本發(fā)明涉及體外診斷試劑技術領域，特別涉及一種脂蛋白(a)的檢測試劑及方法。
背景技術：
脂蛋白(a)是一種特殊的血漿脂蛋白。在1975年dalhen等研究認為lpa是動脈粥樣硬化的危險因子。1978年，mclean等研究脂蛋白(a)中的apo(a)與纖溶酶原(plg)具有高度同源性，從而認為脂蛋白(a)不僅是動脈粥樣硬化的危險因素，而且可能與纖溶系統(tǒng)有關。脂蛋白(a)在預測動脈粥樣硬化性心血管疾病的發(fā)生、冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(冠心病)的再發(fā)、靜脈血栓事件的發(fā)生以及腎臟移植預后等方面均有重要的臨床價值。
早期檢測脂蛋白(a)所用的電泳法靈敏度低，多用于定性檢測。隨后研發(fā)出了多種能直接測定脂蛋白(a)的免疫化學檢測法，如輻射狀免疫擴散法(rid)、電免疫擴散法(eid)、放射免疫測定法(ria)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(elisa)、免疫濁度法[包括免疫散射比濁法(ina)和免疫透射比濁法(ita)]、解離增強配體熒光免疫測定法(delfia)等。rid法與eid法因操縱簡便，不需特殊設備，仍有一些基層單位實驗室采用，但缺點是靈敏度低。ria法的缺點是操縱復雜，有放射性核素污染。delfia法因需特殊儀器，國內也較少應用。其中免疫比濁法，快速簡便、精密度高、易于自動化、適于大批量標本的同時檢測，便于推廣，適合臨床檢測。但需要的抗體用量大，對抗體要求高(應具有高特異性、高滴度和高親和力)，顆粒大小不同的lp(a)會產生不一致的光散射與光吸收，而且受標本中的基質的影響較明顯，容易受到類風濕因子的干擾，所以研發(fā)一種成本低、特異性好、偏差小的檢測方法是目前的市場需求。
公開號為cn103604930a中公開了一種脂蛋白(a)的檢測試劑盒，組成包括：tris-hcl緩沖液，脂蛋白(a)100mg/dl，氯化鈉150mm，蔗糖5.0％，bsa1.0％，edta10mm，疊氮化鈉0.1％。但該試劑盒在抗干擾能力和精密度方面還存在一定的欠缺。
技術實現(xiàn)要素：
有鑒于此，本發(fā)明提供了一種脂蛋白(a)的檢測試劑及方法。該檢測試劑及方法抗干擾能力強、特異性高、準確度高、穩(wěn)定性好。
為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術方案：
本發(fā)明提供了一種脂蛋白(a)的檢測試劑，該檢測試劑由試劑1和試劑2組成；
其中，試劑1包括mops緩沖液、tween80、防腐劑和水；
試劑2包括包被有脂蛋白(a)單克隆抗體的膠乳微球、甘氨酸緩沖液、tween80、防腐劑、甘油和水。
作為優(yōu)選，試劑1中各組分的用量為：
mops緩沖液：50～200mmol/l；
tween80：0.5～5vt％；
防腐劑：0.05～0.2wt％；
優(yōu)選地，試劑1中各組分的用量為：
mops緩沖液：50～100mmol/l；
tween80：1～3vt％；
防腐劑：0.05wt％。
優(yōu)選地，試劑1中tween80的濃度為1～2vt％。
在本發(fā)明提供的實施例中，試劑1中各組分的用量為：
mops緩沖液：100mmol/l；
tween80：1.5vt％；
防腐劑：0.05wt％。
作為優(yōu)選，試劑1的ph值為6～8。
優(yōu)選地，試劑1的ph值為6.5～7.5。
在本發(fā)明提供的實施例中，試劑1的ph值為7.0。
作為優(yōu)選，試劑2中各組分的用量為：
包被有脂蛋白(a)單克隆抗體的膠乳微球：0.001～0.02g/l；
甘氨酸緩沖液：10～100mmol/l；
tween80：0.5～5vt％；
防腐劑：0.05～0.2wt％；
甘油：2～10vt％；
優(yōu)選地，試劑2中各組分的用量為：
包被有脂蛋白(a)單克隆抗體的膠乳微球：0.001～0.01g/l；
甘氨酸緩沖液：10～50mmol/l；
tween80：1～5vt％；
防腐劑：0.1wt％；
甘油：2～10vt％。
優(yōu)選地，試劑2中tween80的濃度為2～5vt％。
在本發(fā)明提供的實施例中，試劑2中各組分的用量為：
包被有脂蛋白(a)單克隆抗體的膠乳微球：0.001g/l；
甘氨酸緩沖液：50mmol/l；
tween80：2vt％；
防腐劑：0.1wt％；
甘油：3vt％。
作為優(yōu)選，試劑2的ph值為7～9。
優(yōu)選地，試劑2的ph值為7～8。
在本發(fā)明提供的實施例中，試劑2的ph值為7.5。
在本發(fā)明中，適宜ph的選擇提高了試劑的貯存穩(wěn)定性。
作為優(yōu)選，防腐劑為疊氮鈉。
在本發(fā)明提供的實施例中，包被有脂蛋白(a)單克隆抗體的膠乳微球是由脂蛋白(a)單克隆抗體和膠乳微球采用化學交聯(lián)法得到。
在本發(fā)明提供的實施例中，試劑2中包被有脂蛋白(a)單克隆抗體的膠乳微球的制備方法為：將脂蛋白(a)單克隆抗體與經過mes活化的膠乳微球混合，30℃交聯(lián)得到。
作為優(yōu)選，脂蛋白(a)單克隆抗體為鼠抗人載脂蛋白(a)單克隆抗體。
作為優(yōu)選，膠乳微球為疏水微球。膠乳微球的選擇提高了化學交聯(lián)的效率，減少了抗體的損失，降低了成本，提高了靈敏度和精密度。
作為優(yōu)選，疏水微球為帶磺酸基基團、羧基基團或醛基基團的一種或兩種以上的膠乳微球。
優(yōu)選地，疏水微球為帶磺酸基基團和/或羧基基團的膠乳微球。
作為優(yōu)選，膠乳微球的平均粒徑為100～300nm。
優(yōu)選地，膠乳微球的平均粒徑為200～300nm。
作為優(yōu)選，脂蛋白(a)單克隆抗體與膠乳微球的質量比為(0.5～1)：100。
優(yōu)選地，脂蛋白(a)單克隆抗體與膠乳微球的質量比為0.8：100。
本發(fā)明還提供了一種脂蛋白(a)含量的檢測方法，包括：待測樣本加入試劑1中，孵育5～10min后再加入試劑2形成凝集，在660nm波長下測定吸光度，通過脂蛋白(a)的標準曲線得到待測樣本中脂蛋白(a)的含量；
其中，試劑1包括mops緩沖液、tween80、防腐劑和水；
試劑2包括包被有脂蛋白(a)單克隆抗體的膠乳微球、甘氨酸緩沖液、tween80、防腐劑、甘油和水。
作為優(yōu)選，孵育的溫度為37℃。
作為優(yōu)選，在檢測過程中試劑1與試劑2的體積比為3:1。
本發(fā)明提供了一種脂蛋白(a)的檢測試劑及方法。該檢測試劑由試劑1和試劑2組成；其中，試劑1包括mops緩沖液、tween80、防腐劑和水；試劑2包括包被有脂蛋白(a)單克隆抗體的膠乳微球、甘氨酸緩沖液、tween80、防腐劑、甘油和水。本發(fā)明至少具有如下優(yōu)勢之一：
(1)本發(fā)明檢測脂蛋白(a)的試劑及方法檢測結果準確性高、靈敏度好、精密度好、線性范圍寬，且穩(wěn)定性好，保存期長，便于推廣使用，成本低，可廣泛應用于各級醫(yī)院、衛(wèi)生預防部門和醫(yī)學生物科研單位測定人血清中脂蛋白(a)的含量。
(2)本發(fā)明檢測試劑抗干擾能力強、特異性高。表面活性劑的選擇，可以減少樣本的濁度對實驗結果的影響；抗體的選擇特異性更好，可以減少非特異性干擾和類風濕因子的干擾。
(3)試劑制備過程中簡化了處理膠乳微球和標記抗體的時間，簡化了工藝流程，使操作更簡便。
具體實施方式
本發(fā)明公開了一種脂蛋白(a)的檢測試劑及方法，本領域技術人員可以借鑒本文內容，適當改進工藝參數(shù)實現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領域技術人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應用已經通過較佳實施例進行了描述，相關人員明顯能在不脫離本發(fā)明內容、精神和范圍內對本文的方法和應用進行改動或適當變更與組合，來實現(xiàn)和應用本發(fā)明技術。
本發(fā)明提供的脂蛋白(a)的檢測試劑及方法中所用試劑或儀器均可由市場購得。
以下實施例中市售國產脂蛋白(a)試劑盒(膠乳增強免疫比濁法)的配方如下：
試劑1：40mmol/l含1.0％nan3的甘氨酸緩沖液；
試劑2：抗人脂蛋白(a)-igg的致敏乳膠顆粒懸液。
下面結合實施例，進一步闡述本發(fā)明：
實施例1：本發(fā)明檢測脂蛋白(a)的試劑及方法
包被有鼠抗人脂蛋白(a)單克隆抗體的膠乳顆粒的制備：
用等量的mes溶液活化0.01％羧基基團膠乳微球，然后把5mg/ml鼠抗人脂蛋白(a)單克隆抗體，與經過活化的膠乳微球混合，30℃交聯(lián)得到。
本實施例試劑包括：
試劑1：100mmol/lmops緩沖液，tween801.2％，防腐劑疊氮鈉0.05％，ph7.0；
試劑2：包被有鼠抗人脂蛋白(a)單克隆抗體的膠乳顆粒0.001g/l，粒徑為200～300nm，50mol/l甘氨酸緩沖液，0.1％疊氮鈉，2％tween80，3％甘油，ph值7.5。
檢測方法：待測樣本血清加入試劑1中，孵育5min中再加入試劑2形成凝集，試劑1與試劑2的體積比為3:1，在660nm波長下測定吸光度，通過脂蛋白(a)的標準曲線計算樣品中脂蛋白(a)的含量。
實施例2：本發(fā)明檢測脂蛋白(a)的試劑及方法
包被有鼠抗人脂蛋白(a)單克隆抗體的膠乳顆粒的制備：
用等量的mes溶液活化0.01％磺酸基基團膠乳微球，然后把5mg/ml鼠抗人脂蛋白(a)單克隆抗體，與經過活化的膠乳微球混合，30℃交聯(lián)得到。
本實施例試劑包括：
試劑1：100mmol/lmops緩沖液，tween801.2％，防腐劑疊氮鈉0.05％，參考ph7.0；
試劑2：包被有鼠抗人脂蛋白(a)單克隆抗體的膠乳顆粒0.001g/l，粒徑為200～300nm，50mol/l甘氨酸緩沖液，0.1％疊氮鈉，2％tween80，3％甘油，ph值7.5。
檢測方法：待測樣本血清加入試劑1中，孵育5min中再加入試劑2形成凝集，試劑1與試劑2的體積比為3:1，在660nm波長下測定吸光度，通過脂蛋白(a)的標準曲線計算樣品中脂蛋白(a)的含量。
實施例3：本發(fā)明檢測脂蛋白(a)的試劑及方法
包被有鼠抗人脂蛋白(a)單克隆抗體的膠乳顆粒的制備：
用等量的mes溶液活化0.01％羧基和磺酸基基團膠乳微球，，然后把5mg/ml鼠抗人脂蛋白(a)單克隆抗體，與經過活化的膠乳微球混合，30℃交聯(lián)得到。
本實施例試劑包括：
試劑1：100mmol/lmops緩沖液，tween801.2％，防腐劑疊氮鈉0.05％，參考ph7.0；
試劑2：包被有鼠抗人脂蛋白(a)單克隆抗體的膠乳顆粒0.001g/l，粒徑為200～300nm，50mol/l甘氨酸緩沖液，0.1％疊氮鈉，2％tween80，3％甘油，ph值7.5。
檢測方法：待測樣本血清加入試劑1中，孵育5min中再加入試劑2形成凝集，試劑1與試劑2的體積比為3:1，在660nm波長下測定吸光度，通過脂蛋白(a)的標準曲線計算樣品中脂蛋白(a)的含量。
實施例4：本發(fā)明檢測方法的準確度分析
試驗儀器：日立7080全自動生化分析儀；
檢測樣品：20名體檢者血清樣本；
對比試劑1：市售國產脂蛋白(a)試劑盒(膠乳增強免疫比濁法)。
用實施例1至實施例3的檢測試劑和對比試劑分別測定20例樣品，檢測結果見表1-1～1-3。
表1-1實施例1試劑的準確度分析結果
表1-2實施例2試劑的準確度分析結果
表1-3實施例3試劑的準確度分析結果
結果顯示，根據(jù)檢測結果計算出的實施例1試劑檢測方法的r2值為0.995，實施例2、3檢測方法的r2值同樣大于0.95，表明本發(fā)明方法檢測結果與對比試劑盒檢測結果無明顯差異，具有較高準確度(符合度)。
實施例5：本發(fā)明檢測方法的精密度分析
試驗儀器：日立7080全自動生化分析儀；
檢測樣品：低值、中值、高值血清樣品各一份；中值血清樣本一份；
采用實施例1至實施例3的試劑及檢測方法對同一待測樣品重復檢測10次，其檢測結果見表2。
表2檢測樣品脂蛋白(a)濃度(10次)及標準差率(變異系數(shù))
結果顯示，實例1、2、3低值，中值，高值樣本標準差率分別為2.72％、2.07％、2.27％；1.45％、1.07％、1.12％；1.19％、0.99％、1.12％，均小于3％，且小于對比試劑的標準差率，表明本發(fā)明方法具有高精密度。
實施例6：本發(fā)明方法的抗干擾性能分析
試驗儀器：日立7080全自動生化分析儀；
檢測樣品：任意一血清樣品：
在同一份血清樣本中加入不同濃度的類風濕因子(50，150，250，500、800iu/ml)，采用實施例1至實施例3的檢測方法對同一待測樣品重復檢測3次，與未加入類風濕因子的血清做對比，計算偏差，其檢測結果見表3。在本實施例中，選取市售國產脂蛋白(a)試劑盒(膠乳增強免疫比濁法)作為對比試劑，進行了比較。
表3檢測樣品脂蛋白(a)濃度的平均值和偏差絕對值
結果顯示，本發(fā)明的試劑類風濕因子≤800iu/ml對測值沒有影響，而對比試劑盒1僅在類風濕因子<300iu/ml對測值沒有影響。
以上實例中市售國產脂蛋白(a)試劑盒(膠乳增強免疫比濁法)的配方如下：
試劑1：40mmol/l含1.0％nan3的甘氨酸緩沖液
試劑2：抗人脂蛋白(a)-igg的致敏乳膠顆粒懸液
以上僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應當指出，對于本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發(fā)明的保護范圍。