本發(fā)明涉及一種昆蟲呼吸器官的觀察方法，具體涉及一種采用顯微ct觀察昆蟲氣管立體結(jié)構(gòu)的方法。
背景技術(shù)：
昆蟲的呼吸系統(tǒng)是昆蟲重要的氣體交換器官，對昆蟲呼吸器官結(jié)構(gòu)的研究無論是從生物進(jìn)化角度還是從昆蟲防治角度來講都是至關(guān)重要的。目前，常用來研究昆蟲呼吸器官的方法有兩種，石蠟切片法和透射電鏡法。
石蠟切片法又稱細(xì)胞切片法，是觀察組織細(xì)胞最常用的方法，采用石蠟切片法能清晰地辨認(rèn)細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)，尤其是該方法能有針對性的染色，可以只對需要觀察的神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)行染色而將目標(biāo)組織與其他物質(zhì)區(qū)分開來。透射電鏡法是采用透射電子顯微鏡對昆蟲器官進(jìn)行觀察，它能直接觀察昆蟲器官的內(nèi)部超微結(jié)構(gòu)，可放大100~10000倍。
但是，上述兩種方法的制片過程較為繁瑣，且只能觀測單張平面圖像，對需要觀察的已知位置的結(jié)構(gòu)尚可，但對于未知結(jié)構(gòu)來說，單張切片內(nèi)容過于片面，無法全面的觀測和分析。由于昆蟲的呼吸器官結(jié)構(gòu)十分復(fù)雜，包括氣門、氣管、微氣管，使用上述任何方法均無法從結(jié)構(gòu)上予以立體、全面的觀察。
顯微ct（micro-ct)是一種較新的技術(shù)，其可在不破壞樣本的前提下清楚了解樣本的內(nèi)部顯微結(jié)構(gòu)，精度可達(dá)到微米級別。其特點(diǎn)是能拍攝出立體照片，能觀察整個昆蟲內(nèi)部各個截面的信息，并且可以對需要觀察的目標(biāo)結(jié)構(gòu)進(jìn)行2d和3d分析。
顯微ct在生物醫(yī)藥方面最早主要應(yīng)用于對骨骼、牙齒結(jié)構(gòu)的研究，從2005年開始，greco等人才將顯微ct技術(shù)應(yīng)用于蜂類卵巢的研究。而至今為止，尚未發(fā)現(xiàn)采用顯微ct技術(shù)研究昆蟲氣管立體結(jié)構(gòu)的報(bào)道。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的就是提供一種采用顯微ct觀察昆蟲氣管立體結(jié)構(gòu)的方法，以解決現(xiàn)有觀察方法操作繁瑣、觀察結(jié)果不夠全面的問題。
本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的，一種采用顯微ct觀察昆蟲氣管立體結(jié)構(gòu)的方法，包括以下步驟：a、樣本處理，在溫度為4℃的條件下使用固定液將目標(biāo)昆蟲的呼吸器官進(jìn)行組織固定；b、顯微ct觀察，利用顯微ct對處理好的樣本進(jìn)行觀察。
所述步驟a是先用5%戊二醛溶液對目標(biāo)昆蟲的呼吸器官浸泡固定或灌注固定48h，隨后使用0.2m的磷酸緩沖液清洗2h，清洗后再用1%四氧化鋨溶液浸泡固定1h，然后用蒸餾水清洗2h，最后使用濾紙將樣本表面液體吸干，并使用石蠟包埋。在整個處理過程溫度保持在4℃，且不能使用抽氣機(jī)進(jìn)行抽真空，防止氣管內(nèi)的氣體被抽出，而使液體進(jìn)入氣管中，影響后續(xù)觀察結(jié)果。
所述5%戊二醛溶液是使用0.2m的磷酸緩沖液將其ph值調(diào)至7.2~7.4后再對樣本進(jìn)行處理；所述1%四氧化鋨溶液是使用0.2m的磷酸緩沖液將其ph值調(diào)至7.2~7.4后再對樣本進(jìn)行處理。
所述目標(biāo)昆蟲的呼吸器官是光肩星天牛的下顎須或下唇須。
在進(jìn)行樣本處理之前，先將光肩星天牛放置在4℃環(huán)境中預(yù)冷4小時，隨后再將光肩星天牛的下顎須和/或下唇須從口器上取下。將光肩星天牛的下顎須和/或下唇須從口器上取下后應(yīng)迅速將其放入固定液中進(jìn)行組織固定，以避免其自然干燥。
所述步驟b是將處理好的樣本直接粘到樣品臺上觀察掃描，拍出的圖片經(jīng)nrecon軟件重構(gòu)，并以ctvox組成3d模式，并以ctan對圖像進(jìn)行測量和分析。
本發(fā)明方法應(yīng)用顯微ct對昆蟲的呼吸器官進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，建立呼吸器官的3d模型，可以同時獲得樣本的外部形貌和內(nèi)部細(xì)節(jié)特征，圖像分辨率高，建模重構(gòu)所獲3d模型空間視覺較好。而且本發(fā)明方法的樣本制作過程簡單，操作方便，儀器所占用空間較小，具有十分良好的推廣前景。
與傳統(tǒng)的組織切片技術(shù)相比，本發(fā)明具有明顯的優(yōu)勢，主要表現(xiàn)為以下幾方面：無組織損傷性，快速高效，同時可以觀測呼吸器官的三維特征，可以重建并觀察任意平面，可重復(fù)性強(qiáng)。
通過本發(fā)明方法能對昆蟲的基本結(jié)構(gòu)有一個從外到內(nèi)、從平面到立體的綜合認(rèn)識，本發(fā)明方法為全面觀察昆蟲內(nèi)部的呼吸系統(tǒng)結(jié)構(gòu)提供了重要依據(jù)和技術(shù)手段。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明，在以下實(shí)施例中，未詳細(xì)描述的各種過程和方法是本領(lǐng)域中公知的常規(guī)方法，所用試劑為市售分析純或化學(xué)純。
實(shí)施例1
觀察光肩星天牛下顎須內(nèi)部氣管的立體結(jié)構(gòu)。
固定液的配制：使用0.2m的磷酸緩沖液將5%戊二醛溶液的ph值調(diào)至7.2~7.4；使用0.2m的磷酸緩沖液將1%四氧化鋨溶液的ph值調(diào)至7.2~7.4。
預(yù)處理：將光肩星天牛放置在4℃環(huán)境中預(yù)冷4h后，用刀片迅速切下其下顎須。
固定液處理：將切下的下顎須迅速放入配制好的戊二醛溶液中浸泡固定48h，隨后使用0.2m的磷酸緩沖液清洗2h，清洗后再用配制好的四氧化鋨溶液浸泡固定1h，隨后使用蒸餾水清洗2h，最后使用濾紙將表面液體吸干，并使用石蠟包埋后，即可上機(jī)觀察。
顯微ct觀察：樣品處理好后，直接將其粘到樣品臺上觀察掃描，拍出的圖片經(jīng)nrecon軟件重構(gòu)，并以ctvox組成3d模式，并以ctan對圖像進(jìn)行測量和分析。
實(shí)施例2
觀察光肩星天牛下唇須內(nèi)部氣管的立體結(jié)構(gòu)。
固定液的配制：使用0.2m的磷酸緩沖液將5%戊二醛溶液的ph值調(diào)至7.2~7.4；使用0.2m的磷酸緩沖液將1%四氧化鋨溶液的ph值調(diào)至7.2~7.4。
預(yù)處理：將光肩星天牛放置在4℃環(huán)境中預(yù)冷4h后，用刀片迅速切下其下唇須。
固定液處理：采用配制好的戊二醛溶液對剛切下的下唇須連續(xù)灌注固定48h（可以連續(xù)灌注新鮮的戊二醛溶液，也可以通過蠕動泵對定量戊二醛溶液循環(huán)使用）；隨后使用0.2m的磷酸緩沖液清洗2h，清洗后再用配制好的四氧化鋨溶液浸泡固定1h，隨后使用蒸餾水清洗2h，最后使用濾紙將表面液體吸干，并使用石蠟包埋后，即可上機(jī)觀察。
顯微ct觀察：樣品處理好后，直接將其粘到樣品臺上觀察掃描，拍出的圖片經(jīng)nrecon軟件重構(gòu)，并以ctvox組成3d模式，并以ctan對圖像進(jìn)行測量和分析。