本發(fā)明屬于分析化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種用于動(dòng)物源樣品中痕量F-2毒素代謝分析的方法。

背景技術(shù)：

F-2毒素，又稱玉米烯酮（ZEN），是由禾谷鐮刀菌、三線鐮刀菌及串珠鐮刀菌等產(chǎn)生的一類真菌毒素，常見于糧食及動(dòng)物飼料中，可經(jīng)飲用水和食物對(duì)動(dòng)物健康造成影響，在動(dòng)物所有食用的樣品中不得檢出。

關(guān)于F-2毒素的檢測(cè)，國內(nèi)外已建立了多種方法，主要為薄層色譜法、酶聯(lián)免疫測(cè)定法（ELISA）、高效液相色譜法（HPLC），主要集中于F-2毒素單組分檢測(cè)。AOAC于1995年發(fā)布了其官方的薄層色譜法（TLC）分析方法。在我國，1996年發(fā)布的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)“出口糧谷中赤霉烯酮檢驗(yàn)方法”、2004年發(fā)布的國家標(biāo)準(zhǔn)“飼料中玉米赤霉烯酮的測(cè)定”以及2005年發(fā)布的國家標(biāo)準(zhǔn)“糧食衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)”均采用薄層色譜法。在免疫分析方面，基于生物素-鏈霉親和素的酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA），建立了玉米赤霉烯酮（ZEN）的ZEN-ELISA檢測(cè)方法。在液相色譜技術(shù)方面，我國對(duì)ZEN檢測(cè)的研究主要集中ZEN單組分特異性分析，國家標(biāo)準(zhǔn)“谷物中玉米赤霉烯酮的測(cè)定”中采用Vieam ZEN免疫親和柱進(jìn)行高效液相分析檢測(cè)。

在F-2毒素代謝分析方面，目前主要應(yīng)用液相色譜聯(lián)用質(zhì)譜分析技術(shù)，采用梯度洗脫分離方式，聯(lián)用高分辨質(zhì)譜或串聯(lián)質(zhì)譜（MS-MS），采用乙酸銨水溶液與乙腈/甲醇在一定的濃度梯度下洗脫，通過改變流動(dòng)相中各溶劑組成的比例改變流動(dòng)相的極性，使每個(gè)流出的組分都有合適的容量因子k，并使樣品中的所有組分可在最短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)最佳分離，分離效果良好，但儀器要求較高。等度洗脫，流動(dòng)相的組成比例和流速恒定不變，洗脫操作簡單；熒光檢測(cè)靈敏度較高，技術(shù)要求較低，二者的聯(lián)用對(duì)于痕量F-2毒素的代謝分析具有良好的應(yīng)用前景。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種用于動(dòng)物源樣品中痕量F-2毒素代謝分析的方法，該方法基于高效液相色譜技術(shù)，集成了在柱富集、等度洗脫和熒光檢測(cè)等技術(shù)，用于動(dòng)物樣品中痕量F-2毒素及代謝組分的快速分離、檢測(cè)，流程簡便、操作簡單、靈敏度高。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一種用于動(dòng)物源樣品中痕量F-2毒素代謝分析的方法，以液相色譜分離柱對(duì)動(dòng)物源樣品提取凈化液進(jìn)行在柱連續(xù)進(jìn)樣富集，以甲醇-乙腈-水三元混合溶液為流動(dòng)相，采用恒流等度洗脫和柱后熒光檢測(cè)模式，連續(xù)分離檢測(cè)動(dòng)物樣品中痕量F-2毒素及代謝組分，實(shí)現(xiàn)F-2毒素動(dòng)物體內(nèi)代謝反應(yīng)的痕量分析。

所述F-2毒素代謝中的組分包括β-玉米赤霉烯醇、F-2毒素。

所述的色譜分離柱為十八烷基鍵合硅膠填充柱；

所述的甲醇-乙腈-水三元混合溶液體積比為55：13：32；

所述的熒光檢測(cè)模式的激發(fā)波長為274 nm、發(fā)射波長為440 nm。

所述用于動(dòng)物源樣品中痕量F-2毒素代謝分析的方法，具體包括以下分析步驟：

所述用于動(dòng)物源樣品中痕量F-2毒素代謝分析的方法，所述動(dòng)物源樣品為豬的肝臟、肌肉和血清。

所述用于動(dòng)物源樣品中痕量F-2毒素代謝分析的方法，對(duì)于肝臟、肌肉組織樣品分析的具體包括以下步驟：

（1）提取：取1g均質(zhì)的組織樣品，均勻攪碎，置放于10 mL離心管中，加入2.0 mL乙酸鈉溶液、3.0 mL無水乙醚，4000r/min離心10min，轉(zhuǎn)移上清液；重復(fù)提取一次；合并提取液，40℃下氮?dú)獯蹈桑?/p>

殘?jiān)?.5mL三氯甲烷溶解，超聲2min，加入1.5mL 0.5mol/L的氫氧化鈉溶液，4000r/min離心10min，轉(zhuǎn)移上清液；重復(fù)提取一次；合并提取液，40℃下氮?dú)獯蹈桑霉腆w備用；

（2）凈化：在步驟（1）得到的固體中加入體積比1：4的磷酸-水溶液0.5mL，混勻后轉(zhuǎn)入PEP固相萃取柱中，先用1.0 mL水淋洗，棄去；采用3.0ml甲醇洗脫，洗脫液于40℃下氮?dú)獯蹈?，殘?jiān)皿w積比為1：3的乙腈-水溶液1.0 mL溶解，過濾，取濾液待測(cè)；

（3）在柱富集：以十八烷基鍵合硅膠顆粒填充柱為分離柱；在步驟（2）得到的濾液中加入體積比1：3的乙腈-水混合溶液配制樣品，在柱連續(xù)進(jìn)樣200μL；

（4）等度洗脫分析：以甲醇、乙腈、水三元混合溶液為流動(dòng)相，以流速為1.0 mL/min進(jìn)行恒流等度洗脫；采用熒光檢測(cè)方式，激發(fā)波長為274 nm、發(fā)射波長為440 nm，在線測(cè)定β-玉米赤霉烯醇、F-2毒素組分，實(shí)現(xiàn)對(duì)痕量F-2毒素代謝組分的色譜等度洗脫-熒光檢測(cè)。

所述用于動(dòng)物源樣品中痕量F-2毒素代謝分析的方法，對(duì)于血清樣品分析的包括以下步驟：

（1）凈化：取 1mL 血清樣品于 10 mL 離心管中，加入 5.0 mL 乙酸乙酯，渦旋混勻 5min，3000r/min 離心 10 min 取上清液于 10 mL 玻璃離心管中，剩余殘?jiān)?4.0 mL 乙酸乙酯分兩次清洗，洗液轉(zhuǎn)入玻璃離心管中，40℃水浴氮?dú)獯蹈?，殘?jiān)?1.0 mL 流動(dòng)相溶解，3000 r/min 離心 10min，取上清液過濾，濾液待測(cè)；

（2）在柱富集：以十八烷基鍵合硅膠顆粒填充柱為分離柱；在步驟（1）得到的濾液中加入體積比1：3的乙腈-水混合溶液配制樣品，在柱連續(xù)進(jìn)樣200μL；

（3）等度洗脫分析：以甲醇、乙腈、水三元混合溶液為流動(dòng)相，以流速為1.0 mL/min進(jìn)行恒流等度洗脫；采用熒光檢測(cè)方式，激發(fā)波長為274 nm、發(fā)射波長為440 nm，在線測(cè)定β-玉米赤霉烯醇、F-2毒素組分，實(shí)現(xiàn)對(duì)痕量F-2毒素代謝組分的色譜等度洗脫-熒光檢測(cè)。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：

本發(fā)明集成了在柱富集、等度洗脫和熒光檢測(cè)等技術(shù)，提出了一種用于動(dòng)物樣品中痕量F-2毒素及代謝組分的快速分離、靈敏檢測(cè)的便捷的新技術(shù)。針對(duì)傳統(tǒng)HPLC方法聯(lián)用質(zhì)譜分析雖然高分辨高靈敏，但是儀器復(fù)雜、操作技術(shù)要求高；常規(guī)紫外光譜檢測(cè)簡便，但檢測(cè)靈敏度低，不適用于痕量F-2毒素的檢測(cè)分析等問題，本發(fā)明引入在線大體積進(jìn)樣富集技術(shù)，通過在柱高壓連續(xù)進(jìn)樣，通過調(diào)控有機(jī)相濃度，控制區(qū)帶擴(kuò)散，以實(shí)現(xiàn)F-2毒素及代謝組分的高效富集；以三元混合試劑為流動(dòng)相，采用恒流速等度洗脫方式，實(shí)現(xiàn)F-2毒素及代謝組分的快速連續(xù)分離；并聯(lián)用熒光檢測(cè)，在線測(cè)定分離組分，實(shí)現(xiàn)對(duì)動(dòng)物樣品中痕量F-2毒素及代謝組分的在柱富集和痕量分析。本發(fā)明方法流程連續(xù)、高效，無需復(fù)雜的儀器裝備，富集后熒光檢測(cè)的靈敏度最低可達(dá)0.05 ng/mL，適用于痕量F-2毒素及代謝組分的痕量分析。

附圖說明

圖1為實(shí)施例1中連續(xù)進(jìn)樣富集后F-2毒素代謝組分檢測(cè)限，1為β-玉米赤霉烯醇；

圖2為實(shí)施例2中豬肌肉中F-2毒素及代謝組分分析，1為β-玉米赤霉烯醇，2為F-2毒素；

圖3為實(shí)施例3中豬肝臟中F-2毒素及代謝組分分析，1為β-玉米赤霉烯醇，2為F-2毒素；

圖4為實(shí)施例4中豬血清中F-2毒素及代謝組分分析，1為β-玉米赤霉烯醇，2為F-2毒素。

具體實(shí)施方式

為了使本發(fā)明所述的內(nèi)容更加便于理解，下面結(jié)合具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明所述的技術(shù)方案做進(jìn)一步的說明，但是本發(fā)明不僅限于此。

實(shí)施例1：

以體積比1：3的乙腈-水混合溶液配制樣品，以十八烷基鍵合硅膠顆粒填充柱為分離柱，在柱連續(xù)進(jìn)樣200μL；以甲醇、乙腈、水三元混合溶液為流動(dòng)相，以流速為1.0 mL/min進(jìn)行恒流等度洗脫；采用熒光檢測(cè)方式，激發(fā)波長為274 nm、發(fā)射波長為440 nm，在線測(cè)定F-2毒素組分，實(shí)現(xiàn)對(duì)痕量F-2毒素的色譜等度洗脫-熒光檢測(cè)，得到痕量β-玉米赤霉烯醇檢出圖，富集后熒光檢測(cè)的靈敏度最低可達(dá)0.05 ng/mL（圖1）。

實(shí)施例2：

取1g均質(zhì)的豬肌肉樣品，均勻攪碎，置放于10 mL離心管中，加入2.0 mL乙酸鈉溶液、3.0 mL無水乙醚，4000r/min離心10min，上清液轉(zhuǎn)移到另一離心管中；重復(fù)提取一次；合并提取液，40℃下氮?dú)獯蹈?；殘?jiān)?.5mL三氯甲烷溶解，超聲2min，加入1.5mL 0.5mol/L的氫氧化鈉溶液，4000r/min離心10min，轉(zhuǎn)移上清液；重復(fù)提取一次；合并提取液，40℃下氮?dú)獯蹈?，得固體備用。

在上述固體中加入體積比1：4的磷酸-水溶液0.5mL，混勻后轉(zhuǎn)入PEP固相萃取柱中，先用1.0 mL水淋洗，棄去；采用3.0ml甲醇洗脫，洗脫液于40℃下氮?dú)獯蹈?，殘?jiān)皿w積比為1：3的乙腈-水溶液1.0 mL溶解，過濾，取濾液待測(cè)。

以十八烷基鍵合硅膠顆粒填充柱為分離柱；在上述濾液中加入體積比1：3的乙腈-水混合溶液配制樣品，在柱連續(xù)進(jìn)樣200μL。以甲醇、乙腈、水三元混合溶液為流動(dòng)相，以流速為1.0 mL/min進(jìn)行恒流等度洗脫；采用熒光檢測(cè)方式，激發(fā)波長為274 nm、發(fā)射波長為440 nm，在線測(cè)定β-玉米赤霉烯醇、F-2毒素等組分，實(shí)現(xiàn)對(duì)痕量F-2毒素代謝組分的色譜等度洗脫-熒光檢測(cè)，得到肌肉中F-2毒素及代謝組分分析譜圖（圖2）。

實(shí)施例3：

取1g均質(zhì)的豬肝臟樣品，均勻攪碎，置放于10 mL離心管中，加入2.0 mL乙酸鈉溶液、3.0 mL無水乙醚，4000r/min離心10min，上清液轉(zhuǎn)移到另一離心管中；重復(fù)提取一次；合并提取液，40℃下氮?dú)獯蹈?；殘?jiān)?.5mL三氯甲烷溶解，超聲2min，加入1.5mL 0.5mol/L的氫氧化鈉溶液，4000r/min離心10min，轉(zhuǎn)移上清液；重復(fù)提取一次；合并提取液，40℃下氮?dú)獯蹈?，得固體備用。

在上述固體中加入體積比1：4的磷酸-水溶液0.5mL，混勻后轉(zhuǎn)入PEP固相萃取柱中，先用1.0 mL水淋洗，棄去；采用3.0ml甲醇洗脫，洗脫液于40℃下氮?dú)獯蹈桑瑲堅(jiān)皿w積比為1：3的乙腈-水溶液1.0 mL溶解，過濾，取濾液待測(cè)。

以十八烷基鍵合硅膠顆粒填充柱為分離柱；在上述濾液中加入體積比1：3的乙腈-水混合溶液配制樣品，在柱連續(xù)進(jìn)樣200μL。以甲醇、乙腈、水三元混合溶液為流動(dòng)相，以流速為1.0 mL/min進(jìn)行恒流等度洗脫；采用熒光檢測(cè)方式，激發(fā)波長為274 nm、發(fā)射波長為440 nm，在線測(cè)定β-玉米赤霉烯醇、F-2毒素等組分，實(shí)現(xiàn)對(duì)痕量F-2毒素代謝組分的色譜等度洗脫-熒光檢測(cè)，得到肝臟中F-2毒素及代謝組分分析譜圖（圖3）。

實(shí)施例4：

取 1.0 mL 血清于 10 mL 離心管中，加入 5.0 mL 乙酸乙酯，渦旋混勻 5min，3000r/min 離心 10 min 取上清液于 10 mL 玻璃離心管中，剩余殘?jiān)?4.0 mL 乙酸乙酯分兩次清洗，洗液轉(zhuǎn)入玻璃離心管中，40℃水浴氮?dú)獯蹈?，殘?jiān)?1.0 mL 流動(dòng)相溶解，3000 r/min 離心 10min，取上清液過濾，濾液待測(cè)。

以十八烷基鍵合硅膠顆粒填充柱為分離柱；在上述濾液中加入體積比1：3的乙腈-水混合溶液配制樣品，在柱連續(xù)進(jìn)樣200μL。以甲醇、乙腈、水三元混合溶液為流動(dòng)相，以流速為1.0 mL/min進(jìn)行恒流等度洗脫；采用熒光檢測(cè)方式，激發(fā)波長為274 nm、發(fā)射波長為440 nm，在線測(cè)定β-玉米赤霉烯醇、F-2毒素等組分，實(shí)現(xiàn)對(duì)痕量F-2毒素代謝組分的色譜等度洗脫-熒光檢測(cè)（圖4）。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，凡依本發(fā)明申請(qǐng)專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應(yīng)屬本發(fā)明的涵蓋范圍。