本發(fā)明涉及檢測豬流行性腹瀉病毒的方法，特別是一種基于重組s1蛋白檢測豬流行性腹瀉病毒iga抗體的elisa方法。
背景技術(shù)：
豬流行性腹瀉(porcineepidemicdiarrhea，ped)是由豬流行性腹瀉病毒(porcineepidemicdiarrheavirus，pedv)引起的豬的一種以嘔吐、腹瀉和脫水為主要臨床癥狀的腸道傳染病。該病已成為制約我國養(yǎng)豬業(yè)健康發(fā)展的重要豬病之一。
作為豬的一種腸道病毒，pedv引起的免疫應(yīng)答主要以腸道粘膜免疫為主。實踐中，血清學(xué)檢測仍然是pedv臨床診斷及免疫評價的常用方法。遺憾的是，目前的抗體檢測技術(shù)主要集中在血液中igg抗體水平的檢測，而臨床檢測發(fā)現(xiàn)，盡管疫苗免疫后血清中存在較高水平的抗pedvigg抗體，豬群仍發(fā)生腹瀉的情況時常發(fā)生。因此，傳統(tǒng)檢測血清中的pedvigg抗體水平不能真實反映pedv疫苗的免疫保護(hù)狀況。對于腸道病毒來說，iga是病原體感染后腸道粘膜產(chǎn)生最多的抗體類型，也是阻止病原體入侵腸道的重要防線，在機(jī)體抗感染免疫中發(fā)揮重要作用。因此，對于pedv來說，豬體內(nèi)iga水平更能反應(yīng)機(jī)體被pedv感染情況及疫苗免疫保護(hù)效力。目前對于iga的檢測仍存在一定難度，國內(nèi)尚缺乏標(biāo)準(zhǔn)的pedviga檢測技術(shù)和產(chǎn)品。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明根據(jù)流行毒株ch/hnqx-3/14的s1基因序列設(shè)計引物，擴(kuò)增產(chǎn)物編碼的蛋白包含了s1蛋白的499-638aa、748-755aa和756-771aa三個中和表位區(qū)。將其構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pet30a(+)-ps1，轉(zhuǎn)化大腸桿菌bl21后，通過優(yōu)化表達(dá)條件，獲得了可溶性表達(dá)的重組ps1蛋白，采用ni-nta親和層析對其進(jìn)行純化，以純化后的重組ps1蛋白為抗原包被酶標(biāo)板，建立了pedviga抗體間接elisa檢測方法，該方法具有良好的特異性、敏感性和重復(fù)度，可用于pedv的臨床檢測及疫苗免疫評價。
本發(fā)明的目的是提供一種高通量檢測pedviga抗體的elisa方法，該方法具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、結(jié)果準(zhǔn)確可靠的特點，可用于pedv的疫苗免疫評價。
本發(fā)明的技術(shù)方案是，一種基于重組s1蛋白檢測豬流行性腹瀉病毒iga抗體的elisa方法，它包括以下步驟：
步驟1：
重組ps1蛋白可溶性表達(dá)體系的建立
構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pet30a(+)-ps1，轉(zhuǎn)化大腸桿菌bl21后，通過優(yōu)化表達(dá)條件，獲得了可溶性表達(dá)的重組ps1蛋白，具體為：
(1)ps1重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
采用上游引物：5'-ggggatcctcttttgttactttgcc-3’河下游引物：5’-gcgaattcaggcgtgttgtaaagc-3’擴(kuò)增ps1基因，上下游分別引入bamhi和ecori酶切位點，將該基因克隆至pet30a(+)載體，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pet30a(+)-ps1；
(2)確定誘導(dǎo)前菌液od600值
誘導(dǎo)前首先測定菌液od600值，然后加入1.0mmiptg，置于37℃搖床250rpm誘導(dǎo)表達(dá)10h，菌體經(jīng)8000rpm離心15min后超聲破碎；每工作5s，間隔5s，15min，12000rpm離心10min，分別對上清和沉淀進(jìn)行12﹪sds-page電泳，根據(jù)蛋白表達(dá)情況，確定誘導(dǎo)前菌液最佳od600值為0.6；
(3)重組ps1蛋白誘導(dǎo)表達(dá)溫度的優(yōu)化
菌液培養(yǎng)至以上確定的od600值時加入1.0mmiptg，分別置于20℃～37℃搖床250rpm培養(yǎng)10h，菌體經(jīng)離心及超聲破碎處理后，12﹪sds-page電泳，根據(jù)沉淀和上清中目的蛋白的表達(dá)情況，確定30℃為最佳誘導(dǎo)表達(dá)溫度；
(4)iptg工作濃度的優(yōu)化
按以上確定的最佳誘導(dǎo)溫度，向菌液中加入終濃度分別為0.1～1.2mm的iptg誘導(dǎo)表達(dá)10h，超聲破碎菌體，12000rpm離心10min，分別收集上清和沉淀，采用12﹪sds-page電泳觀察蛋白表達(dá)情況，確定iptg的最佳誘導(dǎo)工作濃度為0.8mm；
(5)重組ps1蛋白誘導(dǎo)表達(dá)時間的優(yōu)化
根據(jù)以上確定的誘導(dǎo)表達(dá)條件，從誘導(dǎo)2h開始，每隔2h收樣一次，直到誘導(dǎo)20h結(jié)束，超聲處理誘導(dǎo)后菌液，12000rpm離心10min，12﹪sds-page電泳觀察蛋白表達(dá)情況，確定最佳誘導(dǎo)時間為8h；
步驟2：
重組ps1蛋白的ni-nta親和層析純化
(1)裝?。簩⒅哟怪惫潭ㄓ陔x心管架子上，取20ml填料加入柱子中，沉積30min；
(2)將鎳柱接入
(3)平衡：用至少10倍柱床體積的bindbuffer(300mmnacl，50mmnah2po4，10mmimidazole，ph8.0)對柱子平衡2次；
(4)上樣：將待純化蛋白循環(huán)上樣3-5次。注意保存流穿過的蛋白液，比較過柱前后目的蛋白的濃度變化；
(5)洗滌：用washingbuffer(300mmnacl，50mmnah2po4，50mmimidazole，ph8.0)反復(fù)洗滌雜蛋白，用蛋白指示劑檢測蛋白濃度的變化；
(6)洗脫：用elutionbuffer(300mmnacl，50mmnah2po4，200mmimidazole，ph8.0)洗脫目的蛋白，sds-page及western-blot鑒定分析洗脫效果；
(7)柱子保存：分別用5-10倍柱體積的bindingbuffer和超純水對柱子進(jìn)行清洗，再加入20﹪乙醇4℃保存；
步驟3：
ps1-elisa方法的建立
(1)包被：表達(dá)的重組ps1蛋白按1.25μg/ml濃度用0.05mcbs(ph9.6)包被于96孔板(50μl/孔)，4℃過夜，取出后用pbst洗滌5次；
(2)封閉：每孔加入200μl的1﹪bsa作為封閉液，置于37℃條件下封閉90min，洗滌5次；
(3)加樣：樣品用pbs稀釋后按每孔50μl加入酶標(biāo)板，并加入陰性和陽性對照，37℃作用30min，洗滌5次；
(4)加入酶標(biāo)二抗：山羊抗豬iga酶標(biāo)二抗(hrp-iga)按1:4000倍稀釋后，按每孔50μl量加入以上酶標(biāo)孔，37℃反應(yīng)30min，洗滌5次；
(5)顯色與終止：按50μl/孔的量加入tmb顯色液，避光條件下顯色10min，加入2mh2so4終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀測定od450值；
(6)結(jié)果判定：利用以上方法檢測36份pedv陰性血清，測定od450值，計算平均值
本發(fā)明至少包括以下有益效果：
(1)本裝置是一種基于pedv的重組纖突蛋白(s1蛋白)所建立的elisa方法。首先根據(jù)流行毒株ch/hnqx-3/14的s1基因序列設(shè)計引物，擴(kuò)增產(chǎn)物編碼的蛋白包含了s1蛋白的499-638aa、748-755aa和756-771aa三個中和表位區(qū)。將其構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pet30a(+)-ps1，轉(zhuǎn)化大腸桿菌bl21后，通過優(yōu)化表達(dá)條件，獲得了可溶性表達(dá)的重組ps1蛋白，采用ni-nta親和層析對其進(jìn)行純化，以純化后的重組ps1蛋白為抗原包被酶標(biāo)板，建立了pedviga抗體間接elisa檢測方法。
(2)本裝置檢測特異性強(qiáng)，敏感性高。采用該elisa方法，在同批次條件下對tgev、csfv、prrsv、prv、fmdv等病毒的陽性血清進(jìn)行特異性測定，同時設(shè)pedv陰性對照。結(jié)果顯示，除pedv陽性血清對照外，其它血清檢測結(jié)果均呈陰性，表明該方法具有較好的特異性；將3份不同iga效價的pedv陽性血清和3份pedv陽性乳汁(經(jīng)商品化試劑盒篩選)從1:100開始進(jìn)行倍比稀釋，采用本試驗所建立的elisa方法進(jìn)行檢測，同時設(shè)陰性對照，評價該方法的敏感性。結(jié)果顯示，除3號乳汁樣品外，其余樣品當(dāng)稀釋度達(dá)到1:3200時，測得od450nm均大于0.43(臨界值)，表明該方法具有較好的敏感性。
(3)本裝置檢測重復(fù)性好。取5份血清，用兩批重組ps1蛋白包被酶聯(lián)板各重復(fù)檢測3次，應(yīng)用spss統(tǒng)計學(xué)軟件計算標(biāo)準(zhǔn)偏差及變異系數(shù)，對該elisa檢測方法的重復(fù)性及穩(wěn)定性進(jìn)行統(tǒng)計分析。結(jié)果顯示，5份樣品的od450變異系數(shù)(cv)均較小，平均值為4.92﹪，表明該方法具有較好的重復(fù)性。
(4)減少投資和檢測成本。使用該檢測方法，不需另配其它儀器、設(shè)備和試劑，節(jié)省大量儀器、設(shè)備和附加試劑費用；專業(yè)和非專業(yè)人士均可隨時隨地進(jìn)行現(xiàn)場檢測，節(jié)省檢測成本，檢測費用低。
(5)應(yīng)用范圍廣，便于普遍推廣應(yīng)用。本發(fā)明操作簡單，而且方便攜帶和保存，能滿足不同層次人員的需要，包括專業(yè)化驗、海關(guān)檢疫、衛(wèi)生防疫、質(zhì)量監(jiān)測、畜產(chǎn)品加工、集約化養(yǎng)殖到個體養(yǎng)殖等，具有廣闊的市場前景和較好的經(jīng)濟(jì)、社會效益。
附圖說明
圖1是本發(fā)明所述的pedvps1蛋白的表達(dá)、純化及westernblot分析結(jié)果圖。
m：預(yù)染蛋白marker(10-180kda)；1：未純化的重組ps1蛋白sds-page；2-6：純化后的重組ps1蛋白sds-page；7：westernblot顯示ps1蛋白與pedv陽性血清的反應(yīng)；8：空載誘導(dǎo)。
具體實施方式
詳細(xì)描述實施例，
實施例：
步驟1：
重組ps1蛋白可溶性表達(dá)體系的建立
構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pet30a(+)-ps1，轉(zhuǎn)化大腸桿菌bl21后，通過優(yōu)化表達(dá)條件，獲得了可溶性表達(dá)的重組ps1蛋白，具體為：
(1)ps1重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
采用上游引物：5'-ggggatcctcttttgttactttgcc-3’河下游引物：5’-gcgaattcaggcgtgttgtaaagc-3’擴(kuò)增ps1基因，上下游分別引入bamhi和ecori酶切位點，將該基因克隆至pet30a(+)載體，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pet30a(+)-ps1；
(2)確定誘導(dǎo)前菌液od600值
誘導(dǎo)前首先測定菌液od600值，然后加入1.0mmiptg，置于37℃搖床250rpm誘導(dǎo)表達(dá)10h，菌體經(jīng)8000rpm離心15min后超聲破碎；每工作5s，間隔5s，15min，12000rpm離心10min，分別對上清和沉淀進(jìn)行12﹪sds-page電泳，根據(jù)蛋白表達(dá)情況，確定誘導(dǎo)前菌液最佳od600值為0.6；
(3)重組ps1蛋白誘導(dǎo)表達(dá)溫度的優(yōu)化
菌液培養(yǎng)至以上確定的od600值時加入1.0mmiptg，分別置于20℃～37℃搖床250rpm培養(yǎng)10h，菌體經(jīng)離心及超聲破碎處理后，12﹪sds-page電泳，根據(jù)沉淀和上清中目的蛋白的表達(dá)情況，確定30℃為最佳誘導(dǎo)表達(dá)溫度；
(4)iptg工作濃度的優(yōu)化
按以上確定的最佳誘導(dǎo)溫度，向菌液中加入終濃度分別為0.1～1.2mm的iptg誘導(dǎo)表達(dá)10h，超聲破碎菌體，12000rpm離心10min，分別收集上清和沉淀，采用12﹪sds-page電泳觀察蛋白表達(dá)情況，確定iptg的最佳誘導(dǎo)工作濃度為0.8mm；
(5)重組ps1蛋白誘導(dǎo)表達(dá)時間的優(yōu)化
根據(jù)以上確定的誘導(dǎo)表達(dá)條件，從誘導(dǎo)2h開始，每隔2h收樣一次，直到誘導(dǎo)20h結(jié)束，超聲處理誘導(dǎo)后菌液，12000rpm離心10min，12﹪sds-page電泳觀察蛋白表達(dá)情況，確定最佳誘導(dǎo)時間為8h；
步驟2：
重組ps1蛋白的ni-nta親和層析純化
(1)裝?。簩⒅哟怪惫潭ㄓ陔x心管架子上，取20ml填料加入柱子中，沉積30min；
(2)將鎳柱接入
(3)平衡：用至少10倍柱床體積的bindbuffer(300mmnacl，50mmnah2po4，10mmimidazole，ph8.0)對柱子平衡2次；
(4)上樣：將待純化蛋白循環(huán)上樣3-5次。注意保存流穿過的蛋白液，比較過柱前后目的蛋白的濃度變化；
(5)洗滌：用washingbuffer(300mmnacl，50mmnah2po4，50mmimidazole，ph8.0)反復(fù)洗滌雜蛋白，用蛋白指示劑檢測蛋白濃度的變化；
(6)洗脫：用elutionbuffer(300mmnacl，50mmnah2po4，200mmimidazole，ph8.0)洗脫目的蛋白，sds-page及western-blot鑒定分析洗脫效果；
(7)柱子保存：分別用5-10倍柱體積的bindingbuffer和超純水對柱子進(jìn)行清洗，再加入20﹪乙醇4℃保存；
步驟3：
ps1-elisa方法的建立
(1)包被：表達(dá)的重組ps1蛋白按1.25μg/ml濃度用0.05mcbs(ph9.6)包被于96孔板(50μl/孔)，4℃過夜，取出后用pbst洗滌5次；
(2)封閉：每孔加入200μl的1﹪bsa作為封閉液，置于37℃條件下封閉90min，洗滌5次；
(3)加樣：樣品用pbs稀釋后按每孔50μl加入酶標(biāo)板，并加入陰性和陽性對照，37℃作用30min，洗滌5次；
(4)加入酶標(biāo)二抗：山羊抗豬iga酶標(biāo)二抗(hrp-iga)按1:4000倍稀釋后，按每孔50μl量加入以上酶標(biāo)孔，37℃反應(yīng)30min，洗滌5次；
(5)顯色與終止：按50μl/孔的量加入tmb顯色液，避光條件下顯色10min，加入2mh2so4終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀測定od450值；
(6)結(jié)果判定：利用以上方法檢測36份pedv陰性血清，測定od450值，計算平均值
敏感性試驗
將3份不同iga效價的pedv陽性血清和3份pedv陽性乳汁(經(jīng)商品化試劑盒篩選)從1:100開始進(jìn)行倍比稀釋，采用本發(fā)明所建立的elisa方法進(jìn)行檢測，同時設(shè)陰性對照，評價該方法的敏感性。結(jié)果如表1，除3號乳汁樣品外，其余樣品當(dāng)稀釋度達(dá)到1:3200時，測得od450nm均大于0.43(臨界值)，表明該方法具有較好的敏感性。
表1敏感性檢測結(jié)果
特異性試驗
用ps1-elisa方法分別對pedv、tgev、csfv、prrsv、prv、fmdv等病毒的陽性血清進(jìn)行特異性檢測，每份血清做3個重復(fù)，同時設(shè)立陰性對照和陰性血清，觀察ps1-elisa的特異性。結(jié)果如表2，除pedv陽性血清對照外，其它血清檢測結(jié)果均呈陰性，表明該方法具有較好的特異性。
表2特異性檢測結(jié)果
重復(fù)性試驗
取5份血清，用兩批重組ps1蛋白包被酶聯(lián)板各重復(fù)檢測3次，應(yīng)用spss統(tǒng)計學(xué)軟件計算標(biāo)準(zhǔn)偏差及變異系數(shù)，對該elisa檢測方法的重復(fù)性及穩(wěn)定性進(jìn)行統(tǒng)計分析。結(jié)果如表3所示，5份樣品的od450變異系數(shù)(cv)均較小，平均值為4.92﹪(表3-5)，表明該方法具有較好的重復(fù)性。
表35份血清樣品各用兩批包被elisa板3次檢測結(jié)果分析
疫苗免疫評價
采用本發(fā)明建立的elisa方法，對母豬免疫和未免疫t-p二聯(lián)苗的兩個豬群進(jìn)行iga抗體檢測。結(jié)果如表4所示，無論是母豬免疫豬群還是未免疫豬群，育肥豬和母豬的抗體陽性率總體上均比哺乳仔豬和保育豬高。另外，免疫豬群的血清抗體陽性率在不同年齡階段均比未免疫豬群偏高，免疫豬群母豬乳汁中的iga抗體陽性率較未免疫豬群高。
表4免疫評價結(jié)果
上述實施例僅僅是為清楚地說明所作的舉例，而并非對實施方式的限定。對于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在上述說明的基礎(chǔ)上還可以做出其它不同形式的變化或變動。這里無需也無法對所有的實施方式予以窮舉，而由此所引伸出的顯而易見的變化或變動仍處于本發(fā)明創(chuàng)造的保護(hù)范圍之內(nèi)。