本發(fā)明屬于煙草領(lǐng)域，具體涉及一種檢測(cè)煙草樣品中松蘿科植物特征成分的方法。

背景技術(shù)：

松蘿科植物提取物具有獨(dú)特的自然清香和濃郁的樹(shù)脂氣息，留香比較持久，是重要的天然香料。松蘿科植物提取物應(yīng)用于卷煙加香后，可以增進(jìn)陳煙風(fēng)味，能掩蓋煙草雜氣和泥土氣息，襯托獨(dú)特的卷煙風(fēng)格，賦予卷煙苔樣的青香香氣風(fēng)格，明顯增加煙氣濃度，并且能改善口腔和喉部的舒適感，在煙用香精的調(diào)配中也起著舉足輕重的作用。

松蘿科植物提取物的加工工藝不同，產(chǎn)品以浸膏或凈油形式存在，其中還有大量的色素、植物蠟等雜質(zhì)，導(dǎo)致其香氣質(zhì)量和純度欠佳，給卷煙余味帶來(lái)不利影響。浸膏質(zhì)量和成分隨土壤成分、氣候條件、生長(zhǎng)季節(jié)、生成年齡、收割時(shí)間、儲(chǔ)運(yùn)情況等變化而變化，即使同一地區(qū)的樹(shù)苔原料，發(fā)酵、加工等工藝的細(xì)微變化也會(huì)引起其中特征成分含量的波動(dòng)。測(cè)定煙草樣品中松蘿科植物的特征成分，直接客觀地判斷成分的含量波動(dòng)，對(duì)卷煙配方設(shè)計(jì)、產(chǎn)品維護(hù)及質(zhì)量控制等方面都有指導(dǎo)借鑒意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，使用氣相色譜質(zhì)譜法(GC-MS)檢測(cè)煙草樣品中松蘿科植物特征成分，若僅依靠總離子流豐度的方法，難以實(shí)現(xiàn)對(duì)其特征成分的跟蹤，原因在于：

1.松蘿科植物提取物在煙草中的施加量不超過(guò)0.005％，其中的特征致香成分僅占其中的1/10；

2.煙絲中含有大量的酸、堿、糖、蛋白、淀粉、果膠、蠟質(zhì)等，復(fù)雜的基質(zhì)嚴(yán)重干擾特征成分的鑒別；

3.煙絲熱解燃燒后，隨煙氣遷移進(jìn)入口腔的有效成分更為稀少。

因此，除了感官評(píng)價(jià)外，為了更有效認(rèn)識(shí)這種特征香料在煙草樣品中的形態(tài)，需要更好的檢測(cè)煙草樣品中松蘿科植物特征成分的方法。

本發(fā)明第一方面提供一種煙草樣品中松蘿科植物特征成分的檢測(cè)方法，包括以下步驟：

a)用含內(nèi)標(biāo)物的萃取溶劑萃取煙草樣品，獲得樣品溶液；

b)用松蘿科植物特征成分、內(nèi)標(biāo)物和所述萃取溶劑配制系列濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液；

c)用氣相色譜-質(zhì)譜法測(cè)定所述系列濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液中的松蘿科植物特征成分，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)；

d)用氣相色譜-質(zhì)譜法測(cè)定所述樣品溶液中的松蘿科植物特征成分的含量，采用內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法定量；

e)計(jì)算煙草樣品中松蘿科植物特征成分的含量；

所述內(nèi)標(biāo)物為乙酸苯乙酯；

所述萃取溶劑為二氯甲烷；

所述氣相色譜-質(zhì)譜法參數(shù)包括：采用選擇離子法，色譜柱為苯基亞芳基聚合物(性能上等同于5％-苯基)-甲基聚硅氧烷毛細(xì)管色譜柱；

所述松蘿科植物特征成分選自：苔黑酚、苔黑酚單甲醚、苔黑酚羧酸乙酯和β-苔黑酚羧酸甲酯中的一種或多種。

所述松蘿科植物特征成分可以包括苔黑酚。

所述松蘿科植物特征成分可以包括苔黑酚單甲醚。

所述松蘿科植物特征成分可以包括苔黑酚羧酸乙酯。

所述松蘿科植物特征成分可以包括β-苔黑酚羧酸甲酯。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明任一項(xiàng)所述的方法，所述氣相色譜-質(zhì)譜法的色譜參數(shù)包括以下一項(xiàng)或多項(xiàng)：

-色譜柱型號(hào)：J&W DB-5ms；

-色譜柱尺寸：30m×0.25mm×0.25μm；

-進(jìn)樣口溫度：240～260℃(例如250℃)；

-進(jìn)樣量：0.5～1.5μL(例如1μL)；

-分流比：8～12:1(例如10:1)；

-載氣流速：1～2mL/min(例如1.5mL/min)；

-吹掃氣流速：4～6mL/min(例如5mL/min)；

-采用程序升溫，升溫程序?yàn)椋?/p>

初始50～70℃(例如60℃)，保持1～3min(例如2min)，

以3～5℃/min(例如4℃/min)速率升溫至230～250℃(例如240℃)，保持0.5～1.5min(例如1min)，

以15～25℃/min(例如20℃/min)速率升溫至250～270℃(例如260℃)，保持4～6min(例如5min)。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明任一項(xiàng)所述的方法，所述氣相色譜-質(zhì)譜法的質(zhì)譜參數(shù)包括以下一項(xiàng)或多項(xiàng)：

-離子源：電子轟擊源；

-電子能：60～80eV；

-傳輸線(xiàn)溫度：200～300℃(例如250℃)；

-離子源溫度：200～300℃(例如250℃)；

-四級(jí)桿溫度100～200℃(例如150℃)；

-溶劑延遲：6～10min(例如8min)；

-采用SCAN和SIM同時(shí)掃描，質(zhì)量掃描范圍m/z 45～300；

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明任一項(xiàng)所述的方法，所述氣相色譜-質(zhì)譜法的質(zhì)譜參數(shù)包括以下一項(xiàng)或多項(xiàng)：

-乙酸苯乙酯的定性離子為m/z43，91和104的離子，定量離子為m/z104的離子；

-苔黑酚單甲醚的定性離子為m/z76，107和138的離子，定量離子為m/z138的離子；

-苔黑酚的定性離子為m/z67，95和124的離子，定量離子為m/z124的離子；

-β-苔黑酚羧酸甲酯的定性離子為m/z136，164和196的離子，定量離子為m/z136的離子；

-苔黑酚羧酸乙酯的定性離子為m/z122，150和196的離子，定量離子為m/z150的離子。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明任一項(xiàng)所述的方法，步驟a)包括：

-將煙草樣品用含內(nèi)標(biāo)的萃取溶劑超聲萃取，過(guò)濾，收集濾液；

-在濾液中加入飽和氯化鈉溶液和鹽酸，振蕩，離心分液，收集有機(jī)相；

-將有機(jī)相用無(wú)水硫酸鈉干燥，用PTFE濾膜過(guò)濾，獲得樣品溶液。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明任一項(xiàng)所述的方法，所述煙草樣品為卷煙主流煙氣的總粒相物，步驟a)包括：

-用劍橋?yàn)V片收集卷煙主流煙氣的總粒相物；

-將含有總粒相物的劍橋?yàn)V片用含內(nèi)標(biāo)的萃取溶劑超聲萃取，過(guò)濾，收集濾液；

-在濾液中加入飽和氯化鈉溶液和鹽酸，振蕩，離心分液，收集有機(jī)相。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明任一項(xiàng)所述的方法，所述煙草樣品為煙絲，步驟a)包括：

-將煙絲用含內(nèi)標(biāo)的萃取溶劑超聲萃取，過(guò)濾，收集濾液；

-在濾液中加入飽和氯化鈉溶液和鹽酸，振蕩，離心分液，收集有機(jī)相。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明任一項(xiàng)所述的方法，步驟b)中，所述系列濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液為基質(zhì)匹配系列濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液；

優(yōu)選地，所述基質(zhì)匹配系列濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備方法包括以下步驟：

-用溶劑萃取煙草樣品，獲得煙草樣品的基質(zhì)溶液；

-用松蘿科植物特征成分、所述內(nèi)標(biāo)物和所述萃取溶劑配制不同濃度的松蘿科植物特征成分的溶液；

-將基質(zhì)溶液氮吹至近干，再分別加入不同濃度的松蘿科植物特征成分的溶液，得到基質(zhì)匹配系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明任一項(xiàng)所述的方法，所述系列濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度范圍為0.01μg/mL～2.0μg/mL。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明任一項(xiàng)所述的方法，所述鹽酸濃度范圍為2％～5％。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明任一項(xiàng)所述的方法，其包括以下步驟中的一步或多步：

1.標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

1.1內(nèi)標(biāo)溶液和標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：稱(chēng)取乙酸苯乙酯的標(biāo)準(zhǔn)品，加入溶劑定容，配成內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備溶液。準(zhǔn)確稱(chēng)取松蘿科植物特征成分，加入溶劑定容，配成標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。移取系列體積標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液和適量?jī)?nèi)標(biāo)儲(chǔ)備溶液，配制成一般系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：對(duì)應(yīng)不同煙草制品，使用萃取溶劑萃取并前處理，得到煙草制品的基質(zhì)溶液。移取適量基質(zhì)溶液，氮吹至近干，再加入等體積的1.1配制的一般標(biāo)準(zhǔn)溶液，得到基質(zhì)匹配系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2.樣品前處理

2.1萃取溶液的配制：在萃取溶劑中加入適量的內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備溶液，得到內(nèi)標(biāo)萃取溶液。

2.2煙草制品的前處理：煙草制品使用適當(dāng)體積的內(nèi)標(biāo)萃取溶液并輔以超聲萃取，過(guò)濾后濾液使用飽和食鹽水和鹽酸洗滌?；旌先芤红o置后離心分層，移除水相，有機(jī)相用無(wú)水硫酸鈉干燥后，氣相色譜質(zhì)譜進(jìn)樣。

3.樣品的定性檢測(cè)：氣相色譜質(zhì)譜總離子流圖確定待測(cè)組分的保留時(shí)間，確定待測(cè)組分的定性離子和定量離子。

4.樣品的定量檢測(cè)

4.1繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)：將步驟1.2中的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行氣相色譜質(zhì)譜選擇離子測(cè)定，以目標(biāo)成分與內(nèi)標(biāo)的定量離子峰面積比為縱坐標(biāo)，以目標(biāo)成分的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制對(duì)應(yīng)煙草制品基質(zhì)中的松蘿科植物特征成分的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)，得到線(xiàn)性回歸方程。

4.2樣品的測(cè)定：將步驟2.2中的待測(cè)溶液進(jìn)行氣相色譜質(zhì)譜選擇離子測(cè)定，將獲得的待測(cè)溶液中目標(biāo)成分/內(nèi)標(biāo)的定量離子峰面積比代入4.1中的線(xiàn)性回歸方程，計(jì)算得到目標(biāo)成分的質(zhì)量濃度，進(jìn)而換算得到在煙草制品中的含量。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明任一項(xiàng)所述的方法，所述煙草樣品選自煙葉、煙絲、再造煙葉、電子煙液、卷煙紙、內(nèi)襯紙、濾棒、卷煙包裝盒中的一種或多種。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括：

1.標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

1.1內(nèi)標(biāo)溶液和標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：稱(chēng)取乙酸苯乙酯的標(biāo)準(zhǔn)品，加入萃取溶劑定容，配成內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備溶液。稱(chēng)取松蘿科植物特征成分，加入萃取溶劑定容，配成標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。移取系列體積標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液和適量?jī)?nèi)標(biāo)儲(chǔ)備溶液，配制成一般系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：使用萃取溶劑萃取不含松蘿科植物特征成分的對(duì)照煙草樣品，得到煙草樣品的基質(zhì)溶液。移取適量基質(zhì)溶液，氮吹至近干，再加入等體積的1.1配制的一般系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，得到基質(zhì)匹配系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2.樣品前處理

2.1萃取溶液的配制：在萃取溶劑中加入適量的內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備溶液，得到內(nèi)標(biāo)萃取溶液。

2.2煙草樣品的前處理：煙草樣品使用適當(dāng)體積的內(nèi)標(biāo)萃取溶液并輔以超聲萃取，過(guò)濾后濾液使用飽和食鹽水和鹽酸洗滌?；旌先芤红o置后離心分層，移除水相，有機(jī)相用無(wú)水硫酸鈉干燥后，氣相色譜質(zhì)譜進(jìn)樣。

3.樣品的定性檢測(cè)：氣相色譜質(zhì)譜總離子流圖確定待測(cè)組分的保留時(shí)間，確定待測(cè)組分的定性離子和定量離子。

4.樣品的定量檢測(cè)

4.1繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)：將步驟1.2中的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行氣相色譜質(zhì)譜選擇離子測(cè)定，以目標(biāo)成分與內(nèi)標(biāo)的定量離子峰面積比為縱坐標(biāo)，以目標(biāo)成分的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制對(duì)應(yīng)煙草樣品基質(zhì)中的松蘿科植物特征成分的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)，得到線(xiàn)性回歸方程。

4.2樣品的測(cè)定：將步驟2.2中的待測(cè)溶液進(jìn)行氣相色譜質(zhì)譜選擇離子測(cè)定，將獲得的待測(cè)溶液中目標(biāo)成分/內(nèi)標(biāo)的定量離子峰面積比代入4.1中的線(xiàn)性回歸方程，計(jì)算得到目標(biāo)成分的質(zhì)量濃度，進(jìn)而換算得到在煙草樣品中的含量。

本發(fā)明的有益效果

公開(kāi)實(shí)施方案的一個(gè)或多個(gè)方法具有以下一項(xiàng)或多項(xiàng)優(yōu)點(diǎn)：

1.使用萃取溶劑直接提取法，與經(jīng)典的同時(shí)蒸餾萃取法相比，避免了高溫加熱所造成的成分降解以及微量成分的喪失，也縮短了前處理的時(shí)間；

2.使用氣相色譜質(zhì)譜選擇離子法，大幅降低了煙草樣品復(fù)雜基質(zhì)的干擾，提高了檢測(cè)的靈敏度；

3.為了進(jìn)一步降低基質(zhì)效應(yīng)對(duì)定量結(jié)果的影響，針對(duì)不同基質(zhì)繪制相應(yīng)的工作曲線(xiàn)，保證不同煙草樣品間數(shù)據(jù)的可比性；

4.通過(guò)優(yōu)化氣相色譜質(zhì)譜參數(shù)，使得檢測(cè)方法的檢出限和定量限較低、加標(biāo)回收率接近100％、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)較低。

附圖說(shuō)明

圖1濃度為0.1μg/mL的一般標(biāo)準(zhǔn)溶液的總離子流色譜圖和選擇離子色譜圖；

圖2濃度為1.0μg/mL的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液的總離子流色譜圖和選擇離子色譜圖；

圖1、2中，各曲線(xiàn)含義如下：0-松蘿科植物特征成分的總離子流色譜；1-苔黑酚單甲醚的選擇離子色譜，2-苔黑酚的選擇離子色譜，3-β-苔黑酚羧酸甲酯的選擇離子色譜，4-苔黑酚羧酸乙酯的選擇離子色譜。

具體實(shí)施方式

現(xiàn)在將詳細(xì)提及本發(fā)明的具體實(shí)施方案。具體實(shí)施方案的例子圖示在附圖中。盡管結(jié)合這些具體的實(shí)施方案描述本發(fā)明，但應(yīng)認(rèn)識(shí)到不打算限制本發(fā)明到這些具體實(shí)施方案。相反，這些實(shí)施方案意欲覆蓋可包括在由權(quán)利要求限定的發(fā)明精神和范圍內(nèi)的替代、改變或等價(jià)實(shí)施方案。在下面的描述中，闡述了大量具體細(xì)節(jié)以便提供對(duì)本發(fā)明的全面理解。本發(fā)明可在沒(méi)有部分或全部這些具體細(xì)節(jié)的情況下被實(shí)施。在其它情況下，為了不使本發(fā)明不必要地模糊，沒(méi)有詳細(xì)描述熟知的工藝操作。

以下實(shí)施例中，檢測(cè)煙草樣品中松蘿科植物特征成分的方法的試劑與儀器如下：

試劑：卷煙樣品(福建中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心提供)；苔黑酚(>98％，Arcos)，苔黑酚單甲醚、苔黑酚羧酸乙酯(>98％，TCI)，β-苔黑酚羧酸甲酯(>98％，Sigma-Aldrich)，乙酸苯乙酯(標(biāo)準(zhǔn)品，JKChemical)；二氯甲烷(HPLC，JKChemicl)，鹽酸(37％，JKChemical)，純水(自制)；氯化鈉、無(wú)水硫酸鈉(A.R.，國(guó)藥)。

儀器：TRACE1310氣相色譜+ISQ LT四極桿質(zhì)譜(美國(guó)Thermo公司)；RM-20H轉(zhuǎn)盤(pán)吸煙機(jī)(德國(guó)Borgwaldt公司)；S150超聲波萃取儀(德國(guó)Elma公司)；2-16P離心機(jī)(德國(guó)SIGMA公司)；Turbo Vap II氮吹儀(瑞典Biotage公司)；ML204電子天平(瑞士Metler Toledo公司，感量0.1mg)。

以下實(shí)施例中，檢測(cè)煙草樣品中松蘿科植物特征成分的方法的采用氣相色譜質(zhì)譜法。

以下實(shí)施例中，氣相色譜質(zhì)譜的色譜條件如下：

色譜柱：J&W DB-5ms(30m×0.25mm×0.25μm)；進(jìn)樣口溫度：250℃；進(jìn)樣量：1.0μL；分流比：10:1；載氣流速：1.5mL/min；吹掃氣流速：5mL/min；升溫程序：60℃,保持min→以4℃/min升溫→240℃,保持1min→以20℃/min升溫→260℃,保持5min。

以下實(shí)施例中，氣相色譜質(zhì)譜的質(zhì)譜條件如下：

離子源：EI；電子能：70eV；傳輸線(xiàn)溫度：250℃；離子源溫度：250℃；四級(jí)桿溫度150℃；溶劑延遲：8min；采用SCAN和SIM同時(shí)掃描，質(zhì)量掃描范圍m/z 45～300；以下實(shí)施例中，檢測(cè)煙草樣品中松蘿科植物特征成分的方法中，一般系列標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制方法如下：

分別稱(chēng)取苔黑酚、苔黑酚單甲醚、苔黑酚羧酸乙酯和β-苔黑酚羧酸甲酯的純品各50mg，加入萃取溶劑二氯甲烷溶解，并定容至50mL，配制成濃度1000μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。

稱(chēng)取乙酸苯乙酯的標(biāo)準(zhǔn)品32mg，加入萃取溶劑二氯甲烷溶解，并定容至50mL，配制成濃度640μg/mL的內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備溶液。

分別準(zhǔn)確移取1.0μL、2.5μL、5.0μL、10μL、25μL、50μL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液和25μL的內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備溶液，至50mL的容量瓶中，二氯甲烷定容待用。得到一般系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，濃度分別為：0.02μg/mL(S1)、0.05μg/mL(S2)、0.1μg/mL(S3)、0.2μg/mL(S4)、0.5μg/mL(S5)、1.0μg/mL(S6)，內(nèi)標(biāo)濃度為0.32μg/mL。

準(zhǔn)確移取1.0mL的內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備溶液于2000mL二氯甲烷中，配制成含內(nèi)標(biāo)濃度為0.32μg/mL的內(nèi)標(biāo)萃取溶劑。

圖1是濃度為0.1μg/mL的一般標(biāo)準(zhǔn)溶液的總離子流色譜圖和選擇離子色譜圖。圖1中，各曲線(xiàn)含義如下：0-松蘿科植物特征成分的總離子流色譜；1-苔黑酚單甲醚的選擇離子色譜，2-苔黑酚的選擇離子色譜，3-β-苔黑酚羧酸甲酯的選擇離子色譜，4-苔黑酚羧酸乙酯的選擇離子色譜。

根據(jù)氣相色譜質(zhì)譜總離子流圖確定待測(cè)組分的保留時(shí)間，確定待測(cè)組分的定性離子和定量離子。

選擇離子掃描參數(shù)如表1所示：

表1

實(shí)施例1.成品卷煙煙絲的檢測(cè)

1.煙絲基質(zhì)匹配系列標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

1.1煙絲基質(zhì)溶液的制備：剝除2支不含松蘿科植物特征成分的對(duì)照卷煙煙絲，用20mL內(nèi)標(biāo)萃取溶液萃取，超聲20min，過(guò)濾。濾液中加入10mL飽和食鹽水和0.5mL 5％鹽酸，震蕩10min，6000rpm離心10min使兩相充分分離，移除水相。有機(jī)相經(jīng)無(wú)水硫酸鈉干燥后，用PTFE濾膜(0.45μm)過(guò)濾，續(xù)濾液待用。

1.2基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：分別移取2.0mL煙絲基質(zhì)溶液至六個(gè)氮吹瓶中，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下吹掃至溶液近干。再往氮吹瓶中分別加入一般系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，即得到煙絲基質(zhì)匹配系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，濃度分別為0.02μg/mL(S1l)、0.05μg/mL(S2l)、0.1μg/mL(S3l)、0.2μg/mL(S4l)、0.5μg/mL(S5l)、1.0μg/mL(S6l)，內(nèi)標(biāo)濃度為0.32μg/mL。

2.樣品前處理

稱(chēng)取兩支樣品卷煙的煙絲，加入20mL內(nèi)標(biāo)萃取溶液，超聲萃取20min，過(guò)濾。濾液中加入10mL飽和氯化鈉，并滴加0.5mL 5％鹽酸，振蕩10min，6000rpm離心分液10min。移除水相。有機(jī)相用無(wú)水硫酸鈉干燥，用PTFE濾膜(0.45μm)過(guò)濾。色譜進(jìn)樣。

3.樣品含量的測(cè)定

3.1工作曲線(xiàn)、檢出限和檢測(cè)限

取上述配制的煙絲基質(zhì)匹配系列標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行氣相色譜質(zhì)譜檢測(cè)，以目標(biāo)物與內(nèi)標(biāo)物的定量離子峰面積比為縱坐標(biāo)，以目標(biāo)物的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，進(jìn)行回歸分析，得到煙絲中四種目標(biāo)物的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)及其相關(guān)系數(shù)，具體結(jié)果如表1.1所示。

由表1.1可知，對(duì)基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液中的目標(biāo)物響應(yīng)信號(hào)，采用最低濃度標(biāo)樣重復(fù)10次進(jìn)樣，以3倍信噪比為方法的檢出限(LOD)，10倍信噪比為定量限(LOQ)，可知方法具有較高的靈敏度。

圖2濃度為1.0μg/mL的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液的總離子流色譜圖和選擇離子色譜圖。圖2中，各曲線(xiàn)含義如下：0-松蘿科植物特征成分的總離子流色譜；1-苔黑酚單甲醚的選擇離子色譜，2-苔黑酚的選擇離子色譜，3-β-苔黑酚羧酸甲酯的選擇離子色譜，4-苔黑酚羧酸乙酯的選擇離子色譜。

表1.1工作曲線(xiàn)、檢出限和檢測(cè)限

3.2回收率和精密度

取對(duì)照卷煙煙絲樣品，添加3個(gè)不同濃度的目標(biāo)物純品溶液，并加入內(nèi)標(biāo)萃取溶液進(jìn)行以上的樣品前處理，進(jìn)行氣相色譜質(zhì)譜分析，按照加標(biāo)量(0.1μg/mL、0.2μg/mL和0.5μg/mL)和測(cè)定值計(jì)算其回收率。同時(shí)對(duì)同一樣品溶液平行測(cè)定5次(n＝5)，得到四種成分的精密度測(cè)定數(shù)據(jù)，見(jiàn)表1.2。由表1.2可以看出，四種成分的回收率在70.4％～114.5％之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均小于11.7％，說(shuō)明本方法的回收率高、準(zhǔn)確性和重復(fù)性好，可以滿(mǎn)足定量需要。

表1.2回收率和精密度

3.3煙絲中含量

運(yùn)用以上建立的測(cè)試方法，分別測(cè)試了四個(gè)牌號(hào)的成品卷煙煙絲，如表1.3，在四個(gè)牌號(hào)中均未檢出苔黑酚單甲醚，苔黑酚的含量相近，而牌號(hào)4煙絲中的β-苔黑酚羧酸甲酯和苔黑酚羧酸乙酯含量均最高。

表1.3煙絲中松蘿科植物特征成分含量的測(cè)試結(jié)果

對(duì)比例1

在卷煙煙絲中加入微量松蘿科植物提取物，參照實(shí)施例1的方法，分別使用二氯甲烷、乙酸乙酯和正己烷三種常用有機(jī)溶劑對(duì)煙絲進(jìn)行萃取，以乙酸苯乙酯作為內(nèi)標(biāo)，用氣相色譜相對(duì)峰面積考察三種溶劑對(duì)松蘿科植物成分的萃取效率。如表1.4所示，對(duì)于苔黑酚，二氯甲烷的萃取效率明顯好于乙酸乙酯和正己烷；對(duì)于其他三種成分，二氯甲烷和乙酸乙酯的提取效率接近，均優(yōu)于正己烷。綜合以上結(jié)果，對(duì)于松蘿科植物成分，二氯甲烷是較為合適的萃取溶劑。結(jié)合表1.2的加標(biāo)回收率結(jié)果，也說(shuō)明實(shí)施例1的檢測(cè)結(jié)果更接近真實(shí)值。

表1.4三種溶劑對(duì)成分的萃取效率比較

實(shí)施例2.卷煙主流煙氣的檢測(cè)

1.煙氣基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

1.1煙氣基質(zhì)溶液的制備：按照GB/T 5606.1-2004國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)和ISO 3308:2012煙草行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，使用轉(zhuǎn)盤(pán)型吸煙機(jī)對(duì)20支純煙絲卷煙進(jìn)行抽吸，劍橋?yàn)V片捕集總粒相物。濾片用40mL內(nèi)標(biāo)萃取溶液萃取，超聲15min。移除濾片，往萃取溶劑中加入10mL飽和食鹽水和0.5mL 5％鹽酸，震蕩10min，6000rpm離心10min使兩相充分分離，移除水相。有機(jī)相經(jīng)無(wú)水硫酸鈉干燥后，用PTFE濾膜過(guò)濾，續(xù)濾液待用。

1.2基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：分別移取2.0mL煙氣基質(zhì)溶液至六個(gè)氮吹瓶中，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下吹掃至溶液近干。再往氮吹瓶中加入一般系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，即得到煙氣基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液。所得標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)溶液濃度分別為0.02μg/mL(S1f)、0.05μg/mL(S2f)、0.1μg/mL(S3f)、0.2μg/mL(S4f)、0.5μg/mL(S5f)、1.0μg/mL(S6f)，內(nèi)標(biāo)濃度為0.32μg/mL。

2.樣品前處理

用轉(zhuǎn)盤(pán)型吸煙機(jī)收集20只卷煙的總粒相物，劍橋?yàn)V片加入40mL內(nèi)標(biāo)萃取溶液，超聲萃取15min。移取20mL萃取溶劑，加入10mL飽和氯化鈉，再加入0.5mL 5％鹽酸，振蕩10min，離心分液(6000rpm，10min)。移除水相，油相用無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾膜(PTFE，0.45μm)。色譜進(jìn)樣。

3.樣品含量的測(cè)定

3.1工作曲線(xiàn)、檢出限和檢測(cè)限

取上述配制的煙氣基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行氣相色譜質(zhì)譜檢測(cè)，以目標(biāo)物與內(nèi)標(biāo)物的定量離子峰面積比為縱坐標(biāo)，以目標(biāo)物的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，進(jìn)行回歸分析，得到煙氣中四種目標(biāo)物的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)及其相關(guān)系數(shù)，具體結(jié)果如表2.1所示。

由表2.1可知，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)溶液中的目標(biāo)物響應(yīng)信號(hào)，采用最低濃度標(biāo)樣重復(fù)10次進(jìn)樣，以3倍信噪比為方法的檢出限(LOD)，10倍信噪比為定量限(LOQ)，可知方法具有較高的靈敏度。

表2.1工作曲線(xiàn)、檢出限和檢測(cè)限

3.2回收率和精密度

用轉(zhuǎn)盤(pán)型吸煙機(jī)收集20只卷煙的總粒相物，添加3個(gè)不同濃度的目標(biāo)物純品溶液，并加入內(nèi)標(biāo)萃取溶液進(jìn)行以上的樣品前處理，進(jìn)行氣相色譜質(zhì)譜分析，按照加標(biāo)量(0.1μg/mL、0.2μg/mL和0.5μg/mL)和測(cè)定值計(jì)算其回收率。同時(shí)對(duì)同一樣品溶液平行測(cè)定5次(n＝5)，得到四種成分的精密度測(cè)定數(shù)據(jù)，見(jiàn)表2.2。由表2.2可以看出，四種成分的回收率在71.5％～108.5％之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均小于9.3％，說(shuō)明本方法的回收率高、準(zhǔn)確性和重復(fù)性好，可以滿(mǎn)足定量需要。

表2.2回收率和精密度

3.3煙氣中含量

運(yùn)用以上建立的測(cè)試方法，分別測(cè)試了三個(gè)牌號(hào)的成品卷煙煙氣，如表2.3，在三個(gè)牌號(hào)中均未檢出苔黑酚單甲醚和苔黑酚，而牌號(hào)7主流煙氣的β-苔黑酚羧酸甲酯和苔黑酚羧酸乙酯含量均最低。

表2.3煙氣中松蘿科植物特征成分含量的測(cè)試結(jié)果

上述實(shí)施例使用選擇離子方法測(cè)定了四種松蘿科植物特征成分的含量，可以實(shí)現(xiàn)卷煙制品中松蘿科植物特征成分的測(cè)定，從而為卷煙香精的調(diào)配、施加和感官評(píng)吸，提供準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)參考。本發(fā)明采用溶劑直接萃取，氣相色譜質(zhì)譜選擇離子法進(jìn)行分析，采用基質(zhì)匹配內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法定量。具有提取效率高、操作簡(jiǎn)便、排除基質(zhì)干擾、定量準(zhǔn)確等一項(xiàng)或多項(xiàng)優(yōu)點(diǎn)。

最后應(yīng)當(dāng)說(shuō)明的是：以上實(shí)施例僅用以說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案而非對(duì)其限制；盡管參照較佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說(shuō)明，所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解：依然可以對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式進(jìn)行修改或者對(duì)部分技術(shù)特征進(jìn)行等同替換；而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明請(qǐng)求保護(hù)的技術(shù)方案范圍當(dāng)中。