，患有慢性肝炎或肝硬化但未患hcc的患者的afp水平可能會(huì)出現(xiàn)假性升高。

9、afp是一種糖蛋白，并且已經(jīng)描述了afp的各種糖基化形式。凝集素可以用于糖蛋白的分析。通過利用凝集素對糖蛋白的糖鏈結(jié)構(gòu)的選擇性結(jié)合能力，可以分離和濃縮具有特定糖鏈結(jié)構(gòu)的標(biāo)志物糖蛋白級分。就afp而言，源自扁豆凝集素-a(lca)的凝集素已被廣泛使用。α-甲胎蛋白(afp-l3)的扁豆凝集素(lca)反應(yīng)性級分在患有hcc的患者中特異性增加。已經(jīng)進(jìn)行了許多嘗試來特異性測量afp-l3，例如通過使用lca的親和電泳、基于凝集素的elisa或通過特異性結(jié)合afp的l3形式的抗體。

10、使用質(zhì)譜儀的高速/高靈敏度定性/定量分析也用于糖蛋白的分析。多反應(yīng)監(jiān)測質(zhì)譜法(mrm)有助于對蛋白質(zhì)水解產(chǎn)生的肽進(jìn)行定量，并且非常可靠。平行反應(yīng)監(jiān)測(prm)技術(shù)使用配備有阱和飛行時(shí)間質(zhì)量分析器的質(zhì)譜儀，使得可以獲得肽的產(chǎn)物離子譜，從而允許同時(shí)對肽進(jìn)行定量和定性分析。該方法還可以以高重現(xiàn)性和良好的靈敏度分析表現(xiàn)出低信號的痕量糖蛋白。

11、用于使用質(zhì)譜儀分析特定糖鏈的方法包括基于從糖蛋白分離的糖鏈的分析的方法和基于糖鏈結(jié)合肽(即糖肽)的分析的方法。

12、結(jié)合在蛋白質(zhì)的一個(gè)且相同的氨基酸位置上的糖鏈可以具有各種結(jié)構(gòu)并表現(xiàn)出異質(zhì)性。還已知糖結(jié)構(gòu)可以根據(jù)糖鏈所在的氨基酸位置而變化。

13、基于mrm-ms分析，kim和同事證明，α-甲胎蛋白的去糖肽能夠比非糖肽更好地區(qū)分正常受試者與肝細(xì)胞癌患者的癌癥狀態(tài)(kim?h,kim?k,jin?j,park?j,yu?sj,yoon?j-h,kim?y.measurement?of?glycosylated?alpha-fetoprotein?improves?diagnostic?powerover?the?native?formin?hepatocellular?carcinoma.plos?one,2014,9:e110366)。在ep3?415?918中，已經(jīng)通過質(zhì)譜法分析了afp-l3的各種糖肽，并將其用于比較獲自患有hcc的患者的樣品與獲自患有肝硬化或肝炎的受試者的樣品。

14、維生素k缺乏/拮抗劑-ii誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)(pivka-ii)，也稱為脫伽馬羧基凝血酶原(dcp)，是在hcc患者中升高的凝血酶原蛋白的異常形式，并且單獨(dú)或與afp組合用作可替代的hcc生物標(biāo)志物。凝血酶原有10個(gè)潛在的γ-羧化位點(diǎn)，并且循環(huán)中存在具有不同水平的未完全羧基化的各種形式的pivka-ii。用于pivka-ii的不同測定可以檢測不同的pivka-ii形式的集合，并且pivka-ii的特異性/靈敏度可能根據(jù)所使用的測定而變化，并且在檢測早期hcc中的效用有限。

15、迄今為止，國際指南對于使用afp-l3和pivka-ii或可替代的血清生物標(biāo)志物來監(jiān)測和診斷處于風(fēng)險(xiǎn)中的患者缺乏共識。然而，許多最近的出版物明確指出，包含輸入變量，即性別、年齡、afp和脫羧基凝血酶原(dcp＝pivka-ii)(＝gaad-分?jǐn)?shù))或性別、年齡、afp、afp-l3和脫羧基凝血酶原(dcp＝pivka-ii)(＝galad-score)的分?jǐn)?shù)可以并且將會(huì)改善hcc篩選工作的結(jié)果。

16、盡管如此，仍然非常需要進(jìn)一步改善輔助檢測hcc的體外方法。

17、令人驚訝的是，在觸珠蛋白上發(fā)現(xiàn)了具有高診斷價(jià)值(例如，在hcc的早期檢測中)的新的聚糖結(jié)構(gòu)。這些聚糖結(jié)構(gòu)與已建立的參考蛋白生物標(biāo)志物(例如，afp、pivka-ii)的組合甚至進(jìn)一步改善了它們的臨床效用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，對附接至觸珠蛋白的β-鏈的聚糖結(jié)構(gòu)的分析可以克服當(dāng)前輔助檢測hcc的體外診斷方法的一些問題。

2、特別地，本發(fā)明人已經(jīng)鑒定了觸珠蛋白的β-鏈的位置n184處(即seq?id?no:1的位置184中的氨基酸天冬酰胺處)的聚糖結(jié)構(gòu)，其是用于檢測hcc、還尤其是早期hcc的良好生物標(biāo)志物。

3、在第一方面，本發(fā)明涉及一種用于輔助檢測受試者的肝細(xì)胞癌(hcc)的體外方法，該方法包括以下步驟：a)確定獲自所述受試者的樣品中的觸珠蛋白的(即具有seq?id?no:1中給出的序列的觸珠蛋白的β-鏈的)位置n184處的一種或多種聚糖結(jié)構(gòu)的量，以及b)將a)中檢測的所述一種或多種聚糖結(jié)構(gòu)的量與所述一種或多種聚糖結(jié)構(gòu)的參考量進(jìn)行比較，其中相對于所述一種或多種聚糖結(jié)構(gòu)的參考量，所述患者樣品中所述一種或多種聚糖結(jié)構(gòu)的量改變指示hcc。

4、在一個(gè)具體的實(shí)施例中，附接至n184的一種或多種聚糖結(jié)構(gòu)是聚糖結(jié)構(gòu)hexnac(5)hex(6)fuc(1)neuac(2)。

5、在第二方面，本文提供了一種用于輔助檢測受試者的hcc(例如，早期hcc)的體外方法，該方法包括以下步驟：a)確定獲自所述受試者的樣品中的觸珠蛋白的(即具有seq?idno:1中給出的序列的觸珠蛋白的β-鏈的)位置n184處的n-聚糖結(jié)構(gòu)hexnac(5)hex(6)fuc(1)neuac(2)的量，以及b)(i)將a)中確定的所述n-聚糖結(jié)構(gòu)的量與所述n-聚糖結(jié)構(gòu)的參考量進(jìn)行比較，其中相對于這種n-聚糖結(jié)構(gòu)的參考量，所述受試者的樣品中觸珠蛋白的位置n184處的hexnac(5)hex(6)fuc(1)neuac(2)的量改變指示hcc(例如，早期hcc)；或者(ii)考慮a)中確定的觸珠蛋白的位置n184處的hexnac(5)hex(6)fuc(1)neuac(2)的量來確定用于檢測hcc(例如，早期hcc)的分?jǐn)?shù)，并且將經(jīng)確定的用于檢測hcc(例如，早期hcc)的分?jǐn)?shù)與指示hcc(例如，早期hcc)的針對所述分?jǐn)?shù)的參考值進(jìn)行比較。

6、在第三方面，本發(fā)明涉及一種經(jīng)分離的糖肽，其具有肽部分和n-聚糖部分，其中肽部分包含氨基酸序列mvshhnlttgatline(seq?id?no:2)或由該氨基酸序列組成，并且其中n-聚糖部分為hexnac(5)hex(6)fuc(1)neuac(2)，并且其中n-聚糖部分附接至seq?id?no:2的位置6中的n。在實(shí)施例中，seq?id?no:2的位置1中的甲硫氨酸可以被氧化。

7、在本公開的第三方面的一個(gè)具體的實(shí)施例中，本文提供了一種式1的糖肽：

8、

9、其中g(shù)lcnac意指n-乙酰葡萄糖胺，man意指甘露糖，gal意指半乳糖，fuc意指巖藻糖，并且neuac意指n-乙酰神經(jīng)氨酸(唾液酸)。線代表共價(jià)鍵。糖肽中的聚糖作為n-聚糖經(jīng)由指示的聚糖的glcnac共價(jià)附接至對應(yīng)于觸珠蛋白的n184的天冬酰胺側(cè)鏈。(即seq?idno:1的觸珠蛋白的β-鏈的n184)。在實(shí)施例中，seq?id?no:2的位置1中的甲硫氨酸可以被氧化。

10、這種糖肽所包含的肽具有seq?id?no:2所描述的氨基酸序列。具有與上式1所示結(jié)構(gòu)相同的結(jié)構(gòu)的糖肽的替代圖形表示如圖2右圖所示。

11、在第四方面，本發(fā)明涉及第三方面的糖肽(例如，式1的糖肽，參見上文)在檢測hcc中的用途。

12、根據(jù)本公開的第五方面，提供了一種用于檢測觸珠蛋白的(即具有seq?id?no:1中給出的序列的觸珠蛋白的β-鏈的)位置n184處的聚糖結(jié)構(gòu)的方法，該方法包括以下步驟：a)從待分析的樣品中純化觸珠蛋白；b)通過gluc和胰蛋白酶消化步驟a)中獲得的觸珠蛋白，以及c)檢測b)中生成的包含具有與其附接的聚糖結(jié)構(gòu)的觸珠蛋白的位置n184的糖肽，從而檢測位置n184處的聚糖結(jié)構(gòu)。

13、在第六方面，本公開涉及一種用于輔助檢測受試者的hcc(例如，早期hcc)的(體外)方法，該方法包括以下步驟：a)確定獲自所述受試者的樣品中的觸珠蛋白的(即具有seqid?no:1中給出的序列的觸珠蛋白的β-鏈的)位置n184處的n-聚糖結(jié)構(gòu)的量，b)確定獲自所述受試者的樣品中除了a)中位置n184處的n-聚糖結(jié)構(gòu)以外的hcc生物標(biāo)志物的量(例如，afp的量和/或pivka的量)，c)將a)和b)中確定的量組合成組合值(例如，用于檢測hcc如早期hcc的分?jǐn)?shù))，并且將組合值與針對所述組合值的參考值進(jìn)行比較，其中改變的組合值指示hcc(例如，早期hcc)。

14、在第七方面，本文提供了一種用于輔助檢測受試者的hcc(例如，早期hcc)的計(jì)算機(jī)實(shí)現(xiàn)方法，該方法包括：

15、a)接收包括獲自所述受試者的樣品中的觸珠蛋白的(即具有seq?id?no:1中給出的序列的觸珠蛋白的β-鏈的)位置n184處的聚糖結(jié)構(gòu)的量的數(shù)據(jù)；以及

16、b)i)將在a)中所接收的聚糖結(jié)構(gòu)的量與觸珠蛋白的位置n184處的所述n-聚糖結(jié)構(gòu)的參考量進(jìn)行比較，其中相對于所述一種或多種聚糖結(jié)構(gòu)的參考量，所述患者樣品中的n-聚糖結(jié)構(gòu)的量改變指示hcc；或者(ii)考慮在a)中所接收的觸珠蛋白的位置n184處的所述聚糖結(jié)構(gòu)的量來計(jì)算用于檢測hcc(例如，早期hcc)的分?jǐn)?shù)，并且將經(jīng)計(jì)算的用于檢測hcc(例如，早期hcc)的分?jǐn)?shù)與指示hcc(例如，早期hcc)的針對所述分?jǐn)?shù)的參考值進(jìn)行比較。

17、在第八方面，本文提供了一種用于輔助檢測受試者的hcc(例如，早期hcc)的計(jì)算機(jī)實(shí)現(xiàn)方法，該方法包括：

18、a)接收包括獲自所述受試者的樣品中的觸珠蛋白的(即具有seq?id?no:1中給出的序列的觸珠蛋白的β-鏈的)位置n184處的一種或多種聚糖結(jié)構(gòu)(例如，hexnac(5)hex(6)fuc(1)neuac(2))的量的數(shù)據(jù)

19、b)接收包括獲自所述受試者的樣品中的pivka-ii和/或afp的量的數(shù)據(jù)，

20、c)考慮a)和b)中確定的量來計(jì)算分?jǐn)?shù)，以及

21、d)將c)中計(jì)算的分?jǐn)?shù)與指示hcc(例如，早期hcc)的所述分?jǐn)?shù)的參考值進(jìn)行比較。

22、本文還提供了一種計(jì)算機(jī)程序產(chǎn)品，其包括指令，當(dāng)該程序由計(jì)算機(jī)執(zhí)行時(shí)，該指令使計(jì)算機(jī)進(jìn)行根據(jù)第七或第八方面的計(jì)算機(jī)實(shí)現(xiàn)方法。

23、此外，提供了一種計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)，其包括指令，當(dāng)由計(jì)算機(jī)執(zhí)行時(shí)，該指令使計(jì)算機(jī)進(jìn)行根據(jù)第七或第八方面的計(jì)算機(jī)實(shí)現(xiàn)方法。

24、還提供了一種數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，其包括：接收單元，其配置為接收第七或第八方面中定義的數(shù)據(jù)；以及處理單元，其配置為進(jìn)行第七或第八方面中的計(jì)算和/或比較步驟和/或任一確定/評定步驟；以及任選地，輸出單元，其配置為輸出評定結(jié)果。