本發(fā)明屬于復(fù)雜樣品中手性異構(gòu)體分離、分析檢測技術(shù)研究，具體涉及一種正相液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法分析口含煙中煙堿旋光異構(gòu)體的方法，主要是針對不同類型口含煙樣品，對煙堿進(jìn)行提取，采用手性色譜柱實現(xiàn)煙堿旋光異構(gòu)體的分離，柱后高壓輸液泵引入異丙醇并進(jìn)行分流，結(jié)合串聯(lián)質(zhì)譜分析，實現(xiàn)了口含煙中S-(-)-煙堿和R-(+)-煙堿的分離及靈敏檢測。
背景技術(shù)：
：口含煙是通過口腔使用的無煙氣煙草制品，是由煙粉/煙絲/煙草提取物以及添加的無機(jī)鹽、香料、水分、保潤劑等成分組成，產(chǎn)品形式包括美國濕鼻煙、瑞典鼻煙、含化型煙草制品、干鼻煙、膠基式煙草制品等?？诤瑹熢谙M(fèi)時不經(jīng)燃燒，不會產(chǎn)生“環(huán)境煙草煙氣”。近些年，世界衛(wèi)生組織煙草控制框架公約（WHOFCTC）禁止煙草煙氣在公共場所擴(kuò)散等限制和禁令對傳統(tǒng)卷煙造成強(qiáng)大沖擊。在這種背景之下，世界各國煙草行業(yè)紛紛把口含煙作為重要發(fā)展方向。煙堿是人類吸煙的主要動力。煙堿有兩個旋光異構(gòu)體，即S-(-)-煙堿和R-(+)-煙堿。二者具有完全不同的代謝機(jī)理和生理特性，S-(-)-煙堿的生理活性和毒性比R-(+)-煙堿更強(qiáng)。因此，煙堿旋光異構(gòu)體的分離分析在藥學(xué)和吸煙與健康方面具有重要意義。目前文獻(xiàn)報道的煙堿旋光異構(gòu)體的分離分析主要方法有手性色譜柱-二維氣相色譜法、手性色譜柱-液相色譜法等。手性色譜柱-二維氣相色譜法存在的問題分析時間長；而手性色譜柱-液相色譜法存在的問題是靈敏度較低。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是針對以上問題，提出了一種正相液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法分析口含煙中煙堿旋光異構(gòu)體的方法。采用手性色譜柱-正相液相色譜法實現(xiàn)了煙堿旋光異構(gòu)體的分離；為滿足串聯(lián)質(zhì)譜分析的要求，采用高壓輸液泵柱后加入異丙醇并進(jìn)行分流，有利于離子化效率及分析方法靈敏度的提高，從而實現(xiàn)煙堿旋光異構(gòu)體的分析測定。本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的：一種正相液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測口含煙中煙堿旋光異構(gòu)體的方法，首先對口含煙中的煙堿進(jìn)行提取，采用手性色譜柱實現(xiàn)煙堿旋光異構(gòu)體的分離，柱后高壓輸液泵引入異丙醇并進(jìn)行分流，結(jié)合串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行分析測定，具體步驟如下：a、口含煙中煙堿的萃?。簽閷崿F(xiàn)口含煙樣品中煙堿的完全萃取，對不同類型口含煙樣品（袋裝、含化型、膠基型）首先進(jìn)行預(yù)處理：袋裝口含煙直接剪碎，含化型口含煙碾磨成粉，膠基型口含煙碾成片狀并剪碎。稱取預(yù)處理后的口含煙樣品0.1~0.5g，加入1~5mL5.0%NaOH溶液，靜置5~30min，準(zhǔn)確加入含有內(nèi)標(biāo)的正己烷溶液10~50mL，超聲萃取5~30min，取上層清液過有機(jī)相濾膜，有機(jī)相濾膜上加有1~3.0g無水硫酸鈉，凈化后的樣品溶液進(jìn)正相液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析。b、樣品的分析：液相色譜條件：采用正相液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析，所用色譜柱為手性色譜柱；柱溫：30oC；流動相A：含有堿性添加劑的正己烷，流動相B：異丙醇；等度洗脫；流速0.5~1.0mL/min；進(jìn)樣體積10μL，分析時間為17min。柱后加入異丙醇及分流：為提高正相液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法的靈敏度，實現(xiàn)煙堿旋光異構(gòu)體定量分析的要求，在柱后通過三通閥連接，采用安捷倫高壓輸液泵引入異丙醇，控制異丙醇流速。同時，為適應(yīng)質(zhì)譜分析的要求，進(jìn)行柱后分流以減少進(jìn)入質(zhì)譜的溶劑量。采用離子源上配置的三通閥進(jìn)行柱后分流，通過控制PEEK管的長度，控制分流比。離子源：電噴霧電離源（ESI）；掃描方式：正離子掃描；檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測MRM；電噴霧電壓：5000V；氣簾氣壓力：30psi；輔助氣1壓力：70psi；輔助氣2壓力：70psi；離子源溫度：550oC。各化合物及內(nèi)標(biāo)的保留時間、母離子、子離子、碰撞能量（CE）及去簇電壓（DP）參見表1。在本發(fā)明中，步驟a中所述內(nèi)標(biāo)為：采用外消旋的d3-煙堿為內(nèi)標(biāo)，d3-S-(-)-煙堿和d3-R-(+)-煙堿合并計算，濃度范圍為1~10mg/mL。步驟b中所述的手性色譜柱為大賽璐手性色譜柱CHIRALPAK?IC，規(guī)格為4.6mm×250mm，i.d.5μm；堿性流動相添加劑為二乙胺，添加量為正己烷質(zhì)量的0.02%~0.2%；所述的等度洗脫條件為A:B=95：5；柱后分流比例為1:3~1:5；柱后加入異丙醇流速為0.1~1.0mL/min。本發(fā)明采用正己烷配制煙堿旋光異構(gòu)體混合母液用于配制標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，氘代內(nèi)標(biāo)溶液和標(biāo)準(zhǔn)工作溶液同樣采用正己烷配制。分別對標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行正相液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法分析，并以S-(-)-煙堿和R-(+)-煙堿與內(nèi)標(biāo)物峰面積比對濃度比進(jìn)行線性回歸，得到各目標(biāo)化合物的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。取最低濃度標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，10次平行測定，計算標(biāo)準(zhǔn)偏差，3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差為檢測限，10倍標(biāo)準(zhǔn)偏差為定量限，結(jié)果見表2。本發(fā)明的有益效果如下：（1）首次采用正相液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法實現(xiàn)了口含煙中煙堿旋光異構(gòu)體的分離檢測；（2）由于正相液相色譜流動相主要為非極性溶劑（正己烷），離子化效率低，不適合質(zhì)譜檢測。因此，采用柱后高壓輸液泵引入異丙醇，提高極性溶劑的比例，以提高質(zhì)譜離子化效率和分析的靈敏度。同時，為了進(jìn)一步提高質(zhì)譜的霧化和離子化效率，在加入異丙醇后再進(jìn)行柱后分流，減少進(jìn)入質(zhì)譜的溶劑量，滿足液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析的要求，提高分析的靈敏度；（3）與文獻(xiàn)報道方法比較，本發(fā)明兩種煙堿旋光異構(gòu)體的色譜分離度高（保留時間相差1min）；分析時間短（僅需17min）；方法靈敏度高，滿足含量較低的R-(+)-煙堿的定量要求。附圖說明圖1為煙堿旋光異構(gòu)體的多反應(yīng)監(jiān)測質(zhì)譜（MRM）圖，其中：a為S-(-)-煙堿，b為R-(+)-煙堿。具體實施方式本發(fā)明以下將結(jié)合實施例作進(jìn)一步說明：實施例1（1）不同類型口含煙樣品預(yù)處理：袋裝濕鼻煙：袋口剪開，取出里面的煙絲，并將袋子剪碎，與口含煙煙絲混合。含化型口含煙：取含化型口含煙直接碾磨成粉。膠基型口含煙：取膠基型口含煙用碾缽碾成片狀，然后用剪刀剪碎。（2）口含煙中煙堿的萃?。悍Q取預(yù)處理好的口含煙樣品0.3g，加入2mL5.0%NaOH溶液，靜置20min，準(zhǔn)確加入含有外消旋的d3-煙堿內(nèi)標(biāo)的正己烷溶液20mL，外消旋的d3-煙堿濃度為5mg/mL，超聲萃取30min，取上層清液有機(jī)相濾膜，有機(jī)相濾膜上加了2.0g無水硫酸鈉，凈化后的樣品溶液進(jìn)正相液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析。（3）儀器分析：采用正相液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法分析，所用色譜柱為大賽璐手性色譜柱CHIRALPAK?IC，規(guī)格為4.6mm×250mm，i.d.5μm；柱溫：30oC；流動相A：含有0.1%二乙胺的正己烷，流動相B：異丙醇；95%A+5%B等度洗脫；流速1.0mL/min；進(jìn)樣體積10μL，分析時間為17min。采用安捷倫高壓輸液泵進(jìn)行柱后加入異丙醇，控制異丙醇流速為1.0mL/min；并利用離子源上配置的三通閥進(jìn)行柱后分流，控制分流比為1:5。采用ESI離子源，正離子掃描模式；多反應(yīng)監(jiān)測MRM；電噴霧電壓：5000V；氣簾氣壓力：30psi；輔助氣1壓力：70psi；輔助氣2壓力：70psi；離子源溫度：550oC。實施例2選取袋裝濕鼻煙、含化型口含煙、膠基型口含煙典型樣品各2種，按照實施例1所述的分析方法，測定口含煙中煙堿旋光異構(gòu)體的含量，結(jié)果如表3所示。表3：口含煙中煙堿旋光異構(gòu)體的含量（mg/g）樣品編號S-(-)-煙堿R-(+)-煙堿袋裝濕鼻煙15.60.011袋裝濕鼻煙213.70.037含化型口含煙14.80.014含化型口含煙26.90.017膠基型口含煙19.80.027膠基型口含煙27.60.017當(dāng)前第1頁1 2 3