本發(fā)明涉及一種基于核酸適配體的卡那霉素快速檢測(cè)試紙及其制備方法和應(yīng)用，屬于分析化學(xué)及醫(yī)藥、環(huán)境和食品安全檢測(cè)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

卡那霉素（kanamycin）是一種廣譜型氨基糖苷類抗生素，分子式為c18h36n4o11，分子量為582.58，能有效的治療由革蘭氏陽(yáng)性或革蘭氏陰性細(xì)菌所引起的感染。然而，過(guò)度使用卡那霉素或過(guò)度消費(fèi)含有卡那霉素的動(dòng)物源性食品，會(huì)導(dǎo)致卡那霉素通過(guò)食物鏈在人體內(nèi)累積，并且可能引起一些相當(dāng)嚴(yán)重的副作用，如影響耳蝸神經(jīng)、誘發(fā)耳毒癥、導(dǎo)致永久性的聽(tīng)力損失；同時(shí)對(duì)神經(jīng)肌肉和造血系統(tǒng)也可能產(chǎn)生一定的影響；此外，卡那霉素亦可引起對(duì)腎臟的損害，發(fā)生腎功能衰竭。因此，應(yīng)盡快建立一種能夠用于檢測(cè)食品中卡那霉素殘留的有效方法，進(jìn)一步提高動(dòng)物源性食品的安全性。

現(xiàn)在已經(jīng)研究出多種用于檢測(cè)卡那霉素殘留的方法，例如酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（elisa）、毛細(xì)管電泳（cze）、高效液體色譜（hplc）、表面等離子體共振（spr）和電化學(xué)方法等。然而，上述方法的應(yīng)用仍然部分受限，如耗時(shí)長(zhǎng)、需要大型儀器設(shè)備和消耗相對(duì)大量的試劑、成本高、易受干擾物的影響、對(duì)操作人員要求較高、不適合現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用等。因此，建立一種卡那霉素簡(jiǎn)單，快速，經(jīng)濟(jì)和超靈敏檢測(cè)的方法十分重要，而檢測(cè)試紙的研制為快速檢測(cè)提供了可能。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是克服上述不足之處，提供一種基于核酸適配體的卡那霉素快速檢測(cè)試紙及其制備方法和應(yīng)用，將膠體金標(biāo)記層析試紙條技術(shù)、納米生物材料構(gòu)建技術(shù)及核酸適配體等諸多技術(shù)的優(yōu)勢(shì)聯(lián)合起來(lái)，制備一種用于簡(jiǎn)便、快速、成本低、靈敏度高的卡那霉素殘留的檢測(cè)試紙并應(yīng)用于樣品檢測(cè)。

本發(fā)明的技術(shù)方案：一種基于核酸適配體的卡那霉素快速檢測(cè)試紙，包括樣品墊、金標(biāo)墊、硝酸纖維素膜、吸水墊、pvc底板、檢測(cè)線和質(zhì)控線；所述pvc底板上依次粘貼樣品墊、金標(biāo)墊、硝酸纖維素膜、吸水墊，其中樣品墊搭接金標(biāo)墊，硝酸纖維素膜直接設(shè)置于pvc底板上，硝酸纖維素膜一端搭接金標(biāo)墊，硝酸纖維素膜另一端搭接吸水墊；所述硝酸纖維素膜上依次還設(shè)有檢測(cè)線和質(zhì)控線。

所述樣品墊、金標(biāo)墊、硝酸纖維素膜、吸水墊、各搭接部重疊段為2mm。

所述金標(biāo)墊的制備過(guò)程為：分別制備金、銀納米粒子并分別通過(guò)au-s鍵和ag-s鍵的共價(jià)作用將apt、dna1與金、銀納米顆粒偶聯(lián)形成功能化的納米粒子；

其中apt及dna1序列如下：

適配體apt：5’-hs-(ch2)6-tgggggttgaggctaagccga-biotin-3’；

dna1：5’-hs-(ch2)6-tcagtcggcttagccgtccaacgtcagatcc-3’。

所述在硝酸纖維素膜上靠近金標(biāo)墊的一端用預(yù)先孵育過(guò)的鏈霉親和素和生物素修飾dna2來(lái)劃?rùn)z測(cè)線，在靠近吸水墊一端用鏈霉親和素來(lái)劃質(zhì)控線；

其中dna2：5’-biotin-ccgatggatctgacgt-3’。

所述基于核酸適配體的卡那霉素快速檢測(cè)試紙的制備方法，步驟如下：金納米粒子的制備及功能化、銀納米粒子的制備及功能化、金標(biāo)墊和樣品墊的預(yù)處理、硝酸纖維素膜的預(yù)處理、試紙條的組裝、檢測(cè)試紙條顯色情況；具體步驟為：

（1）金納米粒子的制備及功能化：

制備金納米粒子之前所有的玻璃儀器均用王水浸泡30min，然后用蒸餾水洗凈，超純水浸泡12h，烘干備用；將100ml質(zhì)量濃度0.01%的氯金酸加入250ml圓底燒瓶中，攪拌并加熱至沸騰，在劇烈攪拌下快速加入3.5ml質(zhì)量濃度1%的檸檬酸三鈉，繼續(xù)加熱攪拌15min后溶液變成酒紅色，停止加熱，繼續(xù)攪拌30min后靜置，室溫自然冷卻，得到粒徑13nm的金納米粒子溶液，4℃保存?zhèn)溆茫?/p>

將上述金納米粒子溶液在沸水浴條件下繼續(xù)加熱并不斷攪拌，使水分蒸發(fā)，直至燒瓶?jī)?nèi)的溶液為20ml后停止沸水浴，室溫自然冷卻，得到濃縮的金納米粒子，4℃保存?zhèn)溆茫?/p>

將15μl1mmol/l的三(2-羧乙基)膦tcep與30μl100μmol/l的適配體apt混合，進(jìn)行巰基化反應(yīng)，然后加入到1ml濃縮的金納米粒子中，室溫下攪拌1h；接著將30μl15mmol/l的三磷酸脫氧腺苷datp加入到上述溶液中，室溫?cái)嚢?5min；震蕩完成后加入20μl1mol/l的nacl溶液室溫放置30min，4℃保存6h來(lái)增加結(jié)合的穩(wěn)定性；4℃、8000r/min離心10min去除多余的試劑；重懸于1ml含0.5%tween-20、5%bsa、2%蔗糖、0.5%tritonx-100的20mmol/l的na3po4緩沖液中，4℃避光保存?zhèn)溆茫?/p>

（2）銀納米粒子的制備及其功能化：

分別配制0.2mmol/l的硝酸銀，2.0mmol/l的脫氧膽酸鈉及20mmol/l的硼氫化鈉，將硝酸銀和脫氧膽酸鈉溶液以1︰2的摩爾比在ph7的條件下陳化24h；將陳化后的溶液加入到圓底燒瓶中，在冰浴條件劇烈攪拌作用下逐滴滴加新鮮配制的硼氫化鈉反應(yīng)10min，反應(yīng)后得到黃色膠體銀溶液，4℃避光保存?zhèn)溆茫?/p>

取1ml膠體銀溶液于1.5ml的離心管中，在4℃、12000r/min條件下離心10min去除上清，用200μl含0.5%tween-20、5%bsa、2%蔗糖、0.5%tritonx-100的20mmol/l的na3po4緩沖液重懸后即可得到5倍濃縮的膠體銀溶液。

將15μl1mmol/l的tcep與20μl100μmol/l的dna1混合，進(jìn)行巰基化反應(yīng)，然后加入到1ml5倍濃縮的膠體銀溶液，室溫下攪拌1h；接著將30μl15mmol/l的datp加入到上述溶液中，室溫?cái)嚢?5min；震蕩完成后逐滴滴加20μl1mol/l的nacl溶液室溫放置30min，4℃保存6h來(lái)增加結(jié)合的穩(wěn)定性；4℃、8000r/min離心10min去除多余的試劑，重懸于1ml含0.5%tween-20、5%bsa、2%蔗糖、0.5%tritonx-100的20mmol/l的na3po4緩沖液，4℃避光保存?zhèn)溆茫?/p>

（3）樣品墊、金標(biāo)墊預(yù)處理：

將金標(biāo)墊及樣品墊裁剪成合適的大小后在含1%nacl、0.5%tween-20、1%bsa、2%蔗糖，1%tritonx-100的0.1mol/ltris-hcl(ph8.2)緩沖液中完全浸泡30min，然后放到37℃恒溫干燥箱中烘干后，干燥條件保存、備用；

在處理好的金標(biāo)墊上滴加功能化金、銀納米粒子，即aunps-apt和agnps-dna1，其中dna1與apt部分互補(bǔ)，37℃恒溫干燥箱中烘干，干燥條件保存，備用；

（4）硝酸纖維素膜預(yù)處理：

將鏈霉親和素與生物素修飾的dna2以1︰4的摩爾比例混合均勻后在4℃的條件下放置2h，使鏈霉親和素和dna2上修飾的生物素充分結(jié)合；取結(jié)合好的sa-biotin-dna21μl在硝酸纖維素膜上靠近金標(biāo)墊一端劃?rùn)z測(cè)線t線；取1μl鏈霉親和素sa在硝酸纖維素膜上靠近吸水墊一端劃質(zhì)控線c線，將劃好t、c線的硝酸纖維素膜在37℃下烘干0.5h，干燥條件下保存?zhèn)溆茫?/p>

（5）試紙條的組裝：膠體金層析試紙條的組成材料主要包括pvc底板、樣品墊、金標(biāo)墊、硝酸纖維素膜、吸水墊五部分，先將硝酸纖維素膜粘貼到pvc底板的對(duì)應(yīng)位置上，輕壓，使二者緊密結(jié)合，將處理過(guò)的樣品墊、金標(biāo)墊，分別粘貼在pvc底板的對(duì)應(yīng)位置上，樣品墊與金標(biāo)墊，金標(biāo)墊與硝酸纖維素膜各重疊2mm，最后將吸水墊與硝酸纖維素膜重疊2mm粘貼到pvc底板上，多余部分裁掉；然后各部分粘貼牢固，裁成規(guī)格為65mm×4mm的試紙條，干燥條件保存，備用。

所述基于核酸適配體的卡那霉素快速檢測(cè)試紙的檢測(cè)方法，首先將制備好的試紙條置于試紙條卡盒中，在加樣孔滴加待檢測(cè)的溶液于樣品墊上后，液體隨毛細(xì)管作用向吸水墊移動(dòng)，液體經(jīng)過(guò)硝酸纖維素膜上的檢測(cè)線和質(zhì)控線；待試紙條顯色完全后，肉眼觀察t線顏色深淺可定性或半定量分析，或?qū)⒃嚰垪l置于膠體金定量?jī)x中進(jìn)行掃描，得到檢測(cè)線和質(zhì)控線的峰面積值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線定量測(cè)定出檢測(cè)液的卡那霉素濃度。

具體步驟如下：將制備好的試紙條在樣品墊一端滴加檢測(cè)液，由于毛細(xì)管的虹吸作用檢測(cè)液會(huì)從樣品墊不斷向吸水墊移動(dòng)經(jīng)過(guò)硝酸纖維素膜，在t線和c線的位置聚集金納米粒子從而在硝酸纖維素膜上形成兩條紅色條帶；

當(dāng)檢測(cè)液中不存在目標(biāo)物卡那霉素時(shí)，t線上的dna2會(huì)與dna1雜交且dna1與apt部分互補(bǔ)，因此在t線上會(huì)捕獲到功能化的金納米粒子而顯色，c線上的鏈霉親和素可以根據(jù)鏈霉素-生物素作用使金納米粒子在c線上聚集而顯色，此時(shí)，t、c線均顯色；

當(dāng)檢測(cè)液中存在卡那霉素時(shí)，apt會(huì)改變其空間構(gòu)象特異性地與卡那霉素結(jié)合，而不再與dna1結(jié)合，aunps-apt會(huì)被置換下來(lái)，使t線顯色變淺或不顯色，apt與卡那霉素結(jié)合后其3’端生物素依然暴露在外，因此可以被c線上的鏈霉親和素捕獲從而顯色，此時(shí)，t線顯色較淺或完全褪色、c線顯色正常；

最后將試紙條置于膠體金定量?jī)x中檢測(cè)其t、c線的顯色強(qiáng)度，可以根據(jù)t線的顯色情況來(lái)判斷所檢測(cè)的卡那霉素的濃度。

本發(fā)明的有益效果：①該方法利用金、銀納米粒子易于制備修飾并且可以將信號(hào)雙重放大以及適配體的構(gòu)象變化實(shí)現(xiàn)檢測(cè)線的光學(xué)信號(hào)的強(qiáng)弱變化，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)卡那霉素的檢測(cè)；②試紙法檢測(cè)卡那霉素簡(jiǎn)便快速，可隨時(shí)隨地檢測(cè)，結(jié)果可視化，檢測(cè)時(shí)間短，采用本方法，只需把試紙條樣品墊一端插入到檢測(cè)液中，10min內(nèi)即可獲得實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可以大幅度的提高檢測(cè)效率；③通過(guò)膠體金定量?jī)x讀數(shù)可進(jìn)行定量分析，對(duì)動(dòng)物源性食品中卡那霉素殘留檢測(cè)具有重要意義。

附圖說(shuō)明

圖1本發(fā)明試紙條組裝圖。1、樣品墊；2、金標(biāo)墊；3、硝酸纖維素膜；4、吸水墊；5、pvc底板；6、檢測(cè)線；7、質(zhì)控線。

圖2基于核酸適配體的卡那霉素膠體金快速檢測(cè)試紙檢測(cè)陰性原理圖。

圖3基于核酸適配體的卡那霉素膠體金快速檢測(cè)試紙檢測(cè)陽(yáng)性原理圖。

圖4用試紙條對(duì)不同濃度卡那霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液的檢測(cè)圖。

圖5在標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)液中，t線峰面積與卡那霉素濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。

圖6用試紙條對(duì)含不同濃度卡那霉素的牛奶樣品的檢測(cè)圖。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1一種基于核酸適配體的卡那霉素快速檢測(cè)試紙

金納米粒子的制備及功能化、銀納米粒子的制備及功能化、金標(biāo)墊和樣品墊的預(yù)處理、硝酸纖維素膜的預(yù)處理、試紙條的組裝、檢測(cè)試紙條顯色情況。具體步驟為：

（1）金納米粒子的制備及功能化：

制備金納米粒子之前所有的玻璃儀器均用王水浸泡30min，然后用蒸餾水洗凈，超純水浸泡12h，烘干備用；將100ml0.01%的氯金酸加入250ml圓底燒瓶中，攪拌并加熱至沸騰，在劇烈攪拌下快速加入3.5ml1%的檸檬酸三鈉，繼續(xù)加熱攪拌15min后溶液變成酒紅色，停止加熱，繼續(xù)攪拌30min后靜置，室溫自然冷卻，得到粒徑13nm的金納米粒子溶液，4℃保存?zhèn)溆茫?/p>

將上述金納米粒子溶液在沸水浴條件下繼續(xù)加熱并不斷攪拌，使水分蒸發(fā)，直至燒瓶?jī)?nèi)的溶液為20ml后停止沸水浴，室溫自然冷卻，得到濃縮的金納米粒子，4℃保存?zhèn)溆茫?/p>

將15μl1mmol/l的三(2-羧乙基)膦tcep與30μl100μmol/l的適配體apt混合，進(jìn)行巰基化反應(yīng)，然后加入到1ml濃縮的金納米粒子中，室溫下攪拌1h；接著將30μl15mmol/l的三磷酸脫氧腺苷datp加入到上述溶液中，室溫?cái)嚢?5min；震蕩完成后加入20μl1mol/l的nacl溶液室溫放置30min，4℃保存6h來(lái)增加結(jié)合的穩(wěn)定性；4℃、8000r/min離心10min去除多余的試劑；重懸于1ml含0.5%tween-20，5%bsa，2%蔗糖，0.5%tritonx-100的20mmol/l的na3po4緩沖液中，4℃避光保存?zhèn)溆茫?/p>

（2）銀納米粒子的制備及其功能化：

分別配制0.2mmol/l的硝酸銀，2.0mmol/l的脫氧膽酸鈉及20mmol/l的硼氫化鈉，將硝酸銀和脫氧膽酸鈉溶液以1︰2的摩爾比在ph7的條件下陳化24h；將陳化后的溶液加入到圓底燒瓶中，在冰浴條件劇烈攪拌作用下逐滴滴加新鮮配制的硼氫化鈉反應(yīng)10min，反應(yīng)后得到黃色膠體銀溶液，4℃避光保存?zhèn)溆茫?/p>

取1ml膠體銀溶液于1.5ml的離心管中，在4℃、12000r/min條件下離心10min去除上清，用200μl含0.5%tween-20，5%bsa，2%蔗糖，0.5%tritonx-100的20mmol/l的na3po4緩沖液重懸后即可得到5倍濃縮的膠體銀溶液。

將15μl1mmol/l的tcep與20μl100μmol/l的dna1混合，進(jìn)行巰基化反應(yīng)，然后加入到1ml5倍濃縮的膠體銀溶液，室溫下攪拌1h；接著將30μl15mmol/l的datp加入到上述溶液中，室溫?cái)嚢?5min；震蕩完成后逐滴滴加20μl1mol/l的nacl溶液室溫放置30min，4℃保存6h來(lái)增加結(jié)合的穩(wěn)定性；4℃、8000r/min離心10min去除多余的試劑，重懸于1ml含0.5%tween-20，5%bsa，2%蔗糖，0.5%tritonx-100的20mmol/l的na3po4緩沖液，4℃避光保存?zhèn)溆茫?/p>

（3）樣品墊、金標(biāo)墊預(yù)處理：

將金標(biāo)墊及樣品墊裁剪成合適的大小后在含1%nacl，0.5%tween-20，1%bsa，2%蔗糖，1%tritonx-100的0.1mol/ltris-hcl(ph8.2)緩沖液中完全浸泡30min，然后放到37℃恒溫干燥箱中烘干后，干燥條件保存、備用；

在處理好的金標(biāo)墊上滴加功能化金、銀納米粒子，即aunps-apt和agnps-dna1，其中dna1與apt部分互補(bǔ)，37℃恒溫干燥箱中烘干，干燥條件保存，備用；

（4）硝酸纖維素膜預(yù)處理：

將鏈霉親和素與生物素修飾的dna2以1︰4的摩爾比例混合均勻后在4℃的條件下放置2h，使鏈霉親和素和dna2上修飾的生物素充分結(jié)合；取結(jié)合好的sa-biotin-dna21μl在硝酸纖維素膜上靠近金標(biāo)墊一端劃?rùn)z測(cè)線t線；取1μl鏈霉親和素sa在硝酸纖維素膜上靠近吸水墊一端劃質(zhì)控線c線，將劃好t、c線的硝酸纖維素膜在37℃下烘干0.5h，干燥條件下保存?zhèn)溆茫?/p>

（5）試紙條的組裝：膠體金層析試紙條的組成材料主要包括pvc底板、樣品墊、金標(biāo)墊、硝酸纖維素膜、吸水墊五部分，先將硝酸纖維素膜粘貼到pvc底板的對(duì)應(yīng)位置上，輕壓，使二者緊密結(jié)合，將處理過(guò)的樣品墊、金標(biāo)墊，分別粘貼在pvc底板的對(duì)應(yīng)位置上，樣品墊與金標(biāo)墊，金標(biāo)墊與硝酸纖維素膜各重疊2mm，最后將吸水墊與硝酸纖維素膜重疊2mm粘貼到pvc底板上，多余部分裁掉；然后各部分粘貼牢固，裁成規(guī)格為65mm×4mm的試紙條，干燥條件保存，備用。

實(shí)施例2用試紙條對(duì)卡那霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液的測(cè)定

用2ml離心管分別將卡那霉素稀釋到不同的濃度，每管100μl。將按上述方法制備好的試紙條樣品墊一端分別插入到不同濃度卡那霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液中，室溫下反應(yīng)10min。從圖4中可以看出，在卡那霉素濃度0～1nmol/l和35～400nmol/l之間t線顏色基本沒(méi)有變化，而在1～35nmol/l之間t線顏色隨卡那霉素濃度的增大而變淺，且在35nmol/l以后檢測(cè)線基本沒(méi)有顏色。因而該試紙對(duì)卡那霉素的肉眼檢出限為35nmol/l。將反應(yīng)好的試紙條放到塑料卡中用膠體金定量?jī)x檢測(cè)t、c線的顯色情況，得到如圖5所示檢測(cè)線峰面積與卡那霉素濃度的變化關(guān)系曲線。其中在1～30nmol/l濃度范圍內(nèi)，t線顯色強(qiáng)度與濃度存在線性關(guān)系，線性回歸方程為y=-44.5115x+2295.2893，r²=0.9830，式中y為檢測(cè)線峰面積，x為卡那霉素的濃度（nmol/l）。

實(shí)施例3牛奶樣品中卡那霉素殘留的檢測(cè)

此處采用向牛奶中添加標(biāo)準(zhǔn)濃度卡那霉素制備人工污染牛奶的方式分別獲得含5nmol/l、10nmol/l、20nmol/l、30nmol/l、50nmol/l、100nmol/l、200nmol/l卡那霉素的牛奶樣品。往牛奶樣品中逐滴加入20%三氯乙酸，調(diào)節(jié)ph4.6，45℃水浴10min沉淀酪蛋白，以10000r/min的轉(zhuǎn)速離心25min除去凝結(jié)的蛋白質(zhì)和脂肪，用0.22μm的濾膜過(guò)濾，最后再調(diào)節(jié)ph到中性，得到經(jīng)預(yù)處理后的牛奶樣品。按上述操作步驟來(lái)檢測(cè)含不同濃度的卡那霉素的牛奶樣品。得到圖6所示含不同濃度卡那霉素的牛奶樣品的試紙條檢測(cè)圖。在圖6中可以看出隨著卡那霉素濃度的增大，t線的顏色變淺，當(dāng)卡那霉素達(dá)到100nmol/l后t線基本已經(jīng)沒(méi)有顏色，因此我們?cè)O(shè)定100nmol/l為試紙條對(duì)牛奶樣品中卡那霉素的可視化檢測(cè)下限。實(shí)驗(yàn)證明該檢測(cè)方法可以檢測(cè)到經(jīng)過(guò)預(yù)處理后的牛奶中基質(zhì)的卡那霉素。