本發(fā)明屬于環(huán)境樣品檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及一種土壤和植物中1-羥基苯并三唑的檢測(cè)方法。

背景技術(shù)：

苯并三唑類化合物(Benzotriazoles，BTs)是一類具有苯并三唑雜環(huán)結(jié)構(gòu)的化合物，具有優(yōu)異的穩(wěn)定性和防腐蝕能力，與金屬接觸后，可在金屬表面絡(luò)合，形成一層保護(hù)層，從而阻止金屬的腐蝕。苯并三唑類化合物作為一種大量使用的添加劑，被廣泛的添加于冷凍液、液壓液、防凍劑、洗滌劑以及飛機(jī)除冰/防冰液等工業(yè)制品中。1-羥基苯并三唑(1-Hydroxybenzotriazole，HOBT)是其中一種常見(jiàn)的苯并三唑類化合物，基本信息如表1所示。

表1 HOBT的基本信息

近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，河流、湖泊、海洋和沉積物等環(huán)境介質(zhì)中檢測(cè)了多種苯并三唑類化合物，說(shuō)明隨著苯并三唑類化合物的大量使用，苯并三唑類化合物已在環(huán)境大量殘留，并作為一種新興污染物引起人們的重視。苯并三唑類化合物進(jìn)入環(huán)境的途徑主要有兩種，一是隨著產(chǎn)品的使用和拋棄，直接進(jìn)入環(huán)境中；二是通過(guò)城市污水管網(wǎng)進(jìn)入污水處理廠后，隨著污水和污泥的排放進(jìn)入環(huán)境中。大量研究表明，苯并三唑類化合物在傳統(tǒng)活性污泥法的污水處理廠中，去除率不高，出水和污泥中都含有較高濃度的苯并三唑類化合物。近年來(lái)，污水灌溉和污泥農(nóng)用等活動(dòng)越來(lái)越多，苯并三唑類化合物可能會(huì)進(jìn)入農(nóng)田土壤中，并被農(nóng)作物吸附和吸收，在食物鏈積累和富集，最終影響人類的健康與生存。

目前針對(duì)苯并三唑類化合物的檢測(cè)主要集中在河流、湖泊和沉積物等環(huán)境水系統(tǒng)中，但是對(duì)于它們?cè)谑峭寥篮椭参镏械姆治龇椒P(guān)注較少。另外，苯并三唑類化合物的研究主要在于苯并三唑、5-甲基-1H-苯并三唑和5,6-二甲基-1H-苯并三唑這三種化合物，對(duì)于1-羥基苯并三唑的研究較少。因此，為了了解土壤和植物中1-羥基苯并三唑的濃度水平和積累情況，需要建立一種高效靈敏的分析方法，用于土壤和植物中痕量1-羥基苯并三唑的檢測(cè)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為解決現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)和不足之處，本發(fā)明的目的在于提供一種1-羥基苯并三唑的提取、凈化和儀器分析方法，用于土壤和植物中1-羥基苯并三唑的定性和定量檢測(cè)。

加速溶劑萃取是近年使用較多的一種提取方法，可用于土壤、沉積物、污泥或生物樣品的提取。相比超聲提取、索氏抽提等提取方法，加速溶劑萃取法的操作更為簡(jiǎn)單，自動(dòng)化程度高，一般提取時(shí)間只需30分鐘，適合于大批量處理樣品；提取過(guò)程的溶劑使用量也大大減少，對(duì)環(huán)境更友好，是一種高效的提取方法。本發(fā)明在萃取池中加入基質(zhì)吸附劑，在提取過(guò)程中同步凈化，對(duì)于大多數(shù)的土壤樣品和色素含量低的植物樣品都能有較好的凈化效果，節(jié)省實(shí)驗(yàn)時(shí)間，提高方法靈敏度。對(duì)于秸稈、谷物等色素和脂肪含量較高的樣品，可在提取之后進(jìn)行固相萃取處理，進(jìn)一步凈化，降低基質(zhì)效應(yīng)。

高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM)，對(duì)目標(biāo)化合物有較高的選擇性和靈敏度，有效地降低了基質(zhì)干擾，適合復(fù)雜環(huán)境介質(zhì)中痕量目標(biāo)化合物的檢測(cè)。

本發(fā)明目的通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

一種土壤和植物中1-羥基苯并三唑的檢測(cè)方法，包括以下步驟：

(1)樣品前處理

將采集的土壤樣品或植物樣品進(jìn)行前處理；

(2)加速溶劑萃取

將步驟(1)前處理后的樣品采用加速溶劑萃取儀提取，得到待測(cè)樣品溶液；

(3)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制

用分析天平稱取1-羥基苯并三唑和1種內(nèi)標(biāo)物的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，分別配制成儲(chǔ)備溶液和工作溶液，最后配制成梯度濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液；

(4)高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測(cè)

在高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀中測(cè)定步驟(3)中的各濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，使用內(nèi)標(biāo)法建立標(biāo)準(zhǔn)工作曲線；在相同條件下將步驟(2)中的待測(cè)樣品溶液注入高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)行測(cè)定，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線計(jì)算溶液中1-羥基苯并三唑的濃度，然后根據(jù)樣品質(zhì)量計(jì)算得到樣品中1-羥基苯并三唑的含量；樣品溶液中1-羥基苯并三唑的濃度應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的線性范圍內(nèi)，若測(cè)得濃度超出標(biāo)準(zhǔn)工作曲線線性范圍，可減少樣品量再重新萃取和檢測(cè)。

步驟(1)中，土壤樣品前處理過(guò)程為：土壤樣品采集后，去除石塊等較大的雜質(zhì)，干燥后磨碎并過(guò)篩后待用；植物樣品前處理過(guò)程為：植物樣品采集后，去除泥沙，干燥后，采用植物粉碎機(jī)粉碎均勻待用。

步驟(1)中，所述干燥可選用自然風(fēng)干或冷凍干燥法，若選用冷凍干燥，樣品需在冰柜內(nèi)預(yù)冷凍24小時(shí)，再放入冷凍干燥儀內(nèi)進(jìn)行干燥。土壤樣品干燥后磨碎過(guò)0.90mm篩子；植物樣品干燥后使用植物粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎。樣品磨碎或粉碎后，應(yīng)盡快進(jìn)行提取，如批量較大，未能及時(shí)提取，應(yīng)將樣品密封保存于4℃的冰箱或冷庫(kù)中保存。

步驟(2)中，當(dāng)樣品為土壤樣品或色素含量低的植物樣品(如部分植物根部等地下部分、果肉、玉米芯等部分色素含量低的樣品)時(shí)提取過(guò)程為：在不銹鋼萃取池底部平鋪一張濾紙，加入一定量基質(zhì)吸附劑，輕敲萃取池使基質(zhì)吸附劑表面平整，然后加入前處理后的樣品，平整后滴加內(nèi)標(biāo)溶液，待內(nèi)標(biāo)溶液溶劑揮發(fā)后，加入石英砂，最后用放入另一張濾紙壓緊，擰緊萃取池，放入加速溶劑萃取儀內(nèi)進(jìn)行萃取；萃取完成后，萃取液通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干后，用1mL甲醇定容；用有機(jī)相尼龍濾膜，轉(zhuǎn)移至進(jìn)樣小瓶，待測(cè)；

當(dāng)樣品為植物秸稈和谷物等色素或脂肪含量較高(大部分植物莖葉等地上部分色素含量高的樣品，小麥粒、玉米粒等谷物脂肪含量高的樣品)的樣品時(shí)，萃取液顏色較深，直接上機(jī)檢測(cè)基質(zhì)干擾嚴(yán)重，峰型較差，可以凈化后再上機(jī)檢測(cè)，提取和凈化過(guò)程為：在不銹鋼萃取池底部平鋪一張濾紙，加入一定量基質(zhì)吸附劑，輕敲萃取池使基質(zhì)吸附劑表面平整，然后加入前處理后的樣品，平整后滴加內(nèi)標(biāo)溶液，待內(nèi)標(biāo)溶液溶劑揮發(fā)后，加入石英砂，最后用放入另一張濾紙壓緊，擰緊萃取池，放入加速溶劑萃取儀內(nèi)進(jìn)行萃?。惠腿⊥瓿珊?，萃取液通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干后，用1mL甲醇定容；取Florisil固相萃取柱(1000mg，6mL)，依次用10mL二氯甲烷和10mL甲醇預(yù)淋洗Florisil固相萃取柱，以活化小柱并去除部分雜質(zhì)，當(dāng)柱內(nèi)溶劑液面下降到接近填料表面時(shí)，立即加入待凈化樣品，用梨形燒瓶接收淋出液，用5mL甲醇涮洗樣品瓶，將涮洗溶液加入Florisil固相萃取柱內(nèi)，并重復(fù)兩次；梨形燒瓶接收所有淋出液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，用1mL甲醇定容，用有機(jī)相尼龍濾膜過(guò)濾，轉(zhuǎn)移至進(jìn)樣小瓶，待測(cè)。

步驟(2)中，內(nèi)標(biāo)溶液優(yōu)選為氘代噻苯噠唑(thiabendozole NH D6)。

步驟(2)中，所述的基質(zhì)吸附劑為硅膠和無(wú)水硫酸鈉，其作用是提取過(guò)程中同步凈化，節(jié)省實(shí)驗(yàn)時(shí)間。其中，硅膠為80～100目，依次用甲醇和二氯甲烷洗滌2次，晾干后，于120℃的烘箱中烘烤4小時(shí)，待用。加入基質(zhì)吸附劑的具體操作為，先加入1～3g硅膠，平整表面后，加入1～3g無(wú)水硫酸鈉，根據(jù)樣品量適當(dāng)增減基質(zhì)吸附劑的使用量。

步驟(2)中，優(yōu)選樣品量為2～8g。若樣品基質(zhì)干擾較大，或者目標(biāo)化合物的濃度較高，可減少樣品量，并將樣品與1～4倍質(zhì)量的石英砂混合均勻，再加入萃取池中。植物秸稈等蓬松的樣品加入萃取池后，可以輕壓樣品，減少體積。

步驟(2)中，所述的石英砂作為填充劑加入，加入量2～5g，視樣品量而定，一方面的作用是填充萃取池的空間，在萃取充分的前提下，減少提取溶劑的使用量；另一方面是保護(hù)萃取池中的樣品，防止基質(zhì)吸附劑和樣品在提取過(guò)程中被高壓注入的溶劑沖散。

步驟(2)中，優(yōu)選的萃取條件如下：萃取池容量為34mL，提取溶劑為甲醇和二氯甲烷的混合溶劑，其中甲醇比例為80％～100％(體積比)，為提高回收率，可在提取溶劑中加入提取溶劑總體積0.005％～0.01％的甲酸；提取溫度為80～120℃；靜態(tài)提取時(shí)間為4～6min，氮?dú)獯祾邥r(shí)間為30～60s；靜態(tài)循環(huán)次數(shù)為2～3次。

步驟(3)中，優(yōu)選的內(nèi)標(biāo)物為氘代噻苯噠唑(thiabendozole NH D6)，標(biāo)準(zhǔn)工作曲線包括5～7個(gè)梯度濃度。

步驟(4)中液相色譜條件為：色譜柱：Agilent SB-C18，柱長(zhǎng)100mm，內(nèi)徑3.0mm，填料粒徑1.8μm；流動(dòng)相A：0.01％(體積)甲酸水溶液；流動(dòng)相B：甲醇；梯度洗脫：0～4min 40％～90％流動(dòng)相B，5～10min 90％流動(dòng)相B；流速：0.30mL/min；柱溫40℃；進(jìn)樣量5～10μL。

步驟(4)中質(zhì)譜條件：離子源：電噴霧離子化源(ESI)，正模式檢測(cè)；干燥氣溫度300℃，流速3mL/min；鞘氣溫度250℃，流速11mL/min；噴霧氣壓力為45psi；掃描模式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM)。在上述條件下，1-羥基苯并三唑和內(nèi)標(biāo)的質(zhì)譜參數(shù)如表2所示。

表2 HOBT和內(nèi)標(biāo)在LC-MS/MS中的質(zhì)譜參數(shù)

a粗體為定量離子

本發(fā)明利用加速溶劑萃取技術(shù)，建立了快速高效的提取方法,經(jīng)過(guò)同步凈化和固相萃取凈化后，利用三重串聯(lián)四級(jí)桿液質(zhì)聯(lián)用儀檢測(cè)，有效地對(duì)土壤和植物中的痕量1-羥基苯并三唑進(jìn)行了定量分析。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：

(1)提取溶劑使用甲酸酸化的混和有機(jī)溶劑，有效抑制1-羥基苯并三唑的離子化以及提取過(guò)程中的降解，顯著提高了1-羥基苯并三唑的回收率。

(2)在萃取池內(nèi)加入硅膠和無(wú)水硫酸鈉作為基質(zhì)吸附劑，提取過(guò)程中同步凈化，對(duì)于土壤或沉積物等樣品，有效降低了基質(zhì)干擾，萃取液濃縮后可直接上機(jī)檢測(cè)，減少了凈化和富集的步驟，減少實(shí)驗(yàn)時(shí)間，加快實(shí)驗(yàn)效率，特別適合大批量樣品的分析檢測(cè)。

(3)對(duì)于秸稈、谷物等色素和脂肪含量較高的樣品，在萃取后增加了固相萃取凈化的步驟，使用Florisil固相萃取柱凈化后，進(jìn)一步降低了基質(zhì)干擾，提高方法靈敏度。

(4)本發(fā)明使用內(nèi)標(biāo)法定量，內(nèi)標(biāo)物氘代噻苯噠唑與目標(biāo)化合物性質(zhì)相近，在儀器中的保留時(shí)間接近，在樣品萃取前加入樣品中，抵消了目標(biāo)化合物在萃取過(guò)程中損失所造成的誤差，多次實(shí)驗(yàn)中都得到了較好的回收率，是一種理想的內(nèi)標(biāo)物。

(4)目前我國(guó)研究人員對(duì)于環(huán)境中1-羥基苯并三唑的關(guān)注少，關(guān)于土壤和植物中1-羥基苯并三唑的分析檢測(cè)技術(shù)更是處于技術(shù)空白，主要是由于土壤和植物樣品中基質(zhì)復(fù)雜導(dǎo)致基質(zhì)干擾嚴(yán)重，常規(guī)檢測(cè)方法的靈敏度較低，造成分析困難。本發(fā)明從前處理和儀器分析方面提供了一套高效、快速和準(zhǔn)確的土壤和植物中1-羥基苯并三唑的提取和分析技術(shù)，填補(bǔ)了目前國(guó)內(nèi)的技術(shù)空白。1-羥基苯并三唑的回收率為92.6％，標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.4％，基質(zhì)效應(yīng)為90.7％，檢出限為0.15ng/g，定量限為0.51ng/g；植物樣品中，1-羥基苯并三唑的回收率為89.8％，標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.6％，基質(zhì)效應(yīng)為90.3％，檢出限為0.69ng/g，定量限為2.31ng/g，適用于土壤和植物介質(zhì)中1-羥基苯并三唑的分析檢測(cè)。

附圖說(shuō)明

圖1為1-羥基苯并三唑(HOBT)和內(nèi)標(biāo)物氘代噻苯噠唑(thiabendozole NH D6)的特征離子流圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。

實(shí)施例中使用的儀器與試劑

目標(biāo)化合物1-羥基苯并三唑(HOBT，99％)和內(nèi)標(biāo)物氘代噻苯噠唑(thiabendozole NH D6，99％)，購(gòu)自于Dr.Ehrenstorfer公司。實(shí)驗(yàn)所用甲醇和二氯甲烷均為進(jìn)口色譜純，所用水為Milli-Q水；無(wú)水硫酸鈉、硅膠、石英砂為國(guó)產(chǎn)分析純；實(shí)驗(yàn)所用玻璃器皿均用自來(lái)水洗凈，Milli-Q水沖洗，烘干后，于馬弗爐中300℃以上烘烤3～4小時(shí)。

提取儀器為加速溶劑提取儀ASE 300(Dionex,Sunnyvale,CA,USA)配置34mL不銹鋼萃取池。檢測(cè)儀器為高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(LC-MS/MS)Agilent1200RRLC/Agilent G6460A Triple Quadrupole。

實(shí)施例1

(1)樣品前處理

土壤樣品采集100g，去除石塊等較大的雜質(zhì)，冷凍干燥后磨碎并過(guò)0.90mm篩。

(2)加速溶劑萃取

樣品采用加速溶劑萃取儀提取，提取過(guò)程：在不銹鋼萃取池底部平鋪一張濾紙，加入2.0g硅膠，輕敲萃取池，使硅膠表面平整，然后加入2.0g無(wú)水硫酸鈉，平整表面后，加入5.0g土壤樣品，平整后滴加100μL 1mg/L的內(nèi)標(biāo)物氘代噻苯噠唑工作溶液，待內(nèi)標(biāo)溶液溶劑揮發(fā)后，加入5.0g石英砂，最后用放入另一張濾紙壓緊，擰緊萃取池，放入加速溶劑萃取儀內(nèi)進(jìn)行萃取。提取溶劑為甲醇/二氯甲烷(體積比為90：10)并加入提取溶劑總體積0.01％的甲酸，提取溫度為100℃，靜態(tài)提取時(shí)間為5min，氮?dú)獯祾邥r(shí)間為60s，靜態(tài)提取循環(huán)2次。萃取完成后，萃取液通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干后，用1mL甲醇定容，過(guò)0.22μm有機(jī)相尼龍濾膜，并轉(zhuǎn)移至進(jìn)樣小瓶中，待上機(jī)檢測(cè)。

(3)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制

用分析天平稱取1-羥基苯并三唑和內(nèi)標(biāo)物氘代噻苯噠唑的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，分別用甲醇配制成100mg/L儲(chǔ)備溶液并稀釋成1mg/L工作溶液，最后配制成濃度為1、5、10、20、50、100和200μg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，其中內(nèi)標(biāo)物濃度為100μg/L，使用內(nèi)標(biāo)法建立標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。

(4)高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測(cè)

液相色譜條件為：色譜柱：Agilent SB-C18，柱長(zhǎng)100mm，內(nèi)徑3.0mm，填料粒徑1.8μm；流動(dòng)相A：0.01％甲酸水溶液(體積比)；流動(dòng)相B：甲醇；梯度洗脫：0～4min 40％～90％流動(dòng)相B，5～10min 90％流動(dòng)相B；流速：0.30mL/min；柱溫40℃；進(jìn)樣量5μL。

質(zhì)譜條件：離子源：電噴霧離子化源(ESI)，正模式檢測(cè)；干燥氣溫度300℃，流速3mL/min；鞘氣溫度250℃，流速11mL/min；噴霧氣壓力為45psi；掃描模式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM)。

在上述條件下，1-羥基苯并三唑和內(nèi)標(biāo)物氘代噻苯噠唑的質(zhì)譜參數(shù)如表2所示。

在高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀中測(cè)定步驟(3)中的各濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液注入，使用內(nèi)標(biāo)法建立標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。在相同條件下將步驟(2)中凈化后的樣品溶液注入高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)行測(cè)定，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線計(jì)算溶液中1-羥基苯并三唑的濃度，然后根據(jù)樣品質(zhì)量計(jì)算得到樣品中1-羥基苯并三唑的含量。

定性鑒定：在相同儀器條件下，若樣品中1-羥基苯并三唑的色譜峰保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中相應(yīng)的目標(biāo)化合物保留時(shí)間相一致，并且定性和定量離子對(duì)的豐度比與標(biāo)準(zhǔn)溶液一樣，則可判斷樣品中存在1-羥基苯并三唑。

定量分析：以標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的結(jié)果建立標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，線性范圍0～200μg/L，標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)>0.999，通過(guò)1-羥基苯并三唑和內(nèi)標(biāo)物的定量離子峰面積之比，計(jì)算1-羥基苯并三唑的濃度，最后按樣品量計(jì)算樣品中1-羥基苯并三唑的濃度。

加標(biāo)回收率、重復(fù)性和基質(zhì)效應(yīng)：

回收率采用3次平行加標(biāo)，加標(biāo)方法為：在5.0g土壤樣品中加入100μL 1mg/L 1-羥基苯并三唑標(biāo)準(zhǔn)溶液，使得樣品中1-羥基苯并三唑的濃度為20ng/g，等待30min后，溶劑揮發(fā)完全，1-羥基苯并三唑吸附于樣品中，按步驟(2)進(jìn)行提取和檢測(cè)。將實(shí)際測(cè)定的加標(biāo)樣品濃度減去空白樣品濃度，并與理論添加濃度進(jìn)行比較，得到1-羥基苯并三唑的回收率，方法重復(fù)性以3個(gè)平行加標(biāo)結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差表示?；|(zhì)效應(yīng)測(cè)試方法：將空白樣品提取和濃縮至1mL后，取100μL的樣品溶液，在氮吹儀上吹干，加入100μL濃度為100μg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，旋渦振蕩，上機(jī)檢測(cè)。將實(shí)際測(cè)定的加標(biāo)樣品濃度減去空白樣品濃度，并與理論添加濃度進(jìn)行比較，得到方法的基質(zhì)效應(yīng)結(jié)果。方法的加標(biāo)回收率、重復(fù)性和基質(zhì)效應(yīng)結(jié)果見(jiàn)表3所示，可以看出，土壤中加標(biāo)濃度為20ng/g的情況下，1-羥基苯并三唑的平均回收率為92.6％，標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.4％，基質(zhì)效應(yīng)為90.7％，說(shuō)明方法回收率和重復(fù)性好、基質(zhì)干擾低，可用于土壤樣品的檢測(cè)。

檢出限和定量限：

樣品信號(hào)強(qiáng)度達(dá)到3倍噪音強(qiáng)度時(shí)對(duì)應(yīng)的濃度為檢出限，樣品信號(hào)強(qiáng)度達(dá)到10倍噪音強(qiáng)度時(shí)對(duì)應(yīng)的濃度為定量限，具體操作為：利用數(shù)據(jù)處理軟件計(jì)算出加標(biāo)濃度下的信噪比，用加標(biāo)濃度除以信噪比，該結(jié)果的3倍為該方法的檢測(cè)限，10倍為定量限。方法的檢出限和定量限結(jié)果如表3所示，可以看出，土壤中加標(biāo)濃度為20ng/g的情況下，1-羥基苯并三唑的檢出限為0.15ng/g，定量限為0.51ng/g，說(shuō)明本檢測(cè)方法靈敏度高，可用于土壤樣品中痕量1-羥基苯并三唑的檢測(cè)。

表3 方法回收率、基質(zhì)效應(yīng)、檢出限和定量限

^a平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(％)(n＝3)；^b平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(％)(n＝3)；^c(ng/g)；^d(ng/g)

實(shí)施例2

(1)樣品前處理

小麥粒樣品采集50g，去除明顯的雜質(zhì)，冷凍干燥后使用植物粉碎機(jī)磨碎。

(2)加速溶劑萃取

樣品采用加速溶劑萃取儀提取，提取過(guò)程：在不銹鋼萃取池底部平鋪一張濾紙，加入2.0g硅膠，輕敲萃取池，使硅膠表面平整，然后加入3.0g無(wú)水硫酸鈉，平整表面后，加入5.0g小麥粒樣品，平整后滴加100μL 1mg/L的內(nèi)標(biāo)物氘代噻苯噠唑工作溶液，待內(nèi)標(biāo)溶液溶劑揮發(fā)后，加入2.0g石英砂，最后用放入另一張濾紙壓緊，擰緊萃取池，放入加速溶劑萃取儀內(nèi)進(jìn)行萃取。提取溶劑為甲醇/二氯甲烷(體積比為80：20)并加入提取溶劑總體積0.01％的甲酸，提取溫度為100℃，靜態(tài)提取時(shí)間為5min，氮?dú)獯祾邥r(shí)間為60s，靜態(tài)提取循環(huán)2次。萃取完成后，萃取液通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干后，用1mL甲醇定容，待進(jìn)一步凈化。

(3)固相萃取凈化

取Florisil固相萃取柱(1000mg，6mL)于固相萃取裝置上，依次用10mL二氯甲烷和10mL甲醇預(yù)淋洗小柱(指Florisil固相萃取柱)，以活化小柱并去除部分雜質(zhì)，當(dāng)柱內(nèi)溶劑液面接近填料表面時(shí)，立即加入待凈化樣品，用梨形燒瓶接收淋出液，用5mL甲醇涮洗樣品瓶，將涮洗溶液加入小柱內(nèi)，并重復(fù)兩次。梨形燒瓶接收所有淋出液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，用1mL甲醇定容，用有機(jī)相尼龍濾膜過(guò)濾，轉(zhuǎn)移至進(jìn)樣小瓶，待測(cè)。

(4)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制

用分析天平稱取1-羥基苯并三唑和內(nèi)標(biāo)物氘代噻苯噠唑的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，分別用甲醇配制成100mg/L儲(chǔ)備溶液并稀釋成1mg/L工作溶液，最后配制成濃度為1、5、10、20、50、100和200μg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，其中內(nèi)標(biāo)物濃度為100μg/L，使用內(nèi)標(biāo)法建立標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。

(5)高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測(cè)

液相色譜條件為：色譜柱：Agilent SB-C18，柱長(zhǎng)100mm，內(nèi)徑3.0mm，填料粒徑1.8μm；流動(dòng)相A：0.01％甲酸水溶液(體積比)；流動(dòng)相B：甲醇；梯度洗脫：0～4min 40％～90％流動(dòng)相B，5～10min 90％流動(dòng)相B；流速：0.30mL/min；柱溫40℃；進(jìn)樣量5μL。

質(zhì)譜條件：離子源：電噴霧離子化源(ESI)，正模式檢測(cè)；干燥氣溫度300℃，流速3mL/min；鞘氣溫度250℃，流速11mL/min；噴霧氣壓力為45psi；掃描模式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM)。

在上述條件下，1-羥基苯并三唑和內(nèi)標(biāo)物氘代噻苯噠唑的質(zhì)譜參數(shù)如表2所示。

在高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀中測(cè)定步驟(4)中的各濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液注入，使用內(nèi)標(biāo)法建立標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。在相同條件下將步驟(3)中凈化后的樣品溶液注入高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)行測(cè)定，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線計(jì)算溶液中1-羥基苯并三唑的濃度，然后根據(jù)樣品質(zhì)量計(jì)算得到樣品中1-羥基苯并三唑的含量。

定性鑒定：在相同儀器條件下，若樣品中1-羥基苯并三唑的色譜峰保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中相應(yīng)的目標(biāo)化合物保留時(shí)間相一致，并且定性和定量離子對(duì)的豐度比與標(biāo)準(zhǔn)溶液一樣，則可判斷樣品中存在1-羥基苯并三唑。

定量分析：以標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的結(jié)果建立標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，線性范圍0～200μg/L，標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)>0.999，通過(guò)1-羥基苯并三唑和內(nèi)標(biāo)物的定量離子峰面積之比，計(jì)算1-羥基苯并三唑的濃度，最后按樣品量計(jì)算樣品中1-羥基苯并三唑的濃度。

加標(biāo)回收率、重復(fù)性和基質(zhì)效應(yīng)：

回收率采用3次平行加標(biāo)，加標(biāo)方法為：在5.0g小麥粒樣品中加入100μL1mg/L 1-羥基苯并三唑標(biāo)準(zhǔn)溶液，使得樣品中1-羥基苯并三唑的濃度為20ng/g，等待30min后，溶劑揮發(fā)完全，1-羥基苯并三唑吸附于樣品中，按步驟(2)進(jìn)行提取和檢測(cè)。將實(shí)際測(cè)定的加標(biāo)樣品濃度減去空白樣品濃度，并與理論添加濃度進(jìn)行比較，得到1-羥基苯并三唑的回收率，方法重復(fù)性以3個(gè)平行加標(biāo)結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差表示?；|(zhì)效應(yīng)測(cè)試方法：將空白樣品提取和濃縮至1mL后，取100μL的樣品溶液，在氮吹儀上吹干，加入100μL濃度為100μg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，旋渦振蕩，上機(jī)檢測(cè)。將實(shí)際測(cè)定的加標(biāo)樣品濃度減去空白樣品濃度，并與理論添加濃度進(jìn)行比較，得到方法的基質(zhì)效應(yīng)結(jié)果。方法的加標(biāo)回收率、重復(fù)性和基質(zhì)效應(yīng)結(jié)果見(jiàn)表4所示，可以看出，小麥粒中加標(biāo)濃度為20ng/g的情況下，1-羥基苯并三唑的平均回收率為89.8％，標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.6％，基質(zhì)效應(yīng)為90.3％，說(shuō)明方法回收率和重復(fù)性好、基質(zhì)干擾低，可用于植物樣品的檢測(cè)。

檢出限和定量限：

樣品信號(hào)強(qiáng)度達(dá)到3倍噪音強(qiáng)度時(shí)對(duì)應(yīng)的濃度為檢出限，樣品信號(hào)強(qiáng)度達(dá)到10倍噪音強(qiáng)度時(shí)對(duì)應(yīng)的濃度為定量限，具體操作為：利用數(shù)據(jù)處理軟件計(jì)算出加標(biāo)濃度下的信噪比，用加標(biāo)濃度除以信噪比，該結(jié)果的3倍為該方法的檢測(cè)限，10倍為定量限。方法的檢出限和定量限結(jié)果如表3所示，可以看出，小麥粒中加標(biāo)濃度為20ng/g的情況下，1-羥基苯并三唑的檢出限為0.69ng/g，定量限為2.31ng/g，說(shuō)明本檢測(cè)方法靈敏度高，可用于植物樣品中痕量1-羥基苯并三唑的檢測(cè)。

表4 方法回收率、基質(zhì)效應(yīng)、檢出限和定量限

^a平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(％)(n＝3)；^b平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(％)(n＝3)；^c(ng/g)；^d(ng/g)

上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。