本發(fā)明涉及膜片鉗封接細(xì)胞捕捉領(lǐng)域，具體是一種顯微鏡下急性分離神經(jīng)細(xì)胞捕捉系統(tǒng)及方法。

背景技術(shù)：

膜片鉗技術(shù)是用特制的玻璃微吸管吸附于細(xì)胞表面，使之形成10～100吉?dú)W的密封，然后對(duì)該膜片實(shí)行電壓鉗位或電流鉗位，可測(cè)量因離子通道開(kāi)放而產(chǎn)生的膜電流或膜電位變化。通過(guò)膜片鉗系統(tǒng)觀測(cè)通道開(kāi)放和關(guān)閉導(dǎo)致的膜電流或膜電位變化，可分析它們與誘導(dǎo)通道開(kāi)放或關(guān)閉的電壓、電流、藥物等之間的關(guān)系。膜片鉗系統(tǒng)已被廣泛應(yīng)用于生理、藥理等研究工作，許多高校都配有該設(shè)備。但膜片鉗系統(tǒng)本身對(duì)細(xì)胞有較高的要求，特別是研究急性分離的神經(jīng)細(xì)胞時(shí)，分離的神經(jīng)細(xì)胞如表面不光滑、消化過(guò)度等都會(huì)導(dǎo)致這些細(xì)胞不符合封接條件，從而不能順利完成膜片鉗實(shí)驗(yàn)。由于一次急性分離的神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量多，還帶有許多雜質(zhì)，找尋符合封接條件的神經(jīng)細(xì)胞和封接細(xì)胞的過(guò)程又都必須在顯微鏡視野下進(jìn)行，研究人員往往要在顯微鏡下工作相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間，多數(shù)會(huì)出現(xiàn)頭暈、惡心等不良反應(yīng)，因此能夠自動(dòng)完成顯微鏡視野中尋找目標(biāo)細(xì)胞的裝置，可以大大節(jié)省膜片鉗實(shí)驗(yàn)中尋找符合封接條件細(xì)胞的時(shí)間和精力。

目前雖然已有對(duì)細(xì)胞圖像的自動(dòng)識(shí)別技術(shù)和可自動(dòng)移動(dòng)的膜片鉗系統(tǒng)顯微鏡載物臺(tái)，但主要針對(duì)的都是顯微鏡用于大批量產(chǎn)品的檢測(cè)，特別是細(xì)胞分類(lèi)和計(jì)數(shù)，不需要對(duì)細(xì)胞進(jìn)行精確識(shí)別和定位。而膜片鉗實(shí)驗(yàn)則需要精確捕捉符合封接條件的神經(jīng)細(xì)胞，將周?chē)须s質(zhì)的細(xì)胞，酶消化過(guò)度和消化不到位的細(xì)胞進(jìn)行剔除，這就對(duì)細(xì)胞圖像的識(shí)別提出了更高的要求。同時(shí)膜片鉗系統(tǒng)還要對(duì)捕捉的細(xì)胞進(jìn)行微操縱器操作下的封接，這就要求對(duì)捕捉到的細(xì)胞進(jìn)行精確定位，自動(dòng)移動(dòng)膜片鉗系統(tǒng)顯微鏡載物臺(tái)，使細(xì)胞移至顯微鏡中央視野中可封接的位置。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的提供一種可用于膜片鉗系統(tǒng)的顯微鏡下急性分離神經(jīng)細(xì)胞捕捉系統(tǒng)及方法，可自動(dòng)完成膜片鉗實(shí)驗(yàn)中尋找符合封接條件的神經(jīng)細(xì)胞這一過(guò)程，避免研究人員因要在顯微鏡下工作相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間而出現(xiàn)的頭暈、惡心等不良反應(yīng)，提高膜片鉗實(shí)驗(yàn)效率。

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明的采用的技術(shù)解決方案是：

一種顯微鏡下急性分離神經(jīng)細(xì)胞捕捉系統(tǒng)，包括顯微鏡電子目鏡、計(jì)算機(jī)、單片機(jī)、驅(qū)動(dòng)器、步進(jìn)電機(jī)和膜片鉗系統(tǒng)顯微鏡載物臺(tái)，

所述膜片鉗系統(tǒng)顯微鏡載物臺(tái)，位于所述顯微鏡電子目鏡下方，用于承載待研究的急性分離神經(jīng)細(xì)胞；

所述顯微鏡電子目鏡，與計(jì)算機(jī)連接，用于獲取顯微鏡下細(xì)胞圖像，并將獲取的細(xì)胞圖像傳送至計(jì)算機(jī)；

所述計(jì)算機(jī)與單片機(jī)連接，用于對(duì)細(xì)胞圖像進(jìn)行處理得到單像素圖像，識(shí)別和精確定位細(xì)胞，找出符合封接條件的急性分離的神經(jīng)細(xì)胞，并獲取其坐標(biāo)值，然后將坐標(biāo)值傳輸給單片機(jī)；

所述單片機(jī)與驅(qū)動(dòng)器連接，用于根據(jù)獲得的坐標(biāo)值控制驅(qū)動(dòng)器驅(qū)動(dòng)步進(jìn)電機(jī)，使步進(jìn)電機(jī)帶動(dòng)膜片鉗系統(tǒng)顯微鏡載物臺(tái)移動(dòng)，將細(xì)胞移動(dòng)到顯微鏡的視野中。

進(jìn)一步的，所述電子目鏡采用cmos型圖像傳感器。

進(jìn)一步的，所述步進(jìn)電機(jī)包括橫向步進(jìn)電機(jī)和縱向步進(jìn)電機(jī)，為兩相四線的雙相步進(jìn)電機(jī)。

進(jìn)一步的，所述計(jì)算機(jī)對(duì)細(xì)胞圖像進(jìn)行處理得到單像素圖像具體過(guò)程為：

將細(xì)胞圖像轉(zhuǎn)換成計(jì)算機(jī)視覺(jué)圖像，對(duì)計(jì)算機(jī)視覺(jué)圖像進(jìn)行灰度處理，將彩色圖像轉(zhuǎn)換成灰度圖像；

將灰度圖像進(jìn)行閾值分割，得到對(duì)應(yīng)的二值化圖像，接著進(jìn)行高斯模糊處理和再次閾值分割，之后再進(jìn)行孔洞填充處理，得到輪廓完整且細(xì)胞與背景分割的單像素圖像。

進(jìn)一步的，所述識(shí)別和精確定位細(xì)胞，找出符合封接條件的急性分離的神經(jīng)細(xì)胞具體過(guò)程為：

對(duì)所述單像素圖像使用canny算子進(jìn)行邊緣檢測(cè)，提取出細(xì)胞的邊緣像素點(diǎn)；

利用細(xì)胞形態(tài)與橢圓的相似性，使用red算法從提取的邊緣像素點(diǎn)中識(shí)別可能的橢圓，通過(guò)對(duì)橢圓點(diǎn)收集來(lái)判斷是否為真實(shí)的橢圓，如果判斷結(jié)果為是即捕捉到符合封接條件的急性分離的神經(jīng)細(xì)胞。

一種顯微鏡下急性分離神經(jīng)細(xì)胞捕捉方法，其特征在于其采用上述系統(tǒng)進(jìn)行，所述方法包括如下步驟：

步驟一、電子目鏡獲取顯微鏡鏡下細(xì)胞圖像，并將獲取的細(xì)胞圖像傳送至計(jì)算機(jī)；

步驟二、所述計(jì)算機(jī)對(duì)細(xì)胞圖像進(jìn)行處理得到單像素圖像，識(shí)別和精確定位細(xì)胞，找出符合封接條件的急性分離的神經(jīng)細(xì)胞，并獲取其坐標(biāo)值，然后將坐標(biāo)值傳輸給單片機(jī)；

步驟三、所述單片機(jī)根據(jù)獲得的坐標(biāo)值控制驅(qū)動(dòng)器驅(qū)動(dòng)步進(jìn)電機(jī)，使步進(jìn)電機(jī)帶動(dòng)膜片鉗系統(tǒng)顯微鏡載物臺(tái)移動(dòng)，將細(xì)胞移動(dòng)到顯微鏡的視野中。

進(jìn)一步的，所述計(jì)算機(jī)對(duì)細(xì)胞圖像進(jìn)行處理具體過(guò)程為：

將細(xì)胞圖像轉(zhuǎn)換成計(jì)算機(jī)視覺(jué)圖像，對(duì)計(jì)算機(jī)視覺(jué)圖像進(jìn)行灰度處理，將彩色圖像轉(zhuǎn)換成灰度圖像；

將灰度圖像進(jìn)行閾值分割，得到對(duì)應(yīng)的二值化圖像，接著進(jìn)行高斯模糊處理和再次閾值分割，之后再進(jìn)行孔洞填充處理，得到輪廓完整且細(xì)胞與背景分割的單像素圖像。

進(jìn)一步的，所述識(shí)別和精確定位細(xì)胞，找出符合封接條件的急性分離的神經(jīng)細(xì)胞具體過(guò)程為：

對(duì)所述單像素圖像使用canny算子進(jìn)行邊緣檢測(cè)，提取出細(xì)胞的邊緣像素點(diǎn)；

利用細(xì)胞形態(tài)與橢圓的相似性，使用red算法從提取的邊緣像素點(diǎn)中識(shí)別可能的橢圓；

通過(guò)對(duì)橢圓點(diǎn)收集來(lái)判斷是否為真實(shí)的橢圓，如果判斷結(jié)果為是即捕捉到符合封接條件的急性分離的神經(jīng)細(xì)胞。

進(jìn)一步的，將灰度圖像進(jìn)行閾值分割，得到對(duì)應(yīng)的二值化圖像，接著進(jìn)行高斯模糊處理和再次閾值分割，之后再進(jìn)行孔洞填充處理，得到輪廓完整且細(xì)胞與背景分割的單像素圖像具體為：

利用公式(1)對(duì)灰度圖像進(jìn)行閾值分割，得到對(duì)應(yīng)的二值化圖像，這樣基本上去除了灰度圖像中背景的灰度信息，變?yōu)榘咨尘埃?/p>

f(x,y)表示原圖像在像素點(diǎn)(x,y)處的灰度值，f1(x,y)表示處理后的圖像在像素點(diǎn)(x,y)處的灰度值，th1是閾值；

然后利用公式(2)的高斯函數(shù)產(chǎn)生模版，再利用該模版與獲得的二值化圖像進(jìn)行卷積運(yùn)算，即高斯模糊處理；

其中σ表示標(biāo)準(zhǔn)差，g(x,y)表示模版在點(diǎn)(x,y)的值；

之后利用公式(3)對(duì)高斯模糊處理后的圖像再次進(jìn)行閾值分割；

f(x,y)表示原圖像在像素點(diǎn)(x,y)處的灰度值，f2(x,y)表示處理后的圖像在像素點(diǎn)(x,y)處的灰度值，th2是閾值；

最后對(duì)圖像中的孔洞部分進(jìn)行填充處理：設(shè)二值化的圖像含有的目標(biāo)區(qū)域的邊界值為1，非邊界為0，邊界點(diǎn)集記為a，從邊界內(nèi)的一點(diǎn)p開(kāi)始，令x0＝p＝1，用公式(4)進(jìn)行迭代來(lái)填充孔洞區(qū)域，迭代至xk＝xk-1為止，式中b為填充的結(jié)構(gòu)單元，k為迭代的次數(shù)，

孔洞填充完成后，得到較完整的細(xì)胞與背景分割的單像素圖像。

進(jìn)一步的，對(duì)所述單像素圖像使用canny算子進(jìn)行邊緣檢測(cè)，提取出細(xì)胞的邊緣像素點(diǎn)具體步驟為：(1)對(duì)單像素圖像使用帶有指定標(biāo)準(zhǔn)偏差的σ高斯濾波來(lái)進(jìn)行平滑，從而減少噪聲；

(2)計(jì)算圖像中的每一像素點(diǎn)的局部梯度，根據(jù)將該像素點(diǎn)的梯度幅度值判定該像素點(diǎn)是否為邊緣點(diǎn)；

其中梯度的幅度

梯度的方向角度

g(x,y)表示梯度的幅度，α(x,y)表示梯度的方向角度，gx表示x方向的梯度幅度，gy表示y方向的梯度幅度，根據(jù)將該像素點(diǎn)的梯度幅度值與其相鄰像素點(diǎn)的所有模值(兩像素點(diǎn)的距離)比較，若梯度幅度值是最大值，該判定該像素點(diǎn)為邊緣點(diǎn)，否則該像素點(diǎn)不是邊緣點(diǎn)；

使用red算法從提取的邊緣像素點(diǎn)中識(shí)別可能的橢圓具體為：

從邊緣點(diǎn)集d中，隨機(jī)的取出6個(gè)不共線的點(diǎn)，并且把它們存入到一個(gè)數(shù)組p中，然后取出p中的5個(gè)點(diǎn)(pi＝(xi,yi)，i＝1，2，3，4，5)，代入公式(5)得出公式(6)：

ax²+bxy+cy²+dx+ey+1＝0(5)

解出方程組公式(6)，即可求出曲線參數(shù)(a，b，c，d，e)的值，當(dāng)且僅當(dāng)b²-4ac<0時(shí)，解出的二次曲線為橢圓，并記作q1-5，然后將求出的q1-5參數(shù)與沒(méi)有使用的第6個(gè)邊緣像素點(diǎn)p6，一起代入到公式(5)得出公式(7)：

公式(7)求出的是p6點(diǎn)到橢圓q1-5的距離的絕對(duì)值，其結(jié)果用d6表示，當(dāng)p6點(diǎn)在橢圓q1-5上時(shí)，公式(7)中d6的值應(yīng)為0，此時(shí)認(rèn)為該橢圓是可能的橢圓并記為qp；

通過(guò)對(duì)橢圓點(diǎn)收集來(lái)判斷是否為真實(shí)的橢圓具體為：首先，將計(jì)數(shù)器清零，使用計(jì)數(shù)器統(tǒng)計(jì)位于橢圓上的邊緣點(diǎn)的個(gè)數(shù)，然后查找邊緣點(diǎn)集中的所有點(diǎn)，并計(jì)算出這些點(diǎn)到可能橢圓的距離，若求得的距離比設(shè)定的閾值小，將計(jì)數(shù)器加1，并在可能橢圓的邊緣點(diǎn)集中加入這個(gè)點(diǎn)，同時(shí)將它從邊緣點(diǎn)集d中去除；反之則繼續(xù)遍歷d中的下一個(gè)點(diǎn)，直到d中的點(diǎn)全部檢測(cè)完，這時(shí)統(tǒng)計(jì)可能橢圓的邊緣點(diǎn)集中的點(diǎn)的個(gè)數(shù)，若并高于預(yù)設(shè)的閾值，則判定檢測(cè)到的橢圓是一個(gè)真實(shí)的橢圓，反之則將邊緣點(diǎn)集中的點(diǎn)返回到邊緣點(diǎn)集中，再重新進(jìn)行檢測(cè)。

本發(fā)明通過(guò)對(duì)電子目鏡獲取的顯微鏡鏡下圖像進(jìn)行形狀識(shí)別，找出符合封接條件的神經(jīng)細(xì)胞，再驅(qū)動(dòng)步進(jìn)電機(jī)帶動(dòng)膜片鉗系統(tǒng)顯微鏡載物臺(tái)，將細(xì)胞移動(dòng)到顯微鏡的視野中央，自動(dòng)完成膜片鉗實(shí)驗(yàn)中耗費(fèi)大量時(shí)間和精力尋找符合封接條件的神經(jīng)細(xì)胞這一過(guò)程，避免研究人員因要在顯微鏡下工作相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間而出現(xiàn)的頭暈、惡心等不良反應(yīng)，提高膜片鉗實(shí)驗(yàn)效率。

本發(fā)明可用于膜片鉗系統(tǒng)的顯微鏡下急性分離神經(jīng)細(xì)胞捕捉系統(tǒng)，可用于急性分離的神經(jīng)細(xì)胞膜片鉗實(shí)驗(yàn)符合封接條件的目標(biāo)細(xì)胞捕捉，其結(jié)合不同種類(lèi)的細(xì)胞識(shí)別系統(tǒng)，如培養(yǎng)的三角錐形神經(jīng)細(xì)胞、急性分離的短柱狀心肌細(xì)胞和長(zhǎng)條形骨骼肌細(xì)胞等，可應(yīng)用于不同細(xì)胞電生理檢測(cè)的膜片鉗實(shí)驗(yàn)，實(shí)現(xiàn)符合膜片鉗封接條件的目標(biāo)細(xì)胞自動(dòng)獲取。

附圖說(shuō)明

圖1是本發(fā)明顯微鏡下急性分離神經(jīng)細(xì)胞捕捉系統(tǒng)其中一個(gè)實(shí)施例的結(jié)構(gòu)示意圖；

圖2是本發(fā)明細(xì)胞圖像處理流程圖；

圖3是本發(fā)明red算法基本流程圖；

圖4是本發(fā)明捕捉到的符合封接要求的細(xì)胞圖像。

圖中：1—顯微鏡電子目鏡；2—計(jì)算機(jī)；3—單片機(jī)；4—驅(qū)動(dòng)器；5—橫向步進(jìn)電機(jī)；6—縱向步進(jìn)電機(jī)；7—膜片鉗系統(tǒng)顯微鏡載物臺(tái)。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合本發(fā)明中的附圖，對(duì)本發(fā)明中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述。

圖1所示為本發(fā)明顯微鏡下急性分離神經(jīng)細(xì)胞捕捉系統(tǒng)其中一個(gè)實(shí)施例的結(jié)構(gòu)示意圖，所述系統(tǒng)包括顯微鏡電子目鏡1、計(jì)算機(jī)2、單片機(jī)3、驅(qū)動(dòng)器4、步進(jìn)電機(jī)和膜片鉗系統(tǒng)顯微鏡載物臺(tái)7，其中步進(jìn)電機(jī)包括橫向步進(jìn)電機(jī)5和縱向步進(jìn)電機(jī)6。

所述膜片鉗系統(tǒng)顯微鏡載物臺(tái)7位于所述顯微鏡電子目鏡1下方，用于承載待研究的急性分離神經(jīng)細(xì)胞；

所述顯微鏡電子目鏡1與計(jì)算機(jī)2連接，用于獲取顯微鏡下細(xì)胞圖像，并將獲取的細(xì)胞圖像傳送至計(jì)算機(jī)2。本發(fā)明中電子目鏡1可采用cmos型圖像傳感器，在電池壽命和低成本上具有較大優(yōu)勢(shì)，且具有操作簡(jiǎn)單、價(jià)格低廉、方便安裝等特點(diǎn)。通過(guò)usb線纜，可將顯微鏡下的光信號(hào)轉(zhuǎn)換成電信號(hào)(形成能方便處理的數(shù)字圖像)實(shí)時(shí)傳輸至計(jì)算機(jī)2進(jìn)行顯示。

所述計(jì)算機(jī)2與單片機(jī)3連接，用于對(duì)細(xì)胞圖像進(jìn)行處理后識(shí)別和精確定位細(xì)胞，找出符合封接條件的急性分離的神經(jīng)細(xì)胞，并獲取其坐標(biāo)值，然后將坐標(biāo)值傳輸給單片機(jī)3。

本發(fā)明采取抓幀的方式來(lái)進(jìn)行細(xì)胞圖像的分析。通過(guò)編寫(xiě)mfc上的控件，調(diào)用函數(shù)cvcreatecameracapture()來(lái)獲取電子目鏡1上的實(shí)時(shí)數(shù)據(jù)，并根據(jù)需要對(duì)控件進(jìn)行操作，從視頻流中獲取需要的某一幀或者某幾幀，并把每一幀數(shù)據(jù)寫(xiě)入到一張圖像中，方便后面對(duì)圖像進(jìn)行處理和分析，同時(shí)也方便后期的檢查和處理。

其中對(duì)細(xì)胞圖像進(jìn)行處理的流程如圖2所示，包括如下步驟：

1、將細(xì)胞圖像轉(zhuǎn)換成計(jì)算機(jī)視覺(jué)圖像，對(duì)計(jì)算機(jī)視覺(jué)圖像進(jìn)行灰度處理，可避免彩色圖像干擾。在本實(shí)施例中采用的是bmp格式的圖像，它由r(紅)、g(綠)、b(藍(lán))3個(gè)分量組成的。將彩色圖像轉(zhuǎn)換成灰度圖像，采用顏色編碼(yuv)的方法來(lái)進(jìn)行，其中“y”表示的是明亮度(luminance)，也就是灰階值，在只需要進(jìn)行灰度表示時(shí)，一幅灰度圖用y分量就能表示出來(lái)。從rgb到y(tǒng)uv空間的y轉(zhuǎn)換公式如下：

y＝0.299r+0.587g+0.114b

通過(guò)此公式可以直接把包含r、g、b三個(gè)分量的彩色圖像轉(zhuǎn)換成只包含亮度信息的圖像。

2、將灰度圖像進(jìn)行閾值分割，得到對(duì)應(yīng)的二值化圖像，接著進(jìn)行高斯模糊處理和再次閾值分割，之后再進(jìn)行孔洞填充處理，這樣改進(jìn)后的邊緣檢測(cè)算法獲得的輪廓更完整且是單像素。

由于灰度圖像存在以下兩點(diǎn)對(duì)canny算子邊緣檢測(cè)的干擾較大：1)大量的背景灰度信息；2)細(xì)胞的邊緣模糊，存在偽邊緣。于是本發(fā)明在使用canny算子進(jìn)行邊緣檢測(cè)前，采取以下方法對(duì)這兩點(diǎn)進(jìn)行處理，首先利用公式(1)對(duì)灰度圖像進(jìn)行閾值分割，得到對(duì)應(yīng)的二值化圖像，這樣基本上去除了灰度圖像中背景的灰度信息，變?yōu)榘咨尘啊?/p>

然后利用公式(2)的高斯函數(shù)產(chǎn)生模版，再利用該模版與獲得的二值化圖像進(jìn)行卷積運(yùn)算，即高斯模糊處理。

通常所用的高斯模糊半徑r與σ的關(guān)系為高斯模糊處理能去除細(xì)胞圖像的偽邊緣，使背景與邊緣的分界變得明顯。之后利用公式(3)對(duì)高斯模糊處理后的圖像再次進(jìn)行閾值分割。

這樣就將細(xì)胞與背景完全區(qū)分。最后對(duì)圖像中的孔洞部分進(jìn)行填充處理，孔洞填充的原理如下：設(shè)二值化的圖像含有的目標(biāo)區(qū)域的邊界值為1，非邊界為0，邊界點(diǎn)集記為a，從邊界內(nèi)的一點(diǎn)p開(kāi)始，令x0＝p＝1，可用公式(4)進(jìn)行迭代來(lái)填充孔洞區(qū)域，迭代至xk＝xk-1為止，式中b為填充的結(jié)構(gòu)單元，k為迭代的次數(shù)。

孔洞填充完成后，就可以得到較完整的細(xì)胞與背景分割的單像素圖像。

識(shí)別和精確定位細(xì)胞，找出符合封接條件的急性分離的神經(jīng)細(xì)胞具體步驟為：

對(duì)上述步驟得到的單像素圖像使用canny算子進(jìn)行邊緣檢測(cè)，對(duì)鏡下物質(zhì)的形狀進(jìn)行識(shí)別。具體的，首先采用canny算子來(lái)進(jìn)行邊緣檢測(cè)，邊緣檢測(cè)的目的是要提取出細(xì)胞的邊緣像素點(diǎn)，用于橢圓擬合中計(jì)算橢圓的參數(shù)。canny算子邊緣檢測(cè)的方法是：

(1)對(duì)單像素圖像使用帶有指定標(biāo)準(zhǔn)偏差的σ高斯濾波來(lái)進(jìn)行平滑，從而減少噪聲；

(2)計(jì)算圖像中的每一像素點(diǎn)的局部梯度，根據(jù)將該像素點(diǎn)的梯度幅度值判定該像素點(diǎn)是否為邊緣點(diǎn)；

其中梯度的幅度

梯度的方向角度

g(x,y)表示梯度的幅度，α(x,y)表示梯度的方向角度，gx表示x方向的梯度幅度，gy表示y方向的梯度幅度，根據(jù)將該像素點(diǎn)的梯度幅度值與其相鄰像素點(diǎn)的所有模值(兩像素點(diǎn)的距離)比較，若梯度幅度值是最大值，該判定該像素點(diǎn)為邊緣點(diǎn)，否則該像素點(diǎn)不是邊緣點(diǎn)；

在上一步的處理過(guò)程中，確定邊緣點(diǎn)時(shí)，由于處理的原因，梯度圖像會(huì)出現(xiàn)脊，需要消去不相關(guān)的點(diǎn)。首先，找到所有脊的頂部，即最大值，然后把其它值置為零消除掉脊，得出一條細(xì)線。在實(shí)施過(guò)程中，通過(guò)設(shè)定2個(gè)閾值來(lái)進(jìn)行處理，其中t1<t2，強(qiáng)邊緣像素指的是大于t2的像素值，而弱邊緣像素指的是大于t1并且小于t2的像素值。

在需要對(duì)邊緣進(jìn)行鏈接時(shí)(強(qiáng)邊緣與弱邊緣要進(jìn)行鏈接，以保證邊緣的順滑與真實(shí)性)，如果缺失部分都是弱像素點(diǎn)，這時(shí)可以將8個(gè)連接在一起的弱像素集成到強(qiáng)像素，以此來(lái)填補(bǔ)缺失部分。

canny算子是可以檢測(cè)出強(qiáng)邊緣和弱邊緣，并且前述可以邊緣鏈接可得知，弱邊緣是可以被包含在輸出中的，當(dāng)需要對(duì)邊緣進(jìn)行連接時(shí)，弱邊緣可以很好的與強(qiáng)邊緣進(jìn)行連接，這種方法不僅能夠很好的檢測(cè)出真正的弱邊緣，而且還可以避免弱邊緣受到噪聲的干擾。

邊緣檢測(cè)后，利用細(xì)胞形態(tài)與橢圓的相似性，使用red算法識(shí)別可能的橢圓點(diǎn)，再通過(guò)對(duì)橢圓點(diǎn)收集來(lái)進(jìn)行進(jìn)一步判斷，看是否為真實(shí)的橢圓，剔除周?chē)须s質(zhì)的細(xì)胞，酶消化過(guò)度和消化不到位的細(xì)胞，從而對(duì)符合封接條件的細(xì)胞進(jìn)行查找和定位。本發(fā)明對(duì)符合封接條件的細(xì)胞識(shí)別主要采用形態(tài)學(xué)上的識(shí)別方法，急性分離的神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)上與橢圓相似，周?chē)须s質(zhì)的細(xì)胞、酶消化過(guò)度和消化不到位的細(xì)胞均不符合真實(shí)橢圓的判別要求，因此計(jì)算機(jī)2通過(guò)尋找真實(shí)的橢圓來(lái)對(duì)符合封接條件的細(xì)胞進(jìn)行識(shí)別和確認(rèn)。

red算法基本流程圖如圖3所示。首先，從邊緣點(diǎn)集d中，隨機(jī)的取出6個(gè)不共線的點(diǎn)，并且把它們存入到一個(gè)數(shù)組p中，然后取出p中的5個(gè)點(diǎn)(pi＝(xi,yi)，i＝1，2，3，4，5)，代入公式(5)得出公式(6)：

ax²+bxy+cy²+dx+ey+1＝0(5)

解出方程組公式(6)，即可求出曲線參數(shù)(a，b，c，d，e)的值。當(dāng)且僅當(dāng)b²-4ac<0時(shí)，解出的二次曲線為橢圓，并記作q1-5。然后將求出的q1-5參數(shù)與沒(méi)有使用的第6個(gè)邊緣像素點(diǎn)p6，一起代入到公式(5)得出公式(7)：

公式(7)求出的是p6點(diǎn)到橢圓q1-5的距離的絕對(duì)值，其結(jié)果用d6表示。當(dāng)p6點(diǎn)在橢圓q1-5上時(shí)，那么式(7)中d6的值就應(yīng)該為0，此時(shí)就認(rèn)為該橢圓是可能的橢圓并記為qp。在實(shí)際的檢測(cè)過(guò)程中，通過(guò)給定一個(gè)很小的閾值td，來(lái)進(jìn)行判斷。當(dāng)d6<td時(shí)，就認(rèn)為p中的6個(gè)點(diǎn)是位于同一個(gè)橢圓上的，同時(shí)確定該橢圓是一個(gè)可能的橢圓。

再通過(guò)對(duì)橢圓點(diǎn)收集來(lái)判斷真實(shí)的橢圓。首先，把計(jì)數(shù)器清零，用它來(lái)統(tǒng)計(jì)位于橢圓上的邊緣點(diǎn)的個(gè)數(shù)，然后查找邊緣點(diǎn)集中的所有點(diǎn)，并計(jì)算出這些點(diǎn)到可能橢圓的距離，如果求得的距離比設(shè)定的閾值小，就讓計(jì)數(shù)器加1，并在可能橢圓的邊緣點(diǎn)集中加入這個(gè)點(diǎn)，同時(shí)將它從邊緣點(diǎn)集d中去除；反之則繼續(xù)遍歷d中的下一個(gè)點(diǎn)，直到d中的點(diǎn)全部被檢測(cè)完。這時(shí)統(tǒng)計(jì)可能橢圓的邊緣點(diǎn)集中的點(diǎn)的個(gè)數(shù)，看它是否高于一個(gè)設(shè)定的閾值，如果高于這個(gè)值，就認(rèn)為檢測(cè)到的橢圓是一個(gè)真實(shí)的橢圓，反之則把點(diǎn)集中的點(diǎn)返回到邊緣點(diǎn)集中，再重新進(jìn)行檢測(cè)。這個(gè)方法由于每次都會(huì)從點(diǎn)集d中抽取點(diǎn)來(lái)進(jìn)行檢測(cè)，并且不會(huì)重復(fù)檢測(cè)那些已經(jīng)確定了的點(diǎn)，有效的減少了運(yùn)算量，也提高了運(yùn)行的效率。由于存在檢測(cè)到的邊緣可能不是單一像素點(diǎn)組成的情況，讓邊緣存在一定的厚度，造成在該處檢測(cè)到多個(gè)橢圓，這時(shí)就需要對(duì)這些橢圓進(jìn)行擬合，把這些橢圓擬合成為一個(gè)橢圓，這個(gè)擬合出來(lái)的橢圓，就是需要查找的橢圓，即捕捉到符合封接要求的細(xì)胞。通過(guò)上述方法捕捉到的符合封接要求的細(xì)胞圖像如圖4所示，其中a、b兩個(gè)圓圈圈住部分即為本發(fā)明最終捕捉到的兩個(gè)符合封接要求的細(xì)胞。

通過(guò)對(duì)比現(xiàn)有技術(shù)和采用本發(fā)明技術(shù)兩次canny算子檢測(cè)圖像明顯可以看到改進(jìn)后的邊緣檢測(cè)算法獲得的輪廓更完整且是單像素。以前的方法上邊輪廓不完整，下側(cè)輪廓內(nèi)包含多余的不感興趣的輪廓，改進(jìn)后的算法檢測(cè)的邊緣輪廓更完整更好。最終擬合的圖像(圖4)也是改進(jìn)后的要大大優(yōu)于以前的方法。

所述單片機(jī)3與驅(qū)動(dòng)器4連接，用于根據(jù)獲得的坐標(biāo)值控制驅(qū)動(dòng)器4驅(qū)動(dòng)步進(jìn)電機(jī)，使步進(jìn)電機(jī)帶動(dòng)膜片鉗系統(tǒng)顯微鏡載物臺(tái)7移動(dòng)，將細(xì)胞移動(dòng)到顯微鏡的視野中。其中步進(jìn)電機(jī)可與膜片鉗系統(tǒng)顯微鏡載物臺(tái)7的移動(dòng)按鈕驅(qū)動(dòng)連接，步進(jìn)電機(jī)根據(jù)驅(qū)動(dòng)器4下發(fā)的指令扭動(dòng)膜片鉗系統(tǒng)顯微鏡載物臺(tái)7的移動(dòng)按鈕實(shí)現(xiàn)膜片鉗系統(tǒng)顯微鏡載物臺(tái)7的移動(dòng)。計(jì)算機(jī)2與單片機(jī)3在rs-232c的標(biāo)準(zhǔn)下進(jìn)行異步通信中數(shù)據(jù)的發(fā)送和接收，將數(shù)據(jù)傳輸給stc90c516rd+系列的單片機(jī)，再通過(guò)單片機(jī)的p1串口，對(duì)步進(jìn)電機(jī)驅(qū)動(dòng)器發(fā)送數(shù)據(jù)或脈沖驅(qū)動(dòng)其移動(dòng)。

所述驅(qū)動(dòng)器4可采用zd-6209-v2c驅(qū)動(dòng)器，2個(gè)兩相四線的步進(jìn)電機(jī)(橫向步進(jìn)電機(jī)5和縱向步進(jìn)電機(jī)6)直接和驅(qū)動(dòng)器4相連，選用齒數(shù)為40齒的同步帶輪，采用外部調(diào)速下的16細(xì)分方式驅(qū)動(dòng)，所述的步進(jìn)電機(jī)的步距角為0.28°，即步進(jìn)電機(jī)每步走0.28°。

計(jì)算機(jī)2能夠計(jì)算出確認(rèn)的目標(biāo)細(xì)胞的x軸和y軸坐標(biāo)值，并通過(guò)角度計(jì)算公式求出x軸和y軸步進(jìn)電機(jī)所應(yīng)該走的步數(shù)，處理完成的數(shù)據(jù)通過(guò)串口線被所述的計(jì)算機(jī)2逐級(jí)傳輸給單片機(jī)3和步進(jìn)電機(jī)驅(qū)動(dòng)器4，通過(guò)驅(qū)動(dòng)器4驅(qū)動(dòng)步進(jìn)電機(jī)轉(zhuǎn)動(dòng)，帶動(dòng)傳動(dòng)帶，傳動(dòng)帶的另一邊的膜片鉗系統(tǒng)顯微鏡載物臺(tái)7做出相應(yīng)的移動(dòng)，使符合封接條件的目標(biāo)細(xì)胞自動(dòng)出現(xiàn)在顯微鏡的視野中央，從而實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞的捕捉和跟蹤過(guò)程。

本發(fā)明還提供一種顯微鏡下急性分離神經(jīng)細(xì)胞捕捉方法，利用上述系統(tǒng)進(jìn)行，包括如下步驟：

步驟一、電子目鏡1獲取顯微鏡鏡下細(xì)胞圖像，并將獲取的細(xì)胞圖像傳送至計(jì)算機(jī)2；

步驟二、所述計(jì)算機(jī)2對(duì)細(xì)胞圖像進(jìn)行處理后識(shí)別和精確定位細(xì)胞，找出符合封接條件的急性分離的神經(jīng)細(xì)胞，并獲取其坐標(biāo)值，然后將坐標(biāo)值傳輸給單片機(jī)3；

其中，所述計(jì)算機(jī)2對(duì)細(xì)胞圖像進(jìn)行處理具體過(guò)程為：

1)將細(xì)胞圖像轉(zhuǎn)換成計(jì)算機(jī)視覺(jué)圖像，對(duì)計(jì)算機(jī)視覺(jué)圖像進(jìn)行灰度處理，將彩色圖像轉(zhuǎn)換成灰度圖像；本實(shí)施例中計(jì)算機(jī)視覺(jué)圖像采用bmp格式，從rgb到y(tǒng)uv空間的y轉(zhuǎn)換公式如下：

y＝0.299r+0.587g+0.114b

通過(guò)此公式可以直接把包含r、g、b三個(gè)分量的彩色圖像轉(zhuǎn)換成只包含亮度信息的圖像。

2)將灰度圖像進(jìn)行閾值分割，得到對(duì)應(yīng)的二值化圖像，接著進(jìn)行高斯模糊處理和再次閾值分割，之后再進(jìn)行孔洞填充處理，得到輪廓完整且細(xì)胞與背景分割的單像素圖像。

具體的，利用公式(1)對(duì)灰度圖像進(jìn)行閾值分割，得到對(duì)應(yīng)的二值化圖像

然后利用公式(2)的高斯函數(shù)產(chǎn)生模版，再利用該模版與獲得的二值化圖像進(jìn)行卷積運(yùn)算，即高斯模糊處理。

之后利用公式(3)對(duì)高斯模糊處理后的圖像再次進(jìn)行閾值分割

對(duì)圖像中的孔洞部分進(jìn)行填充處理具體為：

設(shè)二值化的圖像含有的目標(biāo)區(qū)域的邊界值為1，非邊界為0，邊界點(diǎn)集記為a，從邊界內(nèi)的一點(diǎn)p開(kāi)始，令x0＝p＝1，可用公式(4)進(jìn)行迭代來(lái)填充孔洞區(qū)域，迭代至xk＝xk-1為止，式中b為填充的結(jié)構(gòu)單元，k為迭代的次數(shù)。

孔洞填充完成后，就可以得到較完整的細(xì)胞與背景分割的單像素圖像。

所述識(shí)別和精確定位細(xì)胞，找出符合封接條件的急性分離的神經(jīng)細(xì)胞具體過(guò)程為：

1)對(duì)所述單像素圖像使用canny算子進(jìn)行邊緣檢測(cè)，提取出細(xì)胞的邊緣像素點(diǎn)；具體的，對(duì)單像素圖像使用帶有指定標(biāo)準(zhǔn)偏差的σ高斯濾波來(lái)進(jìn)行平滑，計(jì)算圖像中的每一像素點(diǎn)的局部梯度，根據(jù)將該像素點(diǎn)的梯度幅度值判定該像素點(diǎn)是否為邊緣點(diǎn)。

2)利用細(xì)胞形態(tài)與橢圓的相似性，使用red算法從提取的邊緣像素點(diǎn)中識(shí)別可能的橢圓，通過(guò)對(duì)橢圓點(diǎn)收集來(lái)判斷是否為真實(shí)的橢圓，如果判斷結(jié)果為是即捕捉到符合封接條件的急性分離的神經(jīng)細(xì)胞。具體的，從邊緣點(diǎn)集d中，隨機(jī)的取出6個(gè)不共線的點(diǎn)，并且把它們存入到一個(gè)數(shù)組p中，然后取出p中的5個(gè)點(diǎn)(pi＝(xi,yi)，i＝1，2，3，4，5)，代入公式(5)得出公式(6)：

ax²+bxy+cy²+dx+ey+1＝0(5)

解出方程組公式(6)，即可求出曲線參數(shù)(a，b，c，d，e)的值。當(dāng)且僅當(dāng)b²-4ac<0時(shí)，解出的二次曲線為橢圓，并記作q1-5。然后將求出的q1-5參數(shù)與沒(méi)有使用的第6個(gè)邊緣像素點(diǎn)p6，一起代入到公式(5)得出公式(7)：

公式(7)求出的是p6點(diǎn)到橢圓q1-5的距離的絕對(duì)值，其結(jié)果用d6表示。當(dāng)p6點(diǎn)在橢圓q1-5上時(shí)，那么式(7)中d6的值就應(yīng)該為0，此時(shí)就認(rèn)為該橢圓是可能的橢圓并記為qp。

再通過(guò)對(duì)橢圓點(diǎn)收集來(lái)判斷真實(shí)的橢圓。首先，把計(jì)數(shù)器清零，用它來(lái)統(tǒng)計(jì)位于橢圓上的邊緣點(diǎn)的個(gè)數(shù)，然后查找邊緣點(diǎn)集中的所有點(diǎn)，并計(jì)算出這些點(diǎn)到可能橢圓的距離，如果求得的距離比設(shè)定的閾值小，就讓計(jì)數(shù)器加1，并在可能橢圓的邊緣點(diǎn)集中加入這個(gè)點(diǎn)，同時(shí)將它從邊緣點(diǎn)集d中去除；反之則繼續(xù)遍歷d中的下一個(gè)點(diǎn)，直到d中的點(diǎn)全部被檢測(cè)完。這時(shí)統(tǒng)計(jì)可能橢圓的邊緣點(diǎn)集中的點(diǎn)的個(gè)數(shù)，看它是否高于一個(gè)設(shè)定的閾值，如果高于這個(gè)值，就認(rèn)為檢測(cè)到的橢圓是一個(gè)真實(shí)的橢圓，反之則把點(diǎn)集中的點(diǎn)返回到邊緣點(diǎn)集中，再重新進(jìn)行檢測(cè)。

步驟三、所述單片機(jī)3根據(jù)獲得的坐標(biāo)值控制驅(qū)動(dòng)器4驅(qū)動(dòng)步進(jìn)電機(jī)，使步進(jìn)電機(jī)帶動(dòng)膜片鉗系統(tǒng)顯微鏡載物臺(tái)7移動(dòng)，將細(xì)胞移動(dòng)到顯微鏡的視野中。

本發(fā)明通過(guò)顯微鏡電子目鏡1獲取顯微鏡下細(xì)胞圖像，再通過(guò)計(jì)算機(jī)2對(duì)細(xì)胞進(jìn)行識(shí)別和精確定位，然后將定位后的坐標(biāo)支傳輸給單片機(jī)3，通過(guò)步進(jìn)電機(jī)驅(qū)動(dòng)器控制與膜片鉗系統(tǒng)膜片鉗系統(tǒng)顯微鏡載物臺(tái)7相連接的雙相步進(jìn)電機(jī)，移動(dòng)膜片鉗系統(tǒng)顯微鏡載物臺(tái)7，使符合封接條件的神經(jīng)細(xì)胞自動(dòng)出現(xiàn)在顯微鏡視野中央，輔助進(jìn)行膜片鉗實(shí)驗(yàn)，提高實(shí)驗(yàn)效率，避免實(shí)驗(yàn)不良反應(yīng)。

以上所述，僅為本發(fā)明的具體實(shí)施方式，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此，任何屬于本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明揭露的技術(shù)范圍內(nèi)，可輕易想到的變化或替換，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。因此，本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求的保護(hù)范圍為準(zhǔn)。