本發(fā)明涉及土壤中有機磷酸酯的測定技術領域，具體是涉及一種同時測定土壤樣品中12種OPEs殘留的方法。
背景技術：
近年來，由于多溴聯(lián)苯醚(PBDEs)類阻燃劑的生物毒性和環(huán)境風險，世界各國已經逐步限制和禁止多溴聯(lián)苯醚的生產和應用。有機磷酸酯(organophosphate esters，OPEs)作為溴代阻燃劑的主要替代品，已經廣泛用于塑料、紡織品、電子設備和家居用品中，而且產量和用量均大幅增加。由于OPEs主要以簡單的物理方式添加到產品中，因此在其生產、使用、處置過程中不可避免的經由各種途徑進入環(huán)境中，目前在農田土壤中已有檢出。與PBDEs相比，OPEs總體親脂性更弱，其生物富集性相對較弱，但環(huán)境風險不比PBDEs小。生物毒理學研究表明，OPEs具有神經毒性、致癌性、內分泌干擾效應，對人體健康造成潛在威脅。因此，OPEs作為一種新型污染物，其環(huán)境污染問題已經引起全球學者的關注。
目前，OPEs的檢測方法主要有氣相色譜法(GC)、氣相色譜-質譜聯(lián)用法(GC-MS)、氣相色譜-其它聯(lián)用技術(GC-NPD、GC-EI-MS等、液相色譜法(HPLC)、液相色譜-質譜聯(lián)用法(HPLC-MS/MS)等，涉及樣本包括室內灰塵、空氣、水樣、沉積物、土壤、生物等。由于土壤中殘留的OPEs多以痕量水平存在，且種類繁多，此外，土壤成分較復雜，對OPEs檢測會有較大干擾。
針對以上現(xiàn)狀，本發(fā)明人擬利用高效液相色譜-串聯(lián)質譜檢測法并結合液液萃取和固相萃取的前處理方法，建立一種土壤中痕量的12種OPEs殘留定量分析方法，可以基本滿足快速篩查和檢測要求。液相色譜-質譜聯(lián)用法因具有高靈敏度和高選擇性，抗干擾能力強，可以成為OPEs殘留定性定量分析的有效工具。
技術實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有的檢測方法存在一定的局限性，靈敏度不夠高，抗干擾能力差等問題，提供一種同時測定土壤樣品中12種OPEs殘留的方法，該方法檢出限低，穩(wěn)定性好，基本能夠滿足土壤中12種OPEs殘留的檢測要求。
本發(fā)明的技術方案是：
一種同時測定土壤樣品中12種OPEs殘留的方法，包括以下步驟：
S1：配制混合標準溶液：
a.配制單標準儲備液(10mg/L)：準確稱取12種OPEs各0.01g，用甲醇溶解定容于10mL容量瓶中，配成質量濃度為1000mg/L的標準儲備液；分別取100μL(1000mg/L)標準儲備液于10mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，配制質量濃度為10mg/L的標準儲備液，儲存于4℃冰箱中；
b.配制混合標準儲備液(200μg/L)：準確吸取200μL各單標準儲備液(10mg/L)于10mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，配制質量濃度為200μg/L的混合標準儲備液，于4℃下保存；
c.用甲醇作為溶劑，將上述混合標準儲備液(200μg/L)按比例稀釋后配成質量濃度分別為0.2、1、2、5、10、20、50、100μg/L的混合標準溶液，于4℃下保存；
S2：繪制標準曲線：
用甲醇配制質量濃度分別為0.2,1,2,5,10,20,50和100μg/L的12種OPEs混合標準溶液，以峰面積(y)對目標物的質量濃度(x)繪制標準曲線；
S3：樣品采集：
在采樣點采集土壤樣品，去除雜物，置于不銹鋼盒中，冷凍干燥，研磨過60目篩，-20℃保存待測；
S4：樣品前處理：
將上述土壤樣品經冷凍干燥研磨過60目篩后，分別稱取5g土壤樣品于100mL離心管中，加入30mL有機溶劑作為萃取劑，超聲萃取30min后，以8000r/min離心5min，將上清液置于雞心瓶，重復上述步驟1次，合并上清液，旋轉蒸發(fā)至10mL以下，用超純水稀釋到100mL，經0.45μm玻璃纖維濾膜過濾，以4mL/min的流速通過Oasis HLB小柱。上樣前，依次用5mL乙酸乙酯、5mL甲醇、5mL超純水活化小柱。上樣后，用5mL去離子水淋洗，棄去淋洗液，負壓抽干10min，再用5mL乙酸乙酯洗脫2次，且保持洗脫流速為1mL/min。收集的洗脫液經旋轉蒸發(fā)至干，用甲醇定容至1mL，待HPLC-MS/MS分析；
S5：高效液相色譜質譜聯(lián)用儀MRM監(jiān)測離子模式分析：
a.高效液相色譜條件：色譜柱：Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18(150mm×2.1mm,3.5um)；流動相：0.2％(V/V)甲酸(A)和甲醇(B)；流速為0.3mL/min；柱溫：30℃；進樣體積：5uL；梯度洗脫程序：0～8min時，流動相為甲酸30％、甲醇70％；8～8.1min時，流動相為甲酸5％、甲醇95％；8.1～16min時，流動相為甲酸5％、甲醇95％；16～20min時，流動相為甲酸30％、甲醇70％；
b.質譜條件：選擇電噴霧離子(ESI)源正離子模式掃描，采用半自動進樣方式，以5μL/min的流速將500μg/L的標準儲備液分別注入離子源；監(jiān)測模式為多反應離子監(jiān)測(MRM)；選取對應的母離子峰，對其子離子進行二級質譜分析，得到碎片離子信息；
S6：外標法定量：通過高效液相色譜質譜聯(lián)用儀MRM監(jiān)測離子模式分析后，根據(jù)繪制的色譜圖計算出樣品溶液的峰面積，并通過步驟S2所述的標準曲線計算出樣品溶液中的12種OPEs的濃度，目標物在1～100μg/L范圍內呈良好的線性關系，以信噪比S/N＝3計算儀器方法檢出限(LOD)，S/N＝10作為儀器方法定量限(LOQ)。同時對100μg/L的標準溶液連續(xù)測定3天，每天測定3次，計算日內和日間精密度；結果見表1。
表1：12種OPEs的線性方程、相關系數(shù)、日內和日間精密度、檢出限和定量限
進一步地，在上述方案中，所述12種OPEs包括磷酸三甲酯(Trimethyl phosphate,TMP)、磷酸三乙酯(Triethyl phosphate,TEP)、磷酸三正丁酯(Tri-n-butyl phosphate,TnBP)、磷酸三(2-丁氧基乙基)酯(Tributoxyethyl phosphate,TBEP)、磷酸三(2-氯異丙基)酯(Tri(chloropropyl)phosphate,TCPP)、磷酸三(1,3-二氯-2-丙基)酯(Tri(dichloropropyl)phosphate,TDCP)、磷酸三苯酯(Triphenyl phosphate,TPhP)、磷酸三甲苯酯(Tricresyl phosphate,TCrP)、磷酸三(2-氯乙基)酯(Tri(2-chloroethyl)phosphate,TCEP)、磷酸三(2-乙基己基)酯(Tri(2-ethylhexyl)phosphate,TEHP)、磷酸三(2,3-二溴丙基)酯(tris(2,3-Dibromopropyl)phosphate,TDBPP)、2-乙基己基二苯基磷酸酯(2-Ethylhexyl diphenyl phosphate,EHDPP)。
進一步地，在上述方案中，所述萃取劑為乙腈。
進一步地，在上述方案中，所述質譜分析過程中，離子源溫度：500℃，離子噴霧電壓：5500V；氣簾氣(curtain gas,CUR)壓力為206851.8Pa；噴霧氣(ion source gas 1,GS1)壓力為241327.1Pa；輔助加熱氣(ion source gas 2,GS2)壓力為275802.4Pa。得到碎片離子信息后，接著對目標化合物二級質譜的CE、DP、EP、CXP等質譜參數(shù)進行優(yōu)化，質譜多反應監(jiān)測參數(shù)見表2。
表2：12種OPEs的參數(shù)及其LC-MS檢測參數(shù)
*表示定量離子
本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明利用高效液相色譜-質譜聯(lián)用技術結合液液萃取和固相萃取同時檢測土壤樣品中12種磷酸酯類化合物殘留的方法，土壤樣品經液液萃取和固相萃取，用高效液相色譜-質譜聯(lián)用儀MRM監(jiān)測離子模式分析，外標法定量，本發(fā)明的方法對于大部分OPEs來說，檢出限低，穩(wěn)定性好，檢測靈敏度高，用于土壤樣品中OPEs的快速篩查，基本能夠滿足土壤樣品中12種OPEs殘留的檢測要求。
附圖說明
圖1是不同流動相下12種OPEs混合標準溶液(100μg/L)的總離子色譜圖；
其中，1a：乙腈-水溶液；1b：甲醇-水溶液；1c：甲醇-0.2％甲酸水溶液；其中，1：磷酸三甲酯；2：磷酸三乙酯；3：磷酸三(2-氯乙基)酯；4：磷酸三(氯丙基)酯；5：磷酸三(二氯丙基)酯；6：三-(2,3-二溴丙基)磷酸酯；7：磷酸三苯酯；8：磷酸三正丁酯；9：磷酸三丁氧基乙酯；10：磷酸2-乙基己基二苯酯；11：磷酸三甲苯酯；12：磷酸三(2-乙基己基)酯。
具體實施方式
以在江蘇省某農田設置的25個采樣點所采集的土壤樣品為例，進行同時測定土壤樣品中以下12種OPEs殘留，12種OPEs包括包括磷酸三甲酯(Trimethyl phosphate,TMP)、磷酸三乙酯(Triethyl phosphate,TEP)、磷酸三正丁酯(Tri-n-butyl phosphate,TnBP)、磷酸三(2-丁氧基乙基)酯(Tributoxyethyl phosphate,TBEP)、磷酸三(2-氯異丙基)酯(Tri(chloropropyl)phosphate,TCPP)、磷酸三(1,3-二氯-2-丙基)酯(Tri(dichloropropyl)phosphate,TDCP)、磷酸三苯酯(Triphenyl phosphate,TPhP)、磷酸三甲苯酯(Tricresyl phosphate,TCrP)、磷酸三(2-氯乙基)酯(Tri(2-chloroethyl)phosphate,TCEP)、磷酸三(2-乙基己基)酯(Tri(2-ethylhexyl)phosphate,TEHP)、磷酸三(2,3-二溴丙基)酯(tris(2,3-Dibromopropyl)phosphate,TDBPP)、2-乙基己基二苯基磷酸酯(2-Ethylhexyl diphenyl phosphate,EHDPP)；測定方法包括以下步驟：
一種同時測定土壤樣品中12種OPEs殘留的方法，包括以下步驟：
S1：配制混合標準溶液：
a.配制單標準儲備液(10mg/L)：準確稱取12種OPEs各0.01g，用甲醇溶解定容于10mL容量瓶中，配成質量濃度為1000mg/L的標準儲備液；分別取100μL(1000mg/L)標準儲備液于10mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，配制質量濃度為10mg/L的標準儲備液，儲存于4℃冰箱中；
b.配制混合標準儲備液(200μg/L)：準確吸取200μL各單標準儲備液(10mg/L)于10mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，配制質量濃度為200μg/L的混合標準儲備液，于4℃下保存；
c.用甲醇作為溶劑，將上述混合標準儲備液(200μg/L)按比例稀釋后配成質量濃度分別為0.2、1、2、5、10、20、50、100μg/L的混合標準溶液，于4℃下保存；
S2：繪制標準曲線：
用甲醇配制質量濃度分別為0.2,1,2,5,10,20,50和100μg/L的12種OPEs混合標準溶液，以峰面積(y)對目標物的質量濃度(x)繪制標準曲線；
S3：樣品采集：
在采樣點采集土壤樣品，去除雜物，置于不銹鋼盒中，冷凍干燥，研磨過60目篩，-20℃保存待測；
S4：樣品前處理：
將上述土壤樣品經冷凍干燥研磨過60目篩后，分別稱取5g土壤樣品于100mL離心管中，加入30mL有機溶劑作為萃取劑，超聲萃取30min后，以8000r/min離心5min，將上清液置于雞心瓶，重復上述步驟1次，合并上清液，旋轉蒸發(fā)至10mL以下，用超純水稀釋到100mL，經0.45μm玻璃纖維濾膜過濾，以4mL/min的流速通過Oasis HLB小柱。上樣前，依次用5mL乙酸乙酯、5mL甲醇、5mL超純水活化小柱。上樣后，用5mL去離子水淋洗，棄去淋洗液，負壓抽干10min，再用5mL乙酸乙酯洗脫2次，且保持洗脫流速為1mL/min。收集的洗脫液經旋轉蒸發(fā)至干，用甲醇定容至1mL，待HPLC-MS/MS分析；
S5：高效液相色譜質譜聯(lián)用儀MRM監(jiān)測離子模式分析：
a.高效液相色譜條件：色譜柱：Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18(150mm×2.1mm,3.5um)；流動相：0.2％(V/V)甲酸(A)和甲醇(B)；流速為0.3mL/min；柱溫：30℃；進樣體積：5uL；梯度洗脫程序：0～8min時，流動相為甲酸30％、甲醇70％；8～8.1min時，流動相為甲酸5％、甲醇95％；8.1～16min時，流動相為甲酸5％、甲醇95％；16～20min時，流動相為甲酸30％、甲醇70％；
b.質譜條件：選擇電噴霧離子(ESI)源正離子模式掃描，采用半自動進樣方式，以5μL/min的流速將500μg/L的標準儲備液分別注入離子源；監(jiān)測模式為多反應離子監(jiān)測(MRM)；離子源溫度：500℃，離子噴霧電壓：5500V；氣簾氣(curtain gas,CUR)壓力為206851.8Pa；噴霧氣(ion source gas 1,GS1)壓力為241327.1Pa；輔助加熱氣(ion source gas 2,GS2)壓力為275802.4Pa。選取對應的母離子峰，對其子離子進行二級質譜分析，得到碎片離子信息；接著對目標化合物二級質譜的CE、DP、EP、CXP等質譜參數(shù)進行優(yōu)化，質譜多反應監(jiān)測參數(shù)見表2。
表2：12種OPEs的參數(shù)及其LC-MS檢測參數(shù)
*表示定量離子
S6：外標法定量：通過高效液相色譜質譜聯(lián)用儀MRM監(jiān)測離子模式分析后，根據(jù)繪制的色譜圖計算出樣品溶液的峰面積，并通過步驟S2所述的標準曲線計算出樣品溶液中的12種OPEs的濃度，目標物在0.2～100μg/L范圍內呈良好的線性關系，以信噪比S/N＝3計算儀器方法檢出限(LOD)，S/N＝10作為儀器方法定量限(LOQ)。同時對100μg/L的標準溶液連續(xù)測定3天，每天測定3次，計算日內和日間精密度；結果見表1。
表1：12種OPEs的線性方程、相關系數(shù)、日內和日間精密度、檢出限和定量限
實驗驗證：
1.流動相的選擇：一般情況下，酸性條件下可提高化合物[M+H]+的正離子響應，本實驗采用ESI+模式，分別用乙腈-水溶液、甲醇-水溶液、甲醇-0.2％甲酸水溶液作為流動相，對12種OPEs(100μg/L)的分離效果進行比較，其總離子流色譜圖見圖1。結果發(fā)現(xiàn)以甲醇-水為流動相時目標物峰的質譜響應和分離度更好(見圖1b)，而添加甲酸對目標物的分離影響不大(見圖1c)，但是可以提高部分目標物的響應，因此選擇甲醇-0.2％甲酸水溶液為流動相。
2.提取溶劑的選擇：5種有機溶劑(正己烷-甲醇(2:1，V/V)、甲醇-乙腈(1:4，V/V)、甲醇、乙腈和正己烷-乙酸乙酯(2:5，V/V))提取方法對TMP回收率均低于55％，這可能是由于TMP較好的水溶性及易揮發(fā)所致；TCEP回收率也相對較差，其范圍為24.14％～58.60％，可能是由于復雜的沉積物基質對TCEP的基質抑制效應。此外，5種有機溶劑只有乙腈作為萃取劑時，TCPP、TCrP能達到較好回收率，分別為72.82％、119.5％，而其余4種萃取溶劑對其回收率均低于5％。相比而言，乙腈作提取溶劑時的萃取效果較好。因此，后續(xù)實驗選擇乙腈作為最佳的萃取溶劑。
3.回收率與精密度：
以目標物極低的土壤作為對照組，且將其濃度作為空白控制的基線值。分別添加低(5μg/kg)、中(10μg/kg)、高(50μg/kg)3個不同濃度的目標物，每個濃度設置3個平行樣，檢測結果扣除替代樣品的基線值。土壤樣品中12種OPEs的平均加標回收率為31.24％～116.63％。實驗結果見表3。
表3：土壤樣品中12種OPEs的回收率與精密度
4.對農田設置的25個采樣點的土壤樣品中12種目標化合物的檢測分析，結果見表4。
表4：12種OPEs在農田土壤中的暴露濃度(μg/kg)
5.nda:未檢出；b單一OPE總濃度占所有OPEs總濃度的百分比。
6.結論：本發(fā)明建立的高效液相色譜-串聯(lián)質譜(HPLC-MS/MS)同時測定農田土壤中12種OPEs殘留的分析方法?？偟膩碚f，對于文中大部分OPEs，該方法檢出限低，穩(wěn)定性好，但對于磷酸三甲酯(TMP)因其較好的水溶性及易揮發(fā)，導致其在土壤中的回收率偏低，對于磷酸三(2-氯乙基)酯(TCEP)來說，可能是由于沉積物復雜的基質產生的抑制效應，導致回收率偏低。但用于農田土壤中OPEs的快速篩查，本方法基本能夠滿足農田土壤中12種OPEs殘留的檢測要求。
最后應說明的是：以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術方案，而非對其限制；盡管參照前述實施例對本發(fā)明進行了詳細的說明，本領域的普通技術人員應當理解：其依然可以對前述實施例所記載的技術方案進行修改，或者對其中部分技術特征進行等同替換；而這些修改或者替換，并不使相應技術方案的本質脫離本發(fā)明實施例技術方案的精神和范圍。