本發(fā)明屬于生物工程領域，涉及一種微生物的檢測方法，具體來說是一種用于瓜類果斑病菌的雙標記免疫熒光檢測試紙。

背景技術：

瓜類果斑病是一種嚴重的細菌性病害，20世紀80年代后期該病因在美國數(shù)個州的西瓜上出現(xiàn)破壞性爆發(fā)而受到廣泛關注，自此，瓜類細菌性果斑病在世界范圍內傳播開來。其病原為革蘭氏陰性菌的嗜酸菌屬燕麥種西瓜亞種(acidovoraxcitrulli,ac)，是一種具有高度破壞性的種傳病菌。該病菌的抗干旱能力非常強，可在干燥的種子表面存活35年。到目前為止，并無完全抵抗該病菌的商業(yè)化的培育品種。

瓜類果斑病菌又稱果斑病菌，它可以引起西瓜、甜瓜、南瓜等葫蘆科植物患病，據(jù)報道，在番茄、茄子等茄科植物的種子中也檢測到了該病原菌，它可侵染果實、植株及種子，主要依靠帶菌種子傳播。帶菌種子播種后會使幼苗患病，出現(xiàn)褐色壞死斑。帶菌果實在采后貯藏運輸過程中會感染健康果實，表面會出現(xiàn)水漬狀斑點，最終導致整個果實腐爛，嚴重影響瓜類產量。

目前市場上用于檢測果斑病菌的試紙是來自美國agdia公司的免疫膠體金試紙，國內嚴重依賴進口，且現(xiàn)有技術中的免疫膠體金試紙的檢測效果取決于抗體與膠體金的結合效果及金標抗體與檢測抗體的配對情況。目前報道的試紙多為單克隆抗體作為金標抗體和多克隆抗體作為檢測抗體配合使用，因此存在著檢測靈敏度低、交叉反應多、試紙條有效期短等問題，對檢測準確度造成了一些不利影響。

技術實現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術中的上述技術問題，本發(fā)明提供了一種用于瓜類果斑病菌的雙標記免疫熒光檢測試紙，所述的這種用于瓜類果斑病菌的雙標記免疫熒光檢測試紙要解決現(xiàn)有技術中檢測瓜類果斑病菌的試紙靈敏度低、交叉反應多、試紙條有效期短的技術問題。

本發(fā)明提供了一種用于瓜類果斑病菌的雙標記免疫熒光檢測試紙，包括一個支撐層，所述的支撐層上設置有樣品墊、吸水墊，所述的樣品墊和所述的吸水墊之間設置有硝酸纖維素膜，所述的硝酸纖維素膜上設置有檢測線和質控線，所述的檢測線靠近樣品墊的一側，所述的質控線靠近吸水墊的一側，所述的硝酸纖維素膜靠近樣品墊的一側設置有結合墊，所述的結合墊和所述的樣品墊緊密連接，所述的檢測線由保藏號為no.10413的雜交瘤細胞株分泌的單克隆抗體構成，所述的單克隆抗體的濃度為2mg/ml，所述的結合墊上噴涂有異硫氰酸熒光素標記的由保藏號為no.10413的雜交瘤細胞株分泌的單克隆抗體。

進一步的，所述的質控線由羊抗鼠igg抗體構成。

進一步的，所述的支撐層為pvc底板。

進一步的，所述的吸水墊為吸水紙。

本發(fā)明還提供了采用上述的試紙檢測瓜類果斑病菌的方法，將待檢測細菌放置于異硫氰酸熒光素改良培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，所述的異硫氰酸熒光素改良培養(yǎng)基由異硫氰酸熒光素和腦心浸液培養(yǎng)基組成，所述的異硫氰酸熒光素在異硫氰酸熒光素改良培養(yǎng)基中的濃度為20μg/ml，將菌懸液采用無菌生理鹽水調到至少10⁵cfu/ml，然后將含有待檢測細菌的菌懸液滴加至樣品墊上，隨著待檢測細菌的流動，如果檢測線的顏色變?yōu)辄S色，則表示待檢測樣品中含有瓜類果斑病菌，若檢測線不變色，則代表樣品中無瓜類果斑病菌。

本發(fā)明采用添加fitc的改良腦心浸液(bhi)培養(yǎng)基培養(yǎng)細菌，該方式培養(yǎng)的細菌可以發(fā)出黃綠色的熒光，可用作熒光探針；由保藏號為cgmcc10413的雜交瘤細胞株產生的單克隆抗體6d作為檢測抗體，噴涂于nc膜上形成檢測線，同時抗體6d用fitc標記后噴涂于結合墊形成捕捉抗體，該試紙的檢測樣品與捕捉抗體進行fitc雙標記后可起到信號放大的作用。同時僅用一株抗體，試紙的特異性僅與該單抗的性能相關，可保證試紙的特異性。

本發(fā)明由于同時采用了細菌與抗體雙標記后作為熒光探針，起到了信號放大的作用，使得檢測靈敏度較高。由于選用6d分泌的抗體既作為檢測抗體又作為捕捉抗體，因而試紙的交叉反應僅與該單抗的特異性相關，實驗結果表明該免疫熒光試紙對果斑病菌的檢測特異性、準確度及靈敏度均較高。

本發(fā)明的一種雜交瘤細胞株，分類命名：抗瓜類細菌性果斑病菌(acidovoraxavenaesubsp.citrullii)雜交瘤細胞株，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(cgmcc)中，中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的地址為：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院(中科院微生物研究所)，保藏日期為2015年3月19日，保藏號為cgmccno.10413。

本發(fā)明采用的保藏號為no.10413的雜交瘤細胞株及其分泌的單克隆抗體的全部內容在2015年10月21日公開的申請?zhí)枮椤?01510420442.6”、發(fā)明名稱為“果斑病菌免疫膠體金檢測試紙條及其單抗和雜交瘤細胞株”/2016年07月20日公開的申請?zhí)枮椤?01610270079.9”、發(fā)明名稱為“果斑病菌單抗及其雜交瘤細胞株”的文件中均有記載，在此不再贅述。

本發(fā)明和已有技術相比，其技術進步是顯著的。本發(fā)明通過添加fitc改良了培養(yǎng)基，以此培養(yǎng)基培養(yǎng)的細菌可以發(fā)出黃綠色的熒光，從而使細菌成為熒光探針?？构卟【膯慰寺】贵w6d作為檢測抗體并用fitc標記后作為捕捉抗體，制成雙熒光標記的免疫熒光試紙。實驗表明此熒光檢測試紙可檢出大多數(shù)的果斑病菌且無交叉反應，具有靈敏度高、準確性好等特點。

附圖說明

圖1是本發(fā)明實施例中果斑病菌的免疫熒光檢測試紙的改良培養(yǎng)基培養(yǎng)細菌后的熒光顯微鏡觀察結果；

圖2是本發(fā)明實施例中果斑病菌的免疫熒光檢測試紙的流式細胞儀檢測不同fitc濃度細菌熒光強度結果；

圖3是本發(fā)明實施例中果斑病菌的免疫熒光檢測試紙的結構示意圖；

圖4是本發(fā)明實施例中果斑病菌的免疫熒光檢測試紙的特異性反應結果；

圖5是本發(fā)明實施例中果斑病菌的免疫熒光檢測試紙的靈敏度結果；

圖6是本發(fā)明實施例中果斑病菌的免疫熒光檢測試紙的實際樣品的檢測結果；

圖7是本發(fā)明實施例中果斑病菌的免疫熒光檢測試紙的實際樣品的pcr檢測結果。

具體實施方式

以下結合附圖介紹本發(fā)明的具體實施方式：

首先介紹本發(fā)明實施例中所使用的試劑與儀器：

主要試劑：

bsa上海世澤生物科技有限公司；fitc美國sigma公司；硝酸纖維素膜(nc膜)美國millipore公司；腦心浸液培養(yǎng)基北京陸橋有限公司。

主要儀器：

酶標儀spectramaxm2，購自moleculardevices；nanodrop2000c購自thermoscientific；點樣儀ad6010購自bio-dot；恒溫培養(yǎng)搖床sph-100b購自上海世平；單人凈化工作臺sw-sj-2d購自蘇州凈化。

本實驗用的果斑病菌單克隆抗體的雜交瘤細胞株6d4c5e9b9于2015年4月保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心(cgmcc，中國，北京市)，保藏號為中國普通微生物菌種保藏管理中心(cgmcc，中國，北京市)no.10413。

本實驗用的8株果斑病菌及測定交叉反應的其余植物病原菌均由中國檢驗檢疫科學研究院惠贈，已經進行了分離鑒定及柯赫氏法則等的驗證。

實施例1免疫熒光檢測試紙的研制

1.異硫氰酸熒光素(fitc)改良培養(yǎng)基

新鮮配置fitc母液，取不同體積fitc溶液添加到腦心浸液培養(yǎng)基(bhi)中制成改良的bhi培養(yǎng)基，接種果斑病菌后37℃避光培養(yǎng)12h。圖1為改良的bhi培養(yǎng)基培養(yǎng)的細菌在熒光顯微鏡下觀察結果，可見該方法培養(yǎng)的細菌能夠發(fā)出強烈的黃綠色的熒光。

2.流式細胞儀測定不同fitc濃度的細菌熒光強度

采用流式細胞儀測定不同濃度fitc的培養(yǎng)基中細菌的熒光強度，以確定最適的fitc濃度。由圖2a可以看出，不同濃度的標記率(m2+m3+m4)均在97％以上，但每個區(qū)域分布不同。熒光強度可能會影響最終的檢測靈敏度，因而對m3區(qū)域的數(shù)量進行比較如圖2b，當濃度為20μg/ml時，熒光強度最高，因而選在該濃度為最適fitc濃度。

3.單抗的熒光標記

按單抗：fitc=1mg：150μg的比例將新鮮配制得fitc緩慢加入抗體溶液中，邊加邊輕輕晃動使其與抗體混合均勻，暗處4℃反應8h。加入5mol/l的nh4cl至終濃度50mmol/l，4℃終止反應2h。將交聯(lián)物在pbs中透析四次以上，至透析液清亮。fitc：抗體＝3.1×a495/[a280–0.31×a495]，該值應介于2.5～6.5之間。

經酶標儀測定后計算可得fitc：抗體的比值為3.22，在范圍內。

4.果斑病菌的免疫熒光檢測試紙條的組裝

圖3是本發(fā)明果斑病菌的免疫熒光檢測試紙條10的結構示意圖。

如圖3所示，果斑病菌的免疫熒光檢測試紙包括：樣品墊14、結合墊13、檢測線16、質控線15、吸水紙11，在吸水墊與樣品墊的中間設置硝酸纖維素膜12，硝酸纖維素膜也稱nc膜。硝酸纖維素膜上噴涂有檢測線16與質控線15。果斑病菌的雙標記免疫熒光檢測試紙還具有pvc底板。

所述的結合墊13設置在所述的樣品墊14和所述的硝酸纖維素膜12之間，所述的結合墊13上噴涂有異硫氰酸熒光素標記的由保藏號為no.10413的雜交瘤細胞株分泌的單克隆抗體。

所述的檢測線16由保藏號為no.10413的雜交瘤細胞株分泌的單克隆抗體構成，所述的單克隆抗體的濃度為2mg/ml。

質控線15是羊抗鼠igg抗體。

5.檢測線濃度優(yōu)化

將不同濃度(2.5mg/ml，2mg/ml，1.5mg/ml)的單克隆抗體6d4噴涂于硝酸纖維素膜(nc膜)上形成檢測線。改良的bhi培養(yǎng)基70ul逐滴滴加至樣品墊，判定最適的檢測線濃度：選擇試紙僅有一條質控線的最高6d4抗體濃度為最適檢測線濃度。

當檢測線濃度為2.5mg/ml時，試紙測定改良的bhi培養(yǎng)基時出現(xiàn)假陽性結果，濃度低于2mg/ml時，試紙僅有一條質控線，因此本實驗中最適的檢測限濃度為2mg/ml。

6.試紙?zhí)禺愋詼y定

將8種果斑病菌及6種非ac的植物病原菌均于改良的bhi培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)，菌懸液用無菌生理鹽水調到10⁸cfu/ml，每種樣品滴加70μl到試紙的樣品墊，改良的bhi培養(yǎng)基作為陰性對照。

由圖4(1-8)可知，70μl濃度為10⁸cfu/ml的8種果斑病菌(99-5，xj112，pslb1，00-1，plsb91，tw31，atcc29625，sd01)菌液滴加到樣品墊后，試紙均有兩條線；由圖4(9-14)可知，其他6株非ac的植物病原菌(ncppb961，atcc33996，atcc19307，ncppb2597，ncppb540，ncppb2975)相同濃度相同體積加樣后，僅有一條質控線顯色。結果表明，該試紙條可以專一檢測8種果斑病菌(99-5，xj112，pslb1，00-1，plsb91，tw31，atcc29625，sd01)，特異性較好。

7.試紙靈敏度測定

果斑病菌野生型菌株sd01單菌落于改良的bhi培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)12h后，平板菌落計數(shù)算得菌液濃度為3.1×10⁹cfu/ml。用無菌的生理鹽水按梯度稀釋至10⁸、10⁷、10⁶、10⁵cfu/ml，以改良的bhi培養(yǎng)基作為陰性對照。每個樣品在試紙的樣品墊逐滴滴加70μl，10min后在紫外燈下觀察結果。

由圖5可知，滴加濃度為10⁸、10⁷、10⁶、10⁵cfu/ml菌液后，試紙均顯示兩條線，滴加10⁴cfu/ml菌液時僅有一條質控線，說明試紙檢測靈敏度可達10⁵cfu/ml，三次重復結果均為10⁵cfu/ml，靈敏度與穩(wěn)定性較好。

8.實際樣品的檢測

選取葫蘆科植物中的西瓜、甜瓜、南瓜、黃瓜、冬瓜、絲瓜、哈密瓜、西葫蘆的莖葉搗碎，收集汁液5ml添加到45ml改良的bhi培養(yǎng)基中，并接種果斑病菌sd01單菌落，37℃培養(yǎng)12h后，無菌生理鹽水稀釋至濃度為10⁵cfu/ml，每個樣品在試紙的樣品墊上滴加70μl，10min后在紫外燈下觀察結果。

如圖6所示，樣品1-8號均可以檢出，而空白對照僅有一條檢測線，說明試紙在檢測樣品時，最小可檢出濃度不受瓜類莖葉中雜質的影響，表明該試紙可用于田間現(xiàn)場的快速檢測。

9.pcr法測定試紙的準確度

為驗證該檢測試紙的準確性，采用國標pcr法對上述8種瓜類帶菌樣品進行驗證，如圖7所示，1-8號樣品均可以在360bp擴增出特異性條帶，與試紙檢測的陽性結果一致，表明了制備的該檢測試紙具有較好的準確性。