本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)檢測技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種唾液中分泌型免疫球蛋白的檢測方法。

背景技術(shù)：

疲勞,是勞動過程中勞動者由于生理和心理狀態(tài)的變化，產(chǎn)生某一個或某些器官乃至整個機體力量的自然衰竭狀態(tài)。疲勞是一種生理現(xiàn)象，也是一種心理現(xiàn)象，從本質(zhì)上講是機體的一種正常生理保護(hù)機制。從生物醫(yī)學(xué)理論上講，勞動是能量消耗的過程，這個過程持續(xù)到一定程度，中樞神經(jīng)系統(tǒng)將產(chǎn)生抑制作用，繼中樞神經(jīng)系統(tǒng)疲勞后，就是反射運動神經(jīng)系統(tǒng)的疲勞，反映出動作的靈敏性降低，作業(yè)效率下降。疲勞發(fā)生的原因較多，由過多運動、長時間連續(xù)工作、精神緊張、睡眠剝奪、視覺疲勞及其它疾病因素導(dǎo)致。疲勞發(fā)生后，人體在生理、生化和代謝方面都存在一些共性改變，尤其是在部隊軍事訓(xùn)練中，疲勞不僅會影響到訓(xùn)練成績的提高，過度的疲勞還會損害機體的肌肉系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)等多種系統(tǒng)，導(dǎo)致食欲降低、體重下降、睡眠障礙等癥狀。在日常訓(xùn)練中，持續(xù)長時間大強度的訓(xùn)練使得機體難以承受，最終對機體造成嚴(yán)重?fù)p傷。

分泌型免疫球蛋白siga是機體黏膜免疫系統(tǒng)的主要成分，唾液siga在上呼吸道黏膜免疫中起著至關(guān)重要的作用，它能抑制微生物在上呼吸道上皮附著，減緩病毒繁殖，防止病原體入侵，是黏膜免疫狀況的一個標(biāo)志。耐力性競賽會引起唾液siga水平下降，tomasi等最先報道了運動與唾液siga的相關(guān)研究，結(jié)果顯示滑雪運動員在歷時2h～3h的20km～50km比賽后，唾液siga濃度下降40％；nieman等對93名受試者的研究也顯示，馬拉松賽后唾液siga濃度和唾液siga分泌率均顯著下降。此外，實驗室有關(guān)研究還得到了基本一致結(jié)果：訓(xùn)練有素的男女長跑運動員進(jìn)行90min的55％vo2max和75％vo2max跑步運動后，唾液siga分泌率下降了20％-50％。多數(shù)實驗性研究顯示，短時間大強度力竭運動后，人體唾液siga水平會出現(xiàn)不同程度的下降。因此可以根據(jù)唾液中的分泌型免疫球蛋白濃度變化來判斷人體的疲勞程度，這必然涉及到唾液中分泌型免疫球蛋白的檢測。

目前，測定唾液中的分泌型免疫球蛋白常用方法有放射免疫法和單相瓊脂擴散法。放射免疫法快速、靈敏度高，但成本較高；單相瓊脂擴散法比較簡單，但影響因素較多，重復(fù)性差，耗時較長。透色比濁法可用于血中免疫球蛋白的測定，但由于唾液中免疫球蛋白的含量較少，測定難度較大，目前鮮有相關(guān)報道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明的目的是提供一種唾液中分泌型免疫球蛋白的檢測方法，操作方便，具有較高的精確度，采用了改性后的聚丙烯膜作為微濾膜對唾液樣品進(jìn)行處理，提高了唾液中分泌型免疫球蛋白檢測的準(zhǔn)確度和靈敏性。

本發(fā)明通過以下技術(shù)手段解決上述技術(shù)問題：

一種唾液中分泌型免疫球蛋白的檢測方法，包括以下步驟：

抗體應(yīng)用液配置：稱取40g聚乙二醇、0.8g聚山梨酯溶于1l去離子水中，攪拌混勻得到應(yīng)用液，將羊抗人免疫球蛋白血清與應(yīng)用液按體積比18:1混合，攪拌均勻得到抗體應(yīng)用液。

標(biāo)樣檢測：于干凈試管中加入標(biāo)準(zhǔn)血清，用生理鹽水稀釋至50μl，再加入抗體應(yīng)用液1ml，混勻，置于38℃的熱水中水浴10min后，以生理鹽水作參比通過分光光度計測定標(biāo)準(zhǔn)血清的吸光度。

樣品采集：采集自然流出的清亮唾液，保存于溫度為-30℃～-20℃的環(huán)境中

樣品處理：將采集的唾液通過離心機冷凍離心后，取上清液通過微濾膜過濾，所述微濾膜的平均孔徑為5μm～20μm,得到的濾液即待測樣品。

樣品檢測：取50μl待測樣品并加入1ml抗體應(yīng)用液，混勻，置于38℃的熱水中水浴10min后，以生理鹽水作參比通過分光光度計測定樣品的吸光度。

進(jìn)一步，所述樣品處理步驟中的唾液冷凍離心是在1℃～4℃、4000r/min～5000r/min的條件下離心6min～9min。

進(jìn)一步，所述標(biāo)樣檢測和樣品檢測的檢測波長均為350nm。

進(jìn)一步，所述微濾膜為聚丙烯中空纖維膜接枝聚丙烯酸制得。

進(jìn)一步，所述聚丙烯中空纖維膜接枝聚丙烯酸的接枝率為10％～16％。

進(jìn)一步，所述微濾膜的制備方法如下：將聚丙烯中空纖維膜用乙醇清洗后，干燥，放入質(zhì)量濃度為15％～35％的納米二氧化鈦溶液中置于超聲容器中超聲5min后取出，烘干，再次放入納米二氧化鈦溶液中浸泡10min后，取出，于60℃～70℃的烘箱中烘干，再浸入丙烯酸和乙醇的混合水溶液中，放入石英盤內(nèi)，置于紫外燈下，通入氮氣，于室溫下紫外光輻照30min后，取出洗滌，真空干燥即得到微濾膜。

進(jìn)一步，所述超聲波的超聲參數(shù)為頻率18khz～26khz，功率為100w。

進(jìn)一步，所述微濾膜的制備方法中紫外光輻照后，先用65℃～75℃純水反復(fù)洗滌，再用乙醇洗滌浸泡20h。

進(jìn)一步，所述聚丙烯中空纖維膜的制備方法如下：

將熔融指數(shù)為0.33g/10min～0.38g/10min的均聚聚丙烯經(jīng)紡絲機進(jìn)行紡絲、冷卻、卷繞成膜絲，將膜絲進(jìn)行熱拉伸致孔后，于115℃～125℃熱處理45min～65min得到纖維膜，將纖維膜用無水乙醇浸泡10h～16h，取出于110℃～125℃熱定型50min～58min,得到聚丙烯中空纖維膜。

進(jìn)一步，所述聚丙烯中空纖維膜的制備方法中熱拉伸致孔的熱拉伸比為45％～65％，熱拉伸溫度為110℃～120℃。

本發(fā)明唾液中分泌型免疫球蛋白檢測方法的原理是，利用唾液中的分泌型免疫球蛋白抗原和羊抗人血清抗體的特異性結(jié)合形成復(fù)合物，在增強劑聚乙二醇的作用下，降低復(fù)合物的溶解度，促進(jìn)復(fù)合物的合成，通過測定復(fù)合物形成量的多少對抗原或抗體進(jìn)行定量的方法。其復(fù)合物為渾濁顆粒，可用分光光度計測量，其原理是當(dāng)光線通過一個渾濁介質(zhì)溶液時，由于溶液中存在渾濁顆粒，光線會被吸收一部分，吸收的多少與渾濁顆粒的量成正比，而渾濁顆粒的量與抗原含量呈正比，與同樣條件下的標(biāo)準(zhǔn)物比較，即可算出樣品中抗原物質(zhì)分泌型免疫球蛋白的含量。

本發(fā)明的唾液中分泌型免疫球蛋白檢測方法中對樣品的處理采用了微濾膜過濾，這樣可以將經(jīng)過冷凍離心后的上清液中的懸浮物截留在微濾膜上，避免對檢測結(jié)果造成干擾，使得檢測結(jié)果誤差較大。本發(fā)明使用的微濾膜是由聚丙烯中空纖維膜接枝聚丙烯酸制得，二氧化鈦作為光敏劑，在紫外光的照射下，可以提高聚丙烯中空纖維膜的降解性，增加孔隙率，便于控制聚丙烯酸的接枝，從而提高了微濾膜的親水性和通量，在微濾膜的作用下，實現(xiàn)上清液與上清液中的微小懸浮物的分離，同時分泌型免疫球蛋白能夠順利通過微濾膜保留在上清液中以便測量。

本發(fā)明的唾液中分泌型免疫球蛋白檢測方法操作方便，具有較高的精確度，采用了改性后的聚丙烯膜作為微濾膜對唾液樣品進(jìn)行處理，提高了唾液中分泌型免疫球蛋白檢測的準(zhǔn)確度和靈敏性。檢測方法快捷，效率較高。

具體實施方式

以下將結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明：

聚丙烯中空纖維膜制備實施例一

取熔融指數(shù)為0.33g/10min～0.38g/10min的均聚聚丙烯通過紡絲機進(jìn)行紡絲，紡絲溫度為180℃，以氮氣作為成腔流體，氮氣的流速為0.04l/min，紡絲后采用水冷冷卻降溫，卷繞成膜絲，將膜絲進(jìn)行熱拉伸致孔，熱拉伸的溫度為110℃，熱拉伸比為45％，熱拉伸完成后于125℃熱處理45min得到纖維膜，將纖維膜用無水乙醇浸泡16h，取出于110℃熱定型58min,得到聚丙烯中空纖維膜。

聚丙烯中空纖維膜制備實施例二

取熔融指數(shù)為0.33g/10min～0.38g/10min的均聚聚丙烯通過紡絲機進(jìn)行紡絲，紡絲溫度為188℃，以氮氣作為成腔流體，氮氣的流速為0.05l/min，紡絲后采用風(fēng)冷冷卻降溫，卷繞成膜絲，將膜絲進(jìn)行熱拉伸致孔，熱拉伸的溫度為120℃，熱拉伸比為65％，熱拉伸完成后于115℃熱處理65min得到纖維膜，將纖維膜用無水乙醇浸泡10h，取出于125℃熱定型50min,得到聚丙烯中空纖維膜。

聚丙烯中空纖維膜制備實施例三

取熔融指數(shù)為0.33g/10min～0.38g/10min的均聚聚丙烯通過紡絲機進(jìn)行紡絲，紡絲溫度為193℃，以氮氣作為成腔流體，氮氣的流速為0.06l/min，紡絲后采用風(fēng)冷冷卻降溫，卷繞成膜絲，將膜絲進(jìn)行熱拉伸致孔，熱拉伸的溫度為116℃，熱拉伸比為55％，熱拉伸完成后于120℃熱處理55min得到纖維膜，將纖維膜用無水乙醇浸泡14h，取出于120℃熱定型55min,得到聚丙烯中空纖維膜。

微濾膜制備實施例四

稱取100g實施例一制備得到的聚丙烯中空纖維膜用無水乙醇清洗后，自然風(fēng)干，浸入質(zhì)量濃度為5％的納米二氧化鈦溶液中置于超聲容器中，于頻率18khz，功率100w的條件下超聲5min后取出，烘干，再次放入質(zhì)量濃度為5％的納米二氧化鈦溶液中浸泡10min后，取出，于60℃的烘箱中烘干，然后浸入丙烯酸和乙醇的混合水溶液中，放入石英盤內(nèi)，于紫外燈下，通入氮氣，室溫下紫外光輻照30min后，取出先用65℃純水反復(fù)洗滌，再用乙醇洗滌浸泡20h，真空干燥，稱量得到110g微濾膜。

聚丙烯中空纖維膜接枝聚丙烯酸的接枝率的計算公式為：接枝率＝(接枝后微濾膜的質(zhì)量-聚丙烯中空纖維膜初始質(zhì)量)×100/聚丙烯中空纖維膜初始質(zhì)量，由此計算得出本實施例的接枝率為10％。采用氣體吸附法測定本實施例的微濾膜的平均孔徑為20μm。

微濾膜制備實施例五

稱取100g實施例二制備得到的聚丙烯中空纖維膜用無水乙醇清洗后，自然風(fēng)干，浸入質(zhì)量濃度為15％的納米二氧化鈦溶液中置于超聲容器中，于頻率22khz，功率100w的條件下超聲5min后取出，烘干，再次放入質(zhì)量濃度為15％的納米二氧化鈦溶液中浸泡10min后，取出，于65℃的烘箱中烘干，然后浸入丙烯酸和乙醇的混合水溶液中，放入石英盤內(nèi)，于紫外燈下，通入氮氣，室溫下紫外光輻照30min后，先用70℃純水反復(fù)洗滌，再用乙醇洗滌浸泡20h，真空干燥，稱量得到116g微濾膜。

聚丙烯中空纖維膜接枝聚丙烯酸的接枝率的計算公式為：接枝率＝(接枝后微濾膜的質(zhì)量-聚丙烯中空纖維膜初始質(zhì)量)×100/聚丙烯中空纖維膜初始質(zhì)量，由此計算得出本實施例的接枝率為16％。采用氣體吸附法測定本實施例的微濾膜的平均孔徑為5μm。

微濾膜制備實施例六

稱取100g實施例三制備得到的聚丙烯中空纖維膜用無水乙醇清洗后，自然風(fēng)干，浸入質(zhì)量濃度為10％的納米二氧化鈦溶液中置于超聲容器中，于頻率26khz，功率100w的條件下超聲5min后取出，烘干，再次放入質(zhì)量濃度為10％的納米二氧化鈦溶液中浸泡10min后，取出，于70℃的烘箱中烘干，然后浸入丙烯酸和乙醇的混合水溶液中，放入石英盤內(nèi)，于紫外燈下，通入氮氣，室溫下紫外光輻照30min后，先用75℃純水反復(fù)洗滌，再用乙醇洗滌浸泡20h，真空干燥，稱量得到113g微濾膜。

聚丙烯中空纖維膜接枝聚丙烯酸的接枝率的計算公式為：接枝率＝(接枝后微濾膜的質(zhì)量-聚丙烯中空纖維膜初始質(zhì)量)×100/聚丙烯中空纖維膜初始質(zhì)量，由此計算得出本實施例的接枝率為13％。采用氣體吸附法測定本實施例的微濾膜的平均孔徑為10μm。

唾液中分泌型免疫球蛋白檢測前，需要先配置抗體應(yīng)用液，稱取40g聚乙二醇、0.8g聚山梨酯溶于1l去離子水中，攪拌混勻得到應(yīng)用液，將羊抗人免疫球蛋白血清與應(yīng)用液按體積比18:1混合，攪拌均勻得到抗體應(yīng)用液。

實施例四、五、六中使用的二氧化鈦的晶型結(jié)構(gòu)為單晶花狀結(jié)構(gòu)，具有透氣性和較大的比表面積。該二氧化鈦的制備方法如下，將37％的濃鹽酸和無水乙醇按照3:20的體積比進(jìn)行攪拌混勻，稱取聚環(huán)氧乙烷-聚環(huán)氧丙烷-聚環(huán)氧乙烷三嵌段共聚物稀釋于濃鹽酸和無水乙醇的混合溶液中，于頻率22khz、功率180w、常溫下超聲15min,再攪拌2h后，向其加入鈦酸四丁酯和四氯化鈦，于頻率25khz、功率180w、常溫下超聲15min,再攪拌20h后，于75℃的水浴鍋中靜置晶化10h后，降溫至常溫，過濾得到的濾渣用乙醇經(jīng)過5次回流清洗后，烘干粉碎，轉(zhuǎn)入至馬弗爐中，以每分鐘8℃的升溫速度升溫至450℃煅燒2h，取出得到納米二氧化鈦。將制得的納米二氧化鈦經(jīng)過透射電子顯微鏡掃描，發(fā)現(xiàn)該納米二氧化鈦的晶型結(jié)構(gòu)為由片狀折疊重合的單晶花狀結(jié)構(gòu)。

為了能夠計算出唾液樣品中分泌型免疫球蛋白的濃度，需要進(jìn)行標(biāo)樣檢測，分別在5個干凈試管中加入不同體積的標(biāo)準(zhǔn)血清，用生理鹽水稀釋至50μl，得到濃度分別為50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、400ng/ml、600ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)血清溶液，再加入抗體應(yīng)用液1ml，混勻，置于38℃的熱水中水浴10min后，以生理鹽水作參比通過分光光度計分別測定標(biāo)準(zhǔn)血清的吸光度。以濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制工作曲線作相關(guān)以及回歸處理，從而得到標(biāo)準(zhǔn)曲線y＝0.078x+19.45，其中，x代表樣品吸光度，y代表樣品濃度，ug/ml。

分泌型免疫球蛋白檢測實施例七

隨機抽取3個身體機能正常，身體健康的運動員記為運動員1、2、3，分別采集這些運動員運動0min、運動20min、運動40min、運動60min、運動80min分泌的清亮唾液為樣品，分別裝于不同采集瓶中密封，保存于溫度為-20℃的環(huán)境中冷凍1h后，將唾液通過離心機在4℃、4000r/min的條件下離心分離9min后，取上清液用實施例四制備得到的微濾膜進(jìn)行過濾，將上清液中的懸浮物截留在微濾膜表面，避免懸浮物對檢測結(jié)果造成干擾，過濾得到的濾液即待測樣品。取50μl待測樣品并加入1ml抗體應(yīng)用液，混勻，置于38℃的熱水中水浴10min后，以生理鹽水作參比通過分光光度計分別測定樣品的吸光度。將所測得的吸光度帶入公式y(tǒng)＝0.078x+19.45中便可以算出唾液樣品中的分泌型免疫球蛋白濃度。測定計算結(jié)果如下表：

分泌型免疫球蛋白檢測實施例八

隨機抽取3個身體機能正常，身體健康的運動員記為運動員1、2、3，分別采集這些運動員運動0min、運動20min、運動40min、運動60min、運動80min分泌的清亮唾液為樣品，分別裝于不同采集瓶中密封，保存于溫度為-20℃的環(huán)境中冷凍1h后，將唾液通過離心機在1℃、5000r/min的條件下離心分離6min后，取上清液用實施例五制備得到的微濾膜進(jìn)行過濾，將上清液中的懸浮物截留在微濾膜表面，避免懸浮物對檢測結(jié)果造成干擾，過濾得到的濾液即待測樣品。取50μl待測樣品并加入1ml抗體應(yīng)用液，混勻，置于38℃的熱水中水浴10min后，以生理鹽水作參比通過分光光度計分別測定樣品的吸光度。將所測得的吸光度帶入公式y(tǒng)＝0.078x+19.45中便可以算出唾液樣品中的分泌型免疫球蛋白濃度。測定計算結(jié)果如下表：

由以上數(shù)據(jù)可以得知，隨著運動時間的增加，唾液中的分泌型免疫球蛋白濃度呈現(xiàn)下降趨勢，因此，可以根據(jù)檢測唾液中分泌型免疫球蛋白來判斷疲勞程度。

本發(fā)明的唾液中分泌型免疫球蛋白檢測方法中對樣品的處理采用了微濾膜過濾，這樣可以將經(jīng)過冷凍離心后的上清液中的懸浮物截留在微濾膜上，避免對檢測結(jié)果造成干擾，使得檢測結(jié)果誤差較大。本發(fā)明使用的微濾膜是由聚丙烯中空纖維膜接枝聚丙烯酸制得，提高了微濾膜的親水性和通量，在微濾膜的作用下，實現(xiàn)上清液與上清液中的微小懸浮物的分離，同時分泌型免疫球蛋白能夠順利通過微濾膜保留在上清液中以便測量。

以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管參照較佳實施例對本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的宗旨和范圍，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍當(dāng)中。本發(fā)明未詳細(xì)描述的技術(shù)、形狀、構(gòu)造部分均為公知技術(shù)。