本發(fā)明涉及一種膠體金免疫層析試紙條及其制備方法。

背景技術：

鴨甲型肝炎病毒(dhav)可引起雛鴨發(fā)生急性、高度致死性傳染病，主要感染4周齡以下的雛鴨，其中1周齡以內(nèi)的雛鴨死亡率高達95％，主要特征病變?yōu)榛疾▲喌母闻K腫大和出血。根據(jù)基因組特征和抗原中和試驗，將鴨甲型肝炎病毒分為3個基因型或血清型，即鴨甲型肝炎病毒1型(dhav-1)、2型(dhav-2)和3型(dhav-3)。其中鴨甲型肝炎病毒1型與2型不產(chǎn)生交叉保護作用，與3型有部分交叉中和反應。

目前，檢測鴨甲型肝炎病毒抗原的方法有很多種，如病毒中和試驗、elisa、rt-pcr、免疫電鏡等，這些方法各自都具有不可替代的優(yōu)勢，但也有自身不足的地方，如操作麻煩、試驗所需時間長、不能用于快速診斷、靈敏度和特異性差等缺點，在生產(chǎn)實際應用中有很大的限制。而膠體金試紙條作為新的檢測技術，具有操作簡單、快速、特異性強、靈敏度高、不需要任何儀器和設備、肉眼即可判斷結果等優(yōu)點，有著廣泛的應用價值。目前我國養(yǎng)鴨生產(chǎn)中均有1型和3型鴨甲型肝炎的發(fā)生和流行，但尋找1型和3型鴨甲型肝炎病毒的共同抗體并建立能同時檢測1型和3型鴨甲型肝炎病毒的簡便快速檢測方法一直是學術界和生產(chǎn)中沒有很好解決的難題。

技術實現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明的目的在于研制一種能夠同時檢測1型和3型鴨甲型肝炎病毒的膠體金試紙條，從而為臨床和基層單位不漏檢1型或3型鴨甲型肝炎病毒提供廣譜、靈敏、特異、簡便、快速的檢測技術。

為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，經(jīng)研究，本發(fā)明提供如下技術方案：

1.同時檢測1型和3型鴨甲型肝炎病毒的膠體金試紙條，由底板、硝酸纖維素膜、樣品墊、金標墊和吸收墊組成，所述硝酸纖維素膜上的質控線包被抗鼠igg，檢測線包被抗1型鴨甲型肝炎病毒多抗；所述金標墊包被膠體金標記的同時識別1型和3型鴨甲型肝炎病毒的單克隆抗體。

優(yōu)選的，所述抗鼠igg為羊抗鼠igg，所述抗1型鴨甲型肝炎病毒多抗為兔抗1型鴨甲型肝炎病毒多抗。

優(yōu)選的，所述同時識別1型和3型鴨甲型肝炎病毒的單克隆抗體由保藏編號為cctccno：c201701的雜交瘤細胞株dhav-mab1分泌。

2.同時檢測1型和3型鴨甲型肝炎病毒的膠體金試紙條的制備方法，包括以下步驟：

a.硝酸纖維素膜的包被與封閉：將抗鼠igg和抗1型鴨甲型肝炎病毒多抗分別包被于硝酸纖維素膜上形成質控線和檢測線，干燥，再將硝酸纖維素膜用牛血清白蛋白封閉，干燥，制得包含檢測線和質控線并經(jīng)封閉處理的硝酸纖維素膜；

b.金標墊的包被：將膠體金標記的同時識別1型和3型鴨甲型肝炎病毒的單克隆抗體溶液加于玻璃纖維素膜或聚酯纖維素膜上，干燥，制得金標墊；

c.試紙條的組裝：將包含檢測線和質控線并經(jīng)封閉處理的硝酸纖維素膜、金標墊、樣品墊和吸收墊依次粘在底板上，制得膠體金試紙條。

優(yōu)選的，所述步驟a是將羊抗鼠igg用0.01mol/l、ph7.4的pbs稀釋至濃度不低于0.6mg/ml后包被于硝酸纖維素膜上形成質控線，將兔抗1型鴨甲型肝炎病毒多抗用0.01mol/l、ph7.4的pbs稀釋至濃度不低于0.8mg/ml后包被于硝酸纖維素膜上形成檢測線，干燥，再將硝酸纖維素膜用0.01g/ml牛血清白蛋白溶液于37℃封閉不低于1小時，干燥，制得包含檢測線和質控線并經(jīng)封閉處理的硝酸纖維素膜。

更優(yōu)選的，所述步驟a是將羊抗鼠igg用0.01mol/l、ph7.4的pbs稀釋至濃度為1.0mg/ml后包被于硝酸纖維素膜上形成質控線，將兔抗1型鴨甲型肝炎病毒多抗用0.01mol/l、ph7.4的pbs稀釋至濃度為1.0mg/ml后包被于硝酸纖維素膜上形成檢測線，干燥，再將硝酸纖維素膜用0.01g/ml牛血清白蛋白溶液于37℃封閉1小時，干燥，制得包含檢測線和質控線并經(jīng)封閉處理的硝酸纖維素膜。

優(yōu)選的，所述步驟b中膠體金標記的同時識別1型和3型鴨甲型肝炎病毒的單克隆抗體溶液采用以下方法制得：按照1ml膠體金溶液加入0.1mol/lk2co3溶液12-20μl與單克隆抗體28-34μg的比例將三者混勻，靜置，再加入終濃度為0.01g/ml的牛血清白蛋白，混勻，靜置，得到金標單克隆抗體溶液；取金標單克隆抗體溶液，4℃、2000r/min離心，收集上清液，再4℃、9000r/min離心，棄去上清液，沉淀用金標抗體重懸液稀釋至原體積，4℃、9000r/min離心，棄去上清液，沉淀重復上述操作1-2次，最后按照1ml金標單克隆抗體溶液用不超過450μl金標抗體重懸液稀釋的比例加入金標抗體重懸液進行稀釋，即制得膠體金標記的同時識別1型和3型鴨甲型肝炎病毒的單克隆抗體溶液。

更優(yōu)選的，所述步驟b中膠體金標記的同時識別1型和3型鴨甲型肝炎病毒的單克隆抗體溶液采用以下方法制得：按照1ml膠體金溶液加入0.1mol/lk2co3溶液12μl與單克隆抗體34μg的比例將三者混勻，靜置，再加入終濃度為0.01g/ml的牛血清白蛋白，混勻，靜置，得到金標單克隆抗體溶液；取金標單克隆抗體溶液，4℃、2000r/min離心15min，收集上清液，再4℃、9000r/min離心20min，棄去上清液，沉淀用金標抗體重懸液稀釋至原體積，4℃、9000r/min離心20min，棄去上清液，沉淀重復上述操作1-2次，最后按照1ml金標單克隆抗體溶液用400μl金標抗體重懸液稀釋的比例加入金標抗體重懸液進行稀釋，即制得膠體金標記的同時識別1型和3型鴨甲型肝炎病毒的單克隆抗體溶液。

優(yōu)選的，所述單克隆抗體由保藏編號為cctccno：c201701的雜交瘤細胞株dhav-mab1通過體內(nèi)誘生腹水法制得。

優(yōu)選的，所述金標抗體重懸液是按照1gbsa、10g蔗糖、5g海藻糖、0.05g酪蛋白、0.1g疊氮化鈉和1gpeg20000用0.01mol/l、ph8.0的pbs100ml溶解的方法制得。

優(yōu)選的，所述硝酸纖維素膜采用孔徑為8μm、層析速度為120-150s/4cm的硝酸纖維素膜，所述金標墊采用厚度為0.40±0.05mm、克重為68±10g/m²的聚酯纖維素膜，所述樣品墊采用厚度為0.78±0.05mm、克重為92±10g/m²的玻璃纖維素膜。

本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明利用可以同時識別1型和3型鴨甲型肝炎病毒的單克隆抗體，研制出了一種能夠同時檢測1型和3型鴨甲型肝炎病毒的膠體金試紙條。該試紙條具有良好的靈敏度、特異性、重復性和穩(wěn)定性，從而為臨床和基層單位不漏檢1型或3型鴨甲型肝炎病毒提供了一種廣譜、靈敏、特異、簡單、快速的檢測技術。

生物材料保藏

雜交瘤細胞株dhav-mab1于2017年1月18日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(簡稱cctcc，地址：湖北省武漢市武昌區(qū)八一路299號武漢大學)，保藏編號為cctccno：c201701。

本發(fā)明中1型鴨甲型肝炎病毒x株保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(地址：簡稱cctcc，地址：湖北省武漢市武昌區(qū)八一路299號武漢大學)，保藏日期2015年8月31日，保藏編號：cctccno：v201538，分類命名1型鴨甲肝病毒x株。

附圖說明

圖1為免疫小鼠脾細胞、sp2/0小鼠骨髓瘤細胞及飼養(yǎng)細胞的形態(tài)，a為免疫小鼠脾細胞，b為培養(yǎng)24h的飼養(yǎng)細胞，c為培養(yǎng)7d的飼養(yǎng)細胞，d為sp2/0小鼠骨髓瘤細胞。

圖2為融合后的雜交瘤細胞，1為培養(yǎng)5d后的雜交瘤細胞；2為培養(yǎng)9d后的雜交瘤細胞。

圖3為純化腹水的sds-page分析，其中m為蛋白marker，1為雜交瘤細胞株dhav-mab1的純化腹水。

圖4為單克隆抗體的親和力常數(shù)測定。

圖5為膠體金顆粒與金標單克隆抗體的紫外光譜。

圖6為膠體金試紙條的組裝示意圖。

圖7為膠體金試紙條的兔抗1型鴨甲型肝炎病毒多抗包被濃度優(yōu)化，1-6分別為多抗?jié)舛?.6mg/ml、0.8mg/ml、1.0mg/ml、1.2mg/ml、1.4mg/ml和1.6mg/ml。

圖8為膠體金試紙條的羊抗鼠igg包被濃度優(yōu)化，1-6分別為羊抗鼠igg濃度0.2mg/ml、0.6mg/ml、1.0mg/ml、1.4mg/ml、1.8mg/ml和2.0mg/ml，7為陰性。

圖9為膠體金試紙條的金標單克隆抗體包被濃度優(yōu)化，1-8分別為1ml金標單克隆抗體溶液離心后的沉淀用100μl、150μl、200μl、250μl、300μl、350μl、400μl和450μl金標抗體重懸液稀釋。

圖10為膠體金試紙條檢測1型鴨甲型肝炎病毒的靈敏度試驗結果，1-9分別為陽性鴨胚尿囊液(0.6mg/ml)按1:1、1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128和1:256稀釋，10為陰性對照。

圖11為膠體金試紙條檢測3型鴨甲型肝炎病毒的靈敏度試驗結果，1-7分別為陽性鴨胚尿囊液(0.3mg/ml)按1:1、1:2、1:4、1:8、1:16、1:32和1:64稀釋，8為陰性對照。

圖12為膠體金試紙條檢測1型和3型鴨甲型肝炎病毒的特異性試驗結果，1-5和7分別為3型鴨甲型肝炎病毒cz160312株、ql株、ql13株、my02株、ya151006株和sd151227株，6和8-10分別為1型鴨甲型肝炎病毒bzb株、cd1231株、dy0903株和x株，11為陰性對照。

圖13為膠體金試紙條檢測鴨常見的其它致病病原的特異性試驗結果。

圖14為膠體金試紙條檢測1型和3型鴨甲型肝炎病毒的重復性試驗結果，1-3分別為第1、2、3批次的膠體金試紙條，a為檢測1型鴨甲型肝炎病毒；b為檢測3型鴨甲型肝炎病。

圖15為膠體金試紙條的穩(wěn)定性試驗結果，1-3分別為保存1、2、3個月。

具體實施方式

為了使本發(fā)明的目的、技術方案和有益效果更加清楚，下面將結合附圖對本發(fā)明的優(yōu)選實施例進行詳細的描述。

優(yōu)選實施例中使用的主要材料如下：

1、細胞、菌株與毒株

sp2/0小鼠骨髓瘤細胞購自中國科學院細胞庫；1型鴨甲型肝炎病毒(bzb株、cd1231株、dy0903株和x株)、3型鴨甲型肝炎病毒(cz160312株、ql株、ql13株、my02株、ya151006株和sd151227株)、鴨病毒性腸炎病毒(dpvchv株)、鴨乙肝病毒(dhbv)、鴨坦布蘇病毒(dtmuv)、小鵝瘟病毒(gpv)、鴨大腸桿菌(e.coli,保藏號：cvcc83003)、鴨沙門氏菌(se,保藏號：cmcc50083)、鴨疫里默氏桿菌(rach-1株)均由四川農(nóng)業(yè)大學禽病防治研究中心保存提供；1型鴨甲型肝炎病毒x株保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(地址：湖北省武漢市武昌區(qū)八一路299號武漢大學)，保藏日期2015年8月31日，保藏編號：cctccno：v201538，分類命名1型鴨甲肝病毒x株。

2、試驗動物

6-8周齡和10-12周齡spfbalb/c雌性小鼠購自成都達碩實驗動物有限公司；10日齡鴨胚購自四川農(nóng)業(yè)大學農(nóng)場。

3、試劑與材料

hat培養(yǎng)基添加劑(50×)、聚乙二醇(peg1450)、弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑均為sigma公司產(chǎn)品；胎牛血清(fbs)和rpmi1640培養(yǎng)基為gibco公司產(chǎn)品；牛血清白蛋白(bsa)為biosharp公司產(chǎn)品；鼠單克隆抗體ig類亞類鑒定酶標二抗套裝購自北京博奧龍免疫技術有限公司；一次性細胞瓶、細胞培養(yǎng)板和elisa酶標板購自美國corning公司。

兔抗1型鴨甲型肝炎病毒多抗由四川農(nóng)業(yè)大學禽病防治研究中心保存提供；20nm膠體金溶液、玻璃纖維素膜(ma0280、gl0194)、硝酸纖維素(nc)膜(sartoriuscn140，sartoriuscn95，vivid170和millipore135)、樣品墊(gl-b03和gl-b04)、吸收墊(h5072)、底板(db-6)、白色塑料卡(a-9)和銜接膠帶均購自上海杰一生物技術有限公司；玻璃纖維素膜(cb-0801、sb06、vl78)購自上海金標生物科技有限公司。

4、儀器設備

超純水儀(waterpro，美國labconco公司)；核酸蛋白檢測儀(smartspec3000，美國bio-rad公司)；凝膠成相系統(tǒng)(geldoc3000，美國bio-rad公司)；倒置熒光顯微鏡(te2000-u，日本nikon公司)；二氧化碳培養(yǎng)箱(3951reach-in，美國thermofisherscientific公司)；酶標儀(model680，美國bio-rad公司)。

三維平面點膜噴金儀(hm3030，上海金標生物科技有限公司)；壓殼機(yk725，上海金標生物科技有限公司)；微電腦自動斬切機(上海金標生物科技有限公司)。

實施例1、雜交瘤細胞株dhav-mab1的獲得與鑒定

一、1型鴨甲型肝炎病毒的繁殖及純化

將1型鴨甲型肝炎病毒x株(保藏號為cctccno：c201538)的病毒液用生理鹽水做適當稀釋，用0.22μm微孔濾膜過濾，通過尿囊腔接種于10日齡的鴨胚，0.1ml/枚；另取5枚10日齡的鴨胚作為對照組接種生理鹽水；37℃條件下孵育，棄去接種24h內(nèi)死亡鴨胚，以后每天照蛋2次，觀察3-5d；收集接種后36-72h死亡并且病變明顯的鴨胚尿囊液，-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

取上述凍存的鴨胚尿囊液，反復凍融3次后，于4℃、6000r/min離心15min，棄去沉淀；在上清液中加入等量氯仿強烈振搖20min，于4℃、6000r/min離心20min，取上清液，重復上述氯仿抽提操作3次以除去脂類及一些雜蛋白；將上清液于4℃、40000r/min離心2h，收獲沉淀并懸浮于0.01mol/l、ph7.4的pbs中，用紫外分光光度計測定其在260nm和280nm處的光密度，計算純化的1型鴨甲型肝炎病毒的濃度，分裝，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

二、小鼠免疫

以純化的1型鴨甲型肝炎病毒為免疫原，免疫6-8周齡的balb/c雌性小鼠。首次免疫(第1d)，按照每只小鼠100μg1型鴨甲型肝炎病毒的劑量與弗氏完全佐劑等體積混合并充分乳化，背部皮下多點注射；第二次免疫(第14d)，用弗氏不完全佐劑處理相同劑量的1型鴨甲型肝炎病毒進行背部皮下多點注射；第三次免疫(第28d)，用弗氏不完全佐劑處理相同劑量的1型鴨甲型肝炎病毒進行背部皮下多點注射。第三次免疫后10d，從小鼠尾靜脈采血，37℃靜置2h，4℃過夜，之后5000r/min離心10min分離血清，采用間接elisa方法檢測血清抗體效價，選取血清效價達到1:10⁴以上的balb/c小鼠進行細胞融合。細胞融合前3d，小鼠腹腔注射無佐劑1型鴨甲型肝炎病毒50μg/只進行加強免疫。

間接elisa方法如下：將純化的1型鴨甲型肝炎病毒用0.05mol/l、ph9.6的碳酸鹽緩沖液按體積比1:800稀釋后加入酶標板，100μl/孔(187.5ng/孔)，4℃包被過夜，pbs-t洗滌，每孔加入0.01g/mlbsa溶液200μl，37℃封閉2h，pbs-t洗滌，每孔加入100μl用0.01mol/l、ph7.4的pbs按體積比1:800稀釋的免疫小鼠血清為一抗，37℃孵育30min，pbs-t洗滌，每孔加入100μl用0.01mol/l、ph7.4的pbs按體積比1:5000稀釋的hrp標記羊抗鼠igg，37℃孵育1h，洗滌液洗滌，每孔加入tmb顯色液100μl，37℃顯色10min，每孔加入2mol/lh2so4溶液50μl終止反應，酶標儀以雙波長形式讀取od450-od630值。試驗孔的od450-od630值記為p，陰性對照孔的od450-od630值記為n，計算p/n值，若p/n值≥2.1為陽性，反之為陰性。

三、細胞融合

將sp2/0骨髓瘤細胞和免疫小鼠脾細胞按1:5的比例混勻，放入50ml離心管中，1800r/min離心5min，棄去上清液，將離心管置37℃水浴中，在60s-90s間緩慢勻速滴加37℃預熱的peg14501ml，加畢在37℃水浴中靜置90s，再加入37℃預熱的無血清rpmi1640培養(yǎng)液終止融合作用，800r/min離心5min，棄去上清液，細胞沉淀用37℃預熱的rpmi1640培養(yǎng)液洗滌后，用含20％胎牛血清的hat選擇培養(yǎng)液重懸，加入到含有飼養(yǎng)細胞的96孔細胞板中，100μl/孔，置37℃、5％co2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。

飼養(yǎng)細胞制備：取10-12周齡以上未免疫的balb/c小鼠，拉頸處死，流動清水沖洗，浸泡于75％酒精中5-10min進行消毒，將消毒后的小鼠置超凈工作臺上，剪開腹部皮膚，使腹膜暴露出來，用鑷子提起腹膜，將37℃預熱的培養(yǎng)液約5ml注射到小鼠腹腔內(nèi)，小心按摩小鼠腹部約3min，抽出，重復操作幾次，抽出液置10ml離心管內(nèi)，1500r/min離心，棄去上清液，細胞沉淀用培養(yǎng)液重懸，進行活細胞計數(shù)后調(diào)整至細胞數(shù)為2-3×10⁵個/ml，按100μl/孔加入96孔細胞板中，于37℃、5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，次日觀察無污染即可使用。

觀察發(fā)現(xiàn)，免疫小鼠脾細胞呈圓形，較小，與sp2/0骨髓瘤細胞的形態(tài)相似；小鼠腹腔飼養(yǎng)細胞在過夜培養(yǎng)后呈梭形，梭形細胞數(shù)量越多說明飼養(yǎng)細胞的狀態(tài)越好，為融合細胞生長提供的條件也越好(圖1)。

四、雜交瘤細胞的篩選及亞克隆

融合后的雜交瘤細胞培養(yǎng)一周后用hat選擇培養(yǎng)液進行半換液，2d后取細胞培養(yǎng)上清液，采用前述間接elisa方法進行陽性孔的篩選。篩選出的陽性孔細胞采用有限稀釋法進行3-4次亞克隆，使陽性細胞率達到100％。將能穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞株及時擴大培養(yǎng)并凍存。

雜交瘤細胞融合后第3d可見克隆細胞集團，大部分的培養(yǎng)孔中生長的克隆細胞集團數(shù)多于2個，隨著時間推移，克隆細胞集團數(shù)量繼續(xù)增多(見圖2)。陽性孔細胞經(jīng)過3次亞克隆以后，最終得到5株能夠穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞株。

五、雜交瘤細胞株dhav-mab1的穩(wěn)定性測定

將5株雜交瘤細胞株中命名為dhav-mab1的雜交瘤細胞株進行連續(xù)的傳代培養(yǎng)，分別取其第1代、第5代和第10代細胞的培養(yǎng)上清液，以及凍存1個月后復蘇細胞的培養(yǎng)上清液，以sp2/0小鼠骨髓瘤細胞培養(yǎng)上清液為陰性對照，采用前述間接elisa方法對該雜交瘤細胞株進行抗體分泌穩(wěn)定性檢測。

結果見表1，第1代、第5代、第10代細胞培養(yǎng)上清液和凍存1個月后復蘇細胞培養(yǎng)上清液的od450-od630值無明顯差異，表明雜交瘤細胞株dhav-mab1具有穩(wěn)定分泌單克隆抗體的能力。

表1雜交瘤細胞株dhav-mab1傳代和凍存后穩(wěn)定性測定

雜交瘤細胞株dhav-mab1于2017年1月18日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(簡稱cctcc，地址：湖北省武漢市武昌區(qū)八一路299號武漢大學)，保藏編號為cctccno：c201701。

實施例2、單克隆抗體的制備與鑒定

一、單克隆抗體的大量制備與純化

取10-12周齡的balb/c雌性小鼠，預先用弗氏不完全佐劑致敏，0.5ml/只，5d后腹腔注入雜交瘤細胞株dhav-mab10.5ml/只(2.0×10⁶個/ml)，7-10d后，當小鼠腹部顯著增大時，抽取小鼠腹水，37℃放置2h，4℃過夜，次日以3000r/min離心15min，收集上清液，-20℃保存?zhèn)溆谩Ｃ扛?d可以抽取腹水1次，可以反復抽取小鼠腹水多次。將保存的腹水先用辛酸-硫酸銨沉淀法進行粗提，再用rproteina/gbeads過柱純化，得到純化腹水。

取純化腹水，采用sds-page檢測單克隆抗體的純化效果，結果見圖3。

二、單克隆抗體的亞型鑒定

將雜交瘤細胞株dhav-mab1培養(yǎng)上清液和純化腹水作倍比稀釋，按照鼠單克隆抗體ig類亞類鑒定酶標二抗套裝說明書，采用前述間接elisa方法進行單克隆抗體ig亞型的鑒定，od450-od630值最高孔所對應的酶標二抗為雜交瘤細胞株dhav-mab1分泌的單克隆抗體亞型。

結果見表2，雜交瘤細胞株dhav-mab1分泌的單克隆抗體的亞型屬于igg1。

表2單克隆抗體的亞型鑒定結果

三、單克隆抗體的效價測定

將雜交瘤細胞株dhav-mab1培養(yǎng)上清液和純化腹水作倍比稀釋，采用前述間接elisa方法測定單克隆抗體的效價，用sp2/0小鼠骨髓瘤細胞培養(yǎng)上清液和陰性腹水平行稀釋作為陰性對照。

結果顯示，雜交瘤細胞株dhav-mab1培養(yǎng)上清液的單克隆抗體效價為1:1280；純化腹水的單克隆抗體效價為1:819200。

四、單克隆抗體的特異性鑒定

在37℃、180r/min恒定條件下，對常見鴨致病菌(鴨疫里默氏桿菌、鴨沙門氏菌、鴨大腸桿菌)進行增殖培養(yǎng)24h后，超聲破碎，離心，取各菌株培養(yǎng)上清液包被酶標板；將鴨致病病毒(1型鴨甲型肝炎病毒、3型鴨甲型肝炎病毒、鴨病毒性腸炎病毒、鴨乙肝病毒、鴨坦布蘇病毒、小鵝瘟病毒)的病毒液包被酶標板；以pbs為空白對照；以雜交瘤細胞株dhav-mab1培養(yǎng)上清液為一抗，同時以sp2/0小鼠骨髓瘤細胞培養(yǎng)上清液為陰性對照，采用前述間接elisa方法進行單克隆抗體特異性鑒定。

結果見表3，雜交瘤細胞株dhav-mab1分泌的單克隆抗體不與鴨病毒性腸炎病毒、鴨乙肝病毒、鴨坦布蘇病毒、小鵝瘟病毒、鴨疫里默氏桿菌、鴨大腸桿菌、鴨沙門氏菌發(fā)生特異性反應，但與3型鴨甲型肝炎病毒發(fā)生交叉反應，說明雜交瘤細胞株dhav-mab1分泌的單克隆抗體可以同時識別1型和3型鴨甲型肝炎病毒并具有較好的特異性。

表3單克隆抗體的特異性鑒定結果

五、單克隆抗體的親和常數(shù)測定

將雜交瘤細胞株dhav-mab1培養(yǎng)上清液作倍比稀釋，100μl/孔，37℃孵育2h，采用前述間接elisa方法測定od450-od630值，繪制抗體稀釋倍數(shù)與od450-od630值的關系曲線，根據(jù)曲線中50％od450-630nm值所對應的抗體稀釋倍數(shù)，按公式kaff(l/mol)≈150000×a/[ag]計算親和常數(shù)(kaff)，式中a為50％od450-od630值所對應的抗體稀釋倍數(shù)，[ag]為抗體濃度。

結果見圖4，雜交瘤細胞株dhav-mab1分泌的單克隆抗體的親和常數(shù)為2.4×10¹⁰l/mol，具有較好的抗原結合能力。

實施例3、膠體金試紙條的制備與性能評價

一、金標單克隆抗體的制備和純化

1、單克隆抗體的處理

將純化的雜交瘤細胞株dhav-mab1誘生腹水置透析袋中，在0.01mol/l、ph7.4的pbs中4℃透析過夜，每隔4h更換透析液，然后4℃、10000r/min離心30min，取上清液，測定蛋白含量，即得同時識別1型和3型鴨甲型肝炎病毒的單克隆抗體，分裝，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2、金標單克隆抗體的制備

取20nm膠體金溶液1ml，加入0.1mol/lk2co3溶液12μl，攪拌混勻，加入前述同時識別1型和3型鴨甲型肝炎病毒的單克隆抗體34μg，攪拌混勻，靜置30min，再加入0.1g/mlbsa溶液至終濃度為0.01g/ml，攪拌混勻，靜置15min，得到金標單克隆抗體溶液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

3、金標單克隆抗體的純化

取1ml金標單克隆抗體溶液，于4℃、2000r/min離心15min，收集上清液，于4℃、9000r/min離心20min，棄去上清液，沉淀用金標抗體重懸液(由1gbsa、10g蔗糖、5g海藻糖、0.05g酪蛋白、0.1g疊氮化鈉和1gpeg20000用0.01mol/l、ph8.0的pbs100ml溶解制得)稀釋至原體積，于4℃、9000r/min離心20min，棄去上清液，沉淀重復上述操作1-2次，最后用金標抗體重懸液稀釋，4℃密封保存。

取純化的金標單克隆抗體，在波長400-660nm范圍內(nèi)掃描紫外光譜。結果見圖5，與未標記的膠體金顆粒相比，金標單克隆抗體的最大吸收峰向右移動了4nm，說明單克隆抗體已經(jīng)成功被膠體金標記。

二、膠體金試紙條的制備

制備采用雙抗體夾心法同時檢測1型和3型鴨甲型肝炎病毒的膠體金試紙條。試紙條由底板、硝酸纖維素(nc)膜、樣品墊、金標墊和吸收墊5個部分組成，其中nc膜上的質控線(c線)包被羊抗鼠igg，檢測線(t線)包被兔抗1型鴨甲型肝炎病毒多抗；金標墊包被金標單克隆抗體(見圖6)。當待測樣品中含有1型和/或3型鴨甲型肝炎病毒時，在層析過程中，病毒抗原先與金標墊上的金標單克隆抗體特異性結合，再與檢測線上的兔抗1型鴨甲型肝炎病毒多抗特異性結合，從而使檢測線呈現(xiàn)紅色條帶，而未與病毒抗原結合的金標單克隆抗體與質控線上的羊抗鼠igg特異性結合，從而使質控線也呈現(xiàn)紅色條帶；當待測樣品中不含有或含有低于最低檢測量的1型和/或3型鴨甲型肝炎病毒時，則檢測線不呈現(xiàn)紅色條帶，僅質控線呈現(xiàn)紅色條帶。

膠體金試紙條的具體制備方法如下：將羊抗鼠igg和純化的兔抗1型鴨甲型肝炎病毒多抗分別用0.01mol/l、ph7.4的pbs稀釋后，分別包被于nc膜上形成質控線和檢測線，37℃干燥過夜，再將nc膜用0.01g/mlbsa溶液于37℃封閉，干燥，4℃密封保存?zhèn)溆?；將純化的金標單克隆抗體溶液滴加于玻璃纖維素膜上，37℃干燥過夜，得到金標墊；將已包被并封閉處理的nc膜、金標墊、樣品墊、吸收墊干燥后依次粘在底板上，即制得膠體金試紙條。

1、純化的兔抗1型鴨甲型肝炎多抗的包被濃度優(yōu)化

將兔抗1型鴨甲型肝炎病毒多抗先用辛酸-硫酸銨沉淀法進行粗提，再用rproteina/gbeads過柱純化，得到純化的兔抗1型鴨甲型肝炎病毒多抗。將純化的兔抗1型鴨甲型肝炎病毒多抗用0.01mol/l、ph7.4的pbs稀釋至濃度分別為0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6mg/ml，包被于nc膜上形成檢測線，在其他條件不變的情況下制得膠體金試紙條，觀察試紙條的顯色情況，確定達到試紙條敏感度要求的兔抗1型鴨甲型肝炎病毒多抗的最佳包被濃度。結果見圖7，當兔抗1型鴨甲型肝炎病毒多抗的包被濃度為0.8mg/ml時，試紙條的顯色顏色較淺，不易觀察試驗結果，因此兔抗1型鴨甲型肝炎病毒多抗的最佳包被濃度為1.0mg/ml。

2、羊抗鼠igg的包被濃度優(yōu)化

將羊抗鼠igg用0.01mol/l、ph7.4的pbs稀釋至濃度分別為0.2、0.6、1.0、1.4、1.8、2.0mg/ml，包被于nc膜上形成質控線，在其他條件不變的情況下制得膠體金試紙條，觀察試紙條的顯色情況，確定達到試紙條敏感度要求的羊抗鼠igg的最佳包被濃度。結果見圖8，當羊抗鼠igg的包被濃度為0.6mg/ml時，試紙條的顯色顏色較淺，不易觀察試驗結果，因此羊抗鼠igg的最佳包被濃度為1.0mg/ml。

3、金標單克隆抗體的包被濃度優(yōu)化

取1ml金標單克隆抗體溶液，于4℃、2000r/min離心15min，收集上清液，于4℃、9000r/min離心20min，棄去上清液，沉淀用金標抗體重懸液稀釋至原體積，于4℃、9000r/min離心20min，棄去上清液，沉淀重復上述操作1-2次，最后分別用100、150、200、250、300、350、400、450μl金標抗體重懸液稀釋，得到純化的金標單克隆抗體溶液。將不同濃度的純化的金標單克隆抗體溶液分別滴加在相同大小的玻璃纖維素膜上形成金標墊，在其他條件不變的情況下制得膠體金試紙條，觀察試紙條的顯色情況，確定達到試紙條敏感度要求的金標單克隆抗體的最佳包被濃度。結果見圖9，當1ml金標單克隆抗體溶液離心后的沉淀用450μl的金標抗體重懸液稀釋時，試紙條的顯色顏色較淺，不易觀察試驗結果，因此金標單克隆抗體的最佳包被濃度為1ml金標單克隆抗體溶液離心后的沉淀用400μl金標抗體重懸液稀釋。

4、nc膜的優(yōu)化

分別采用sartoriuscn140、sartoriuscn95、vivid170和millipore135這4種型號的nc膜，在其他條件不變的情況下制得膠體金試紙條，觀察試紙條的顯色情況。結果見表4，sartoriuscn140和millipore135顯色均較快，在10min內(nèi)均可顯色，但是sartoriuscn140顯色后背景不干凈，有層析不完全的現(xiàn)象，因此優(yōu)選millipore135(系孔徑為8μm、層析速度為120-150s/4cm的nc膜)。

表4nc膜的優(yōu)化結果

5、玻璃纖維素膜的優(yōu)化

分別采用cb0801、sb06、vl78、ma0280、gl0194這5種型號的玻璃纖維素膜制備金標墊，再在其他條件不變的情況下制得膠體金試紙條，觀察不同玻璃纖維素膜上金標單克隆抗體的釋放情況。結果顯示，cb0801、sb06、vl78和gl0194上的金標單克隆抗體釋放不完全，有較多金標單克隆抗體殘留在膜上，且cb0801上的金標單克隆抗體釋放速度極慢，而ma0208上的金標單克隆抗體釋放完全，因此優(yōu)選ma0208(系厚度為0.40±0.05mm、克重為68±10g/m²的聚酯纖維素膜)。

6、樣品墊的優(yōu)化

分別采用gl-b03和gl-b04兩個貨號的樣品墊，在其他條件不變的情況下制得膠體金試紙條，將陰性、陽性鴨胚尿囊液滴加在樣品墊上，觀察兩種樣品墊的釋放情況。結果顯示，樣品在gl-03上流動速度較慢，不利于樣品與金標單克隆抗體的結合，因此優(yōu)選gl-04(系厚度為0.78±0.05mm、克重為92±10g/m²的玻璃纖維素膜)。

7、nc膜封閉時間的優(yōu)化

為了降低nc膜的非特異性吸附，在nc膜完成包被處理并干燥后，用0.01g/mlbsa溶液于37℃分別封閉0、30、60、120min，干燥，然后在其他條件不變的情況下制得膠體金試紙條，觀察試紙條的顯色情況，確定nc膜的最佳封閉時間。結果顯示，封閉0min和30min的試紙條拖帶比較嚴重，而封閉60min和120min的試紙條顯色效果均較好，二者無明顯差異，因此nc膜的最佳封閉時間為60min。

三、膠體金試紙條的性能評價

1、膠體金試紙條的檢測方法及結果判定

取100μl樣品滴加到樣品墊上，5-10min后觀察顯色結果。如果試紙條的檢測線和質控線均顯示出清晰的紅色條帶，則判定檢測結果為陽性，樣品中1型和/或3型鴨甲型肝炎病毒的含量越高，檢測線顯色就越深；如果試紙條只有質控線顯示出紅色條帶，則判定檢測結果為陰性；如果試紙條的質控線未顯示出紅色條帶，則判定本次檢測失敗，需重新進行檢測。

2、鴨胚尿囊液或菌體培養(yǎng)液的裂解處理

向鴨胚尿囊液或菌體培養(yǎng)液樣品中加入等體積的裂解液(0.01mol/l、ph7.4的pbs，含2％tritonx-100)，作用5min，劇烈振蕩，4℃、8000r/min離心5min，收集上清液用于檢測。

3、膠體金試紙條的靈敏度試驗

將1型或3型鴨甲型肝炎病毒感染鴨胚尿囊液經(jīng)裂解處理后，用bca法測定病毒蛋白的濃度，按照1:1、1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64和1:128倍比稀釋后，用膠體金試紙條按前述檢測方法進行檢測，觀察顯色結果。

1型鴨甲型肝炎病毒感染鴨胚尿囊液的檢測結果見圖10，經(jīng)裂解處理后測得的病毒蛋白濃度為0.6mg/ml，按照1:64稀釋時顯色較淺，按照1:128稀釋時只有質控線顯色，因此，膠體金試紙條對1型鴨甲型肝炎病毒的最低檢出量為0.9μg。3型鴨甲型肝炎病毒感染鴨胚尿囊液的檢測結果見圖11，經(jīng)裂解處理后測得的病毒蛋白濃度為0.3mg/ml，按照1:16稀釋時顯色較淺，按照1:32稀釋時只有質控線顯色，因此，膠體金試紙條對3型鴨甲型肝炎病毒的最低檢出量為1.8μg。上述結果表明，本發(fā)明制備的膠體金試紙條具有良好的檢測靈敏度。

4、膠體金試紙條的特異性試驗

用膠體金試紙條按前述檢測方法分別檢測經(jīng)裂解處理的正常鴨胚尿囊液、1型鴨甲型肝炎病毒感染鴨胚尿囊液、3型鴨甲型肝炎病毒感染鴨胚尿囊液、鴨病毒性腸炎病毒感染鴨胚尿囊液、鴨坦布蘇病毒感染鴨胚尿囊液、小鵝瘟病毒感染鴨胚尿囊液、鴨疫里默氏桿菌的菌體培養(yǎng)液、鴨大腸桿菌的菌體培養(yǎng)液和鴨沙門氏菌的菌體培養(yǎng)液，觀察顯色結果。

1型或3型鴨甲型肝炎病毒的檢測結果見圖12，膠體金試紙條對4株1型鴨甲型肝炎病毒(bzb株、cd1231株、dy0903株和x株)和6株3型鴨甲型肝炎病毒(cz160312株、ql株、ql13株、my02株、ya151006株和sd151227株)的檢測結果均呈陽性。鴨常見的其它致病病原的檢測結果見圖13，膠體金試紙條對正常鴨胚尿囊液、鴨病毒性腸炎病毒、鴨坦布蘇病毒、小鵝瘟病毒、鴨疫里默氏桿菌、鴨大腸桿菌和鴨沙門氏菌的檢測結果均呈陰性。上述結果表明，本發(fā)明制備的膠體金試紙條具有良好的檢測特異性。

5、膠體金試紙條的重復性試驗

用3個不同批次的膠體金試紙條，按前述檢測方法分別同時檢測陽性鴨胚尿囊液(1型鴨甲型肝炎病毒感染鴨胚尿囊液、3型鴨甲型肝炎病毒感染鴨胚尿囊液)及陰性鴨胚尿囊液，每個批次重復檢測3次，觀察顯色結果。

結果見圖14，3個不同批次膠體金試紙條各重復3次的檢測結果之間無明顯差異，表明本發(fā)明制備的膠體金試紙條具有良好的批間和批內(nèi)檢測重復性。

6、膠體金試紙條的穩(wěn)定性試驗

分別將膠體金試紙條密封保存于4℃、室溫和37℃，每隔一個月分別用鴨甲型肝炎病毒陰性鴨胚尿囊液和1型鴨甲型肝炎病毒陽性鴨胚尿囊液按前述檢測方法進行檢測，觀察顯色結果。

結果見圖15，膠體金試紙條在4℃、室溫和37℃分別保存1、2、3個月后的陰性、陽性檢測效果均較好，檢測結果間無明顯差異，表明本發(fā)明制備的膠體金試紙條具有良好的穩(wěn)定性，在4-37℃至少可以保存3個月。

7、臨床樣品的檢測

對養(yǎng)殖場送檢的162份樣品，無菌采集鴨病料后，剪碎，放入盛有約500μl生理鹽水的滅菌ep管中，反復凍融3次，劇烈振蕩1-3min，加入等體積的裂解液(0.01mol/l、ph7.4的pbs，含2％tritonx-100)，作用5min，劇烈振蕩，4℃、8000r/min離心5min，收集上清液，分別用膠體金試紙條與rt-pcr方法進行檢測。

結果見表5，在rt-pcr中檢測出的115個陽性樣品中，膠體金試紙條檢測出111個陽性；在rt-pcr檢測出的47個陰性樣品中，膠體金試紙條檢測出1個陽性，46個陰性；兩種檢測方法的陽性符合率為96.5％(111/115)，陰性符合率為97.9％(46/47)。

表5膠體金試紙條對臨床樣品的檢測結果

最后說明的是，以上實施例僅用于說明本發(fā)明的技術方案，并不構成對本發(fā)明內(nèi)容的限制。盡管通過上述實施例已經(jīng)對本發(fā)明做了較為詳細的例舉，但本領域技術人員仍然可以根據(jù)發(fā)明內(nèi)容部分和實施例部分所描述的技術內(nèi)容，在形式上和細節(jié)上對其作出各種各樣的改變，而不偏離所附權利要求書所限定的本發(fā)明的精神和范圍。