本發(fā)明涉及植物學領(lǐng)域，具體是一種禾本科植物葉片表皮層氣孔密度的估測方法。

背景技術(shù)：

植物葉片的氣孔密度會影響植物的光合作用和蒸騰作用，是表征植物葉片氣孔特性的重要參數(shù)之一。目前大部分研究都是通過人工計數(shù)進行氣孔密度的測量，該方法不但浪費勞動力，而且當數(shù)據(jù)量很大時，人工很容易因為疲勞出現(xiàn)錯誤，還會受外界環(huán)境因素的影響，無法及時對采集的數(shù)據(jù)進行處理。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種禾本科植物葉片表皮層氣孔密度的估測方法，通過對光學顯微鏡采集到的樣本葉片表皮標本圖像進行處理，得到視場內(nèi)樣本葉片的氣孔數(shù)量，從而計算得到樣本葉片的氣孔密度。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種禾本科植物葉片表皮層氣孔密度的估測方法，包括以下步驟：

(1)樣本葉片的準備：

選取株型健壯、發(fā)育正常的禾本科植物葉片為估測對象，量取葉片總長度，在距離葉片長度中間2～3cm處分別橫向剪斷葉片，然后在距離主葉脈0.5～2cm處縱向剪掉主葉脈一側(cè)的邊緣葉片，最后沿著主葉脈縱向剪掉包括主葉脈的另外一半葉片，作為樣本葉片，標記葉片樣品的上、下表皮后，迅速置于提前預(yù)冷的faa固定液中保存?zhèn)溆茫?/p>

(2)表皮標本的制作：

①、用鑷子輕輕夾取保存在faa固定液中的樣本葉片，放置在預(yù)先準備好的白色濾紙上，用兩個載玻片左右橫向壓住樣本葉片以保持葉片平整，室溫放置晾干或用脫脂棉拭去葉片表面液體；

②、蘸取無色指甲油或透明膠，均勻的涂抹在樣本葉片表面，室溫放置使指甲油或透明膠干燥；

③、用透明膠帶粘在涂有指甲油或透明膠的樣本葉片表面，趕走透明膠帶底部氣泡，使透明膠帶和樣本葉片表層緊密粘在一起；

④、迅速撕下透明膠帶，使透明膠帶連同指甲油或透明膠一起被撕下，將撕下的透明膠帶粘在載玻片上，標注上表皮或下表皮標本；

⑤、用鑷子將樣本葉片翻轉(zhuǎn)過來，利用同樣的辦法，制作樣本葉片另一面的表皮標本；

(3)氣孔觀察：

利用光學顯微鏡觀察表皮標本的氣孔細胞分布，選擇視場內(nèi)沒有雜質(zhì)，且氣孔數(shù)目分布盡可能多的觀察視場，拍攝圖片，并保存，每個表皮標本拍攝n張圖片，n≥5；

(4)氣孔密度計算：

數(shù)出n張圖片的氣孔數(shù)目總和，按下式計算，分別獲得葉片樣品上表皮層和下表皮層的氣孔密度：

為簡單說明問題起見，以下對本發(fā)明所述的禾本科植物葉片表皮層氣孔密度的估測方法均簡稱為本方法。

本方法通過對顯微鏡采集到的樣本葉片圖像進行處理，得到視場內(nèi)樣本葉片的氣孔數(shù)量，從而計算得到樣本葉片的氣孔密度，能夠快速獲取樣本葉片的氣孔密度，而且效率較高。

附圖說明

圖1是實施例1拍攝的高粱葉片下表皮的氣孔圖像。

圖2是實施例2拍攝的小麥葉片下表皮的氣孔圖像

具體實施方式

實施例1

高粱葉片表皮層氣孔密度的估測方法，包括以下步驟：

(1)樣本葉片的準備：

在高粱灌漿初期，選取株型健壯、發(fā)育正常、距離高粱植株頂端的第三片葉片為估測對象，量取葉片總長度，在距離葉片長度中間3cm處分別橫向剪斷葉片，然后在距離主葉脈2cm處縱向剪掉主葉脈一側(cè)的邊緣葉片，最后沿著主葉脈縱向剪掉包括主葉脈的另外一半葉片，作為樣本葉片，計算樣本葉片的面積為6cm×2cm＝12cm²，標記葉片樣品的上、下表皮后，迅速置于提前預(yù)冷的faa固定液中保存?zhèn)溆茫?/p>

(2)表皮標本的制作：

①、用鑷子輕輕夾取保存在faa固定液中的樣本葉片，放置在預(yù)先準備好的白色濾紙上(注意區(qū)別樣本葉片上、下表皮)，用兩個載玻片左右橫向壓住樣本葉片以保持樣本葉片平整，室溫放置并用脫脂棉擦拭，使葉片表面液體晾干；

②、用微小的刷子蘸取透明膠，均勻的涂抹在樣本葉片表面，室溫放置并適當扇風使透明膠干燥；

③、用4cm×2.5cm的透明膠帶粘在涂有指甲油的樣本葉片表面，趕走透明膠帶底部氣泡，使透明膠帶和樣本葉片表層緊密粘在一起；

④、迅速撕下透明膠帶，使透明膠帶連同指甲油一起被撕下，并保證指甲油的完整性，將撕下的透明膠帶粘在載玻片上，記號筆標注上表皮或下表皮標本；

⑤、用鑷子將樣本葉片翻轉(zhuǎn)過來，利用同樣的辦法，制作樣本葉片另一面的表皮標本；

(3)氣孔觀察：

打開光學顯微鏡和連接顯微鏡的電腦，利用放大倍數(shù)100×(目鏡10×，物鏡10×)下觀察，啟動顯微鏡操作軟件，矯正顯微鏡白平衡參數(shù)；將制作的表皮標本+載玻片放置在載物臺上，推片器彈簧夾夾住，然后旋轉(zhuǎn)推片器螺旋，將所要觀察的部位調(diào)到通光孔的正中，調(diào)節(jié)細準焦螺旋至可以觀察到清晰的圖像為止；觀察表皮標本的氣孔細胞分布，選擇視場內(nèi)沒有雜質(zhì)，且氣孔數(shù)目分布盡可能多的觀察視場，拍攝圖片，并保存，每個表皮標本拍攝10張圖片，如圖1所示；

(4)氣孔密度計算：

數(shù)出10張圖片的氣孔數(shù)目總和，按下式計算，分別獲得葉片樣品上表皮層和下表皮層的氣孔密度：

其中faa固定液(100ml)含有89ml60％的乙醇、5ml38％的甲醛和6ml冰醋酸。60％的乙醇的配置方法是：量取無水乙醇60ml，加入40mlddh2o(雙蒸水)。38％的甲醛的配制方法是：量取38ml甲醛，加入62mlddh2o。

faa固定液現(xiàn)配現(xiàn)用。

實施例2

小麥葉片表皮層氣孔密度的估測方法，包括以下步驟：

(1)樣本葉片的準備：

在小麥灌漿初期，選取株型健壯、發(fā)育正常、從植株頂端數(shù)起的第四片葉片為估測對象，量取葉片總長度，在距離葉片長度中間2cm處分別橫向剪斷葉片，然后在距離主葉脈0.5cm處縱向剪掉主葉脈一側(cè)的邊緣葉片，最后沿著主葉脈縱向剪掉包括主葉脈的另外一半葉片，作為樣本葉片，計算樣本葉片的面積為4cm×0.5cm＝2.0cm²，標記葉片樣品的上、下表皮后，迅速置于提前預(yù)冷的faa固定液中保存?zhèn)溆茫?/p>

(2)表皮標本的制作：

①、用鑷子輕輕夾取保存在faa固定液中的樣本葉片，放置在預(yù)先準備好的白色濾紙上(注意區(qū)別樣本葉片上、下表皮)，用兩個載玻片左右橫向壓住樣本葉片以保持樣本葉片平整，室溫放置30s晾干；

②、用微小的刷子蘸取無色指甲油，均勻的涂抹在樣本葉片表面，室溫放置使指甲油干燥；

③、用3cm×1.0cm的透明膠帶粘在涂有透明膠的樣本葉片表面，趕走透明膠帶底部氣泡，使透明膠帶和樣本葉片表層緊密粘在一起；

④、迅速撕下透明膠帶，使透明膠帶連同透明膠一起被撕下，并保證透明膠的完整性，將撕下的透明膠帶粘在載玻片上，記號筆標注上表皮或下表皮標本；

⑤、用鑷子將樣本葉片翻轉(zhuǎn)過來，利用同樣的辦法，制作樣本葉片另一面的表皮標本；

(3)氣孔觀察：

打開光學顯微鏡和連接顯微鏡的電腦，利用放大倍數(shù)100×(目鏡10×，物鏡10×)下觀察，啟動顯微鏡操作軟件，矯正顯微鏡白平衡參數(shù)；將制作的表皮標本+載玻片放置在載物臺上，推片器彈簧夾夾住，然后旋轉(zhuǎn)推片器螺旋，將所要觀察的部位調(diào)到通光孔的正中，調(diào)節(jié)細準焦螺旋至可以觀察到清晰的圖像為止；觀察表皮標本的氣孔細胞分布，選擇視場內(nèi)沒有雜質(zhì)，且氣孔數(shù)目分布盡可能多的觀察視場，拍攝圖片，并保存，每個表皮標本拍攝5張圖片，如圖2所示；

(4)氣孔密度計算：

數(shù)出5張圖片的氣孔數(shù)目總和，按下式計算，分別獲得葉片樣品上表皮層和下表皮層的氣孔密度：

其中faa固定液(100ml)含有89ml60％的乙醇、5ml38％的甲醛和6ml冰醋酸。60％的乙醇的配置方法是：量取無水乙醇60ml，加入40mlddh2o(雙蒸水)。38％的甲醛的配制方法是：量取38ml甲醛，加入62mlddh2o。配制好的faa固定液4℃低溫保存，且在一個月內(nèi)使用。