專(zhuān)利名稱(chēng)：一種免疫層析一步法檢測(cè)β－腎上腺素激動(dòng)劑類(lèi)藥物的方法及試紙的制備的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，公開(kāi)了一種免疫層析一步法檢測(cè)β-腎上腺素激動(dòng)劑(簡(jiǎn)稱(chēng)β-興奮劑類(lèi)藥)的方法及試紙的制備。
目前，測(cè)定β-興奮劑類(lèi)藥的方法有高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(HPLC-MS)、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)、高效液相色譜法(HPLC)、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)和放射免疫測(cè)定法(RIA)等。目前免疫測(cè)定法ELISA和GC-MS的靈敏度能較好地滿(mǎn)足β-興奮劑類(lèi)藥殘留分析要求，應(yīng)用較多，檢測(cè)限通常低于0.5ug/kg，前者是主要的篩選方法，后者則是成熟的確證方法。由于以上方法均需借助高檔的儀器和設(shè)備，成本高，同時(shí)對(duì)操作人員需要特殊培訓(xùn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果無(wú)法立即顯示。因此不適合于商檢、防疫、畜牧生產(chǎn)者對(duì)懷疑對(duì)象的在線(xiàn)檢測(cè)和監(jiān)控。
β-興奮劑類(lèi)藥的免疫測(cè)定法和普通的理化檢測(cè)法相比有許多優(yōu)勢(shì)。(1)免疫反應(yīng)有很好的特異性。選擇抗β-興奮劑類(lèi)藥的特異性單克隆抗體，待檢β-興奮劑類(lèi)藥和其它類(lèi)型β-興奮劑類(lèi)藥的交叉反應(yīng)可以降低到10％以下。(2)β-興奮劑類(lèi)藥的免疫測(cè)定有基團(tuán)特異性。β-興奮劑類(lèi)藥有特殊的共有基團(tuán)，選擇抗β-興奮劑類(lèi)藥的抗共有基團(tuán)的多克隆抗體或單克隆抗體，可以同時(shí)測(cè)定數(shù)種β-興奮劑類(lèi)藥。如用抗沙丁胺醇抗體RIA對(duì)克倫特羅，馬布特羅，特布他林和塞曼特羅的交叉反應(yīng)分別為118％，78％，29％和11％。
免疫層析是出現(xiàn)于80年代初期的一種獨(dú)特的免疫分析方式，它往往以條狀纖維層析材料為固相，通過(guò)毛細(xì)作用使樣品溶液在層析條上泳動(dòng)，并同時(shí)使樣品中的待測(cè)物與層析材料上針對(duì)待測(cè)物的受體(如抗體或抗原)發(fā)生高特異高親和性的免疫反應(yīng)，層析過(guò)程中免疫復(fù)合物被富集或截留在層析材料的一定區(qū)域(檢測(cè)帶)，通過(guò)酶反應(yīng)或直接運(yùn)用可目測(cè)的標(biāo)記物(如膠體金)而得到直觀的實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象(如顯色)。而游離標(biāo)記物則越過(guò)檢測(cè)帶，達(dá)到與結(jié)合標(biāo)記物自動(dòng)分離之目的。
免疫層析技術(shù)運(yùn)用最成功的標(biāo)記物為膠體金，膠體金是指分散相粒子直徑在1-150nm的金溶膠，屬于多相不均一體系，顏色呈桔紅色到紫紅色。膠體金技術(shù)是一種新興技術(shù)，與傳統(tǒng)的放免技術(shù)，熒光免疫技術(shù)和酶免疫技術(shù)相比有許多獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)。①結(jié)果直觀，利用肉眼可見(jiàn)的紅色，在不需要任何儀器的情況下對(duì)抗原進(jìn)行檢測(cè)，方便基層單位和現(xiàn)場(chǎng)使用。②靈敏度高，達(dá)到和ELISA相似的靈敏度，如果加入增敏試劑檢測(cè)靈敏度可超過(guò)ELISA1-2個(gè)數(shù)量級(jí)。③速度快，檢測(cè)時(shí)間一般為3-10分鐘。
由于膠體金免疫層析技術(shù)獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)，目前已廣泛應(yīng)用于臨床醫(yī)療檢測(cè)中。近年來(lái)由于制備技術(shù)的改進(jìn)和試劑原料質(zhì)量的提高，該技術(shù)的應(yīng)用范圍又得到了進(jìn)一步拓寬。國(guó)內(nèi)外現(xiàn)有的商品供應(yīng)及文獻(xiàn)報(bào)道的檢測(cè)項(xiàng)目主要包括以下方面違禁藥物檢測(cè)(苯丙胺、可卡因、大麻、嗎啡、海洛因等)、傳染病病原檢測(cè)(梅毒螺旋體、淋球菌、泌尿生殖系沙眼衣原體、幽門(mén)螺桿菌等)、激素檢測(cè)、寄生蟲(chóng)、腫瘤標(biāo)記物、心血管病檢測(cè)標(biāo)志物等。膠體金免疫層析技術(shù)用于食品安全領(lǐng)域β-興奮劑類(lèi)藥的檢測(cè)未見(jiàn)報(bào)道。
本發(fā)明用膠體金免疫層析技術(shù)檢測(cè)β-興奮劑類(lèi)藥。和其它β-興奮劑類(lèi)藥檢測(cè)方法比較，有簡(jiǎn)單、快速、單份測(cè)定、除商品試劑外不需任何儀器設(shè)備的優(yōu)點(diǎn)，特別適合畜禽違禁β-興奮劑類(lèi)藥的快速篩查。
為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的采取的方案本發(fā)明實(shí)現(xiàn)免疫層析一步法檢測(cè)β-腎上腺素激動(dòng)劑類(lèi)藥物的方法及試紙的制備包括如下步驟1.待檢樣品的處理；2.硝酸纖維素膜的制備制備β-興奮劑類(lèi)藥-載體蛋白復(fù)合物。選擇β-興奮劑類(lèi)藥-載體蛋白復(fù)合物的一種或組合，在硝酸纖維素膜的相應(yīng)部位線(xiàn)狀點(diǎn)樣作為檢測(cè)線(xiàn)。選擇膠體金標(biāo)記抗體的抗抗體，在硝酸纖維素膜的相應(yīng)部位線(xiàn)狀點(diǎn)樣作為質(zhì)控線(xiàn)。
3.膠體金結(jié)合物墊的制備選擇和第2項(xiàng)之與β-興奮劑類(lèi)藥對(duì)應(yīng)的抗β-興奮劑類(lèi)藥抗體的一種或組合，標(biāo)記膠體金顆粒，分散在玻璃纖維紙上，作為膠體金結(jié)合物墊。
4.試紙條的組裝①在襯墊上加上樣品墊；②在襯墊上加上分散有抗β-興奮劑類(lèi)藥抗體的一種或組合的膠體金結(jié)合物墊；③在襯墊上加上有β-興奮劑類(lèi)藥-載體蛋白復(fù)合物的一種或組合線(xiàn)狀點(diǎn)樣作為檢測(cè)線(xiàn)，有膠體金標(biāo)記抗體的抗抗體線(xiàn)狀點(diǎn)樣作為質(zhì)控線(xiàn)的硝酸纖維素膜；④在襯墊上加上吸水墊；組裝為檢測(cè)試紙條。
方案可細(xì)分為四部分1.待檢樣品的處理；2.硝酸纖維素膜的制備；3.膠體金結(jié)合物墊的制備；4.試紙條的組裝。
1.待檢樣品的處理1)尿樣普查無(wú)需樣品準(zhǔn)備取適量尿樣直接進(jìn)行試驗(yàn)(尿樣混濁時(shí)建議離心或過(guò)濾)。
2)低脂肪含量的肝、肉、組織取絞碎的樣品5g，加入5mM Hcl 25ml搖動(dòng)作用1.5h使其充分勻漿；取6g勻漿(相當(dāng)于1.0肝)于離心管中；取上清液置另一離心管，加入1M NaOH 300μl混合作用15分鐘；加0.5M KH2PO4(pH3.0)45ml，迅速混勻，置4℃中至少1.5小時(shí)或過(guò)夜處理。4000g離心1分鐘或10-15℃高速離心，取上清液(幾乎清亮)，平衡至室溫。
3)高脂肪肉類(lèi)組織取絞碎樣品5克加入PH8.5，50mM Tris緩沖液25ml，振蕩作用0.5小時(shí)使其充分勻漿；加入15ml正庚烷，振動(dòng)5分鐘；4000g或10-15℃高速離心5分鐘；用滅菌吸管移去上層庚烷液和中層脂肪液；用15ml正庚烷重復(fù)提取一次；于水溶性肉勻漿中加入0.5ml HCl，振蕩1小時(shí)；取6克肉勻漿(相當(dāng)于1.0g肉或組織)上清液置另一離心管，加入1M NaOH 300μl混合作用15分鐘；加0.5M KH2PO4(pH3.0)45ml，迅速混勻，置4℃中至少1.5小時(shí)或過(guò)夜處理。4000g離心1分鐘或10-15℃高速離心，取上清液(幾乎清亮)，平衡至室溫。
4)飼料樣品處理方法用乳缽研碎飼料樣品，稱(chēng)2.0g研碎的飼料樣品，加入2ml1M HCl，加入16ml雙蒸水。旋流3分鐘，放振蕩器上振蕩15分鐘。2000rpm離心20分鐘，轉(zhuǎn)移出上清液并加入2ml1M NaOH至上清液中混合，檢查pH值是否在6.5-7.5之間。2000rpm離心20分鐘，轉(zhuǎn)移出上清液。(如果上清液仍然渾濁可提高轉(zhuǎn)速或用濾紙過(guò)濾)。用雙蒸水10倍稀釋上清液(加100μl上清液到900μl雙蒸水中并且混合好)，此時(shí)樣品總的稀釋倍數(shù)為100。取適量的稀釋上清液用進(jìn)行檢測(cè)。
2.硝酸纖維素膜的制備(1)制備β-興奮劑類(lèi)藥-載體蛋白復(fù)合物。
1)克倫特羅-載體蛋白復(fù)合物制備將5mg鹽酸克倫特羅溶于0.5ml 0.5mol/L硫酸，加入2mg亞硝酸鈉水溶液0.2ml，室溫下攪拌反應(yīng)10min，加入20mg牛甲狀腺蛋白(預(yù)先溶于1.8ml 1mol/L碳酸鈉，pH10)，室溫下攪拌反應(yīng)5h，離心取上清液用凝膠柱除去未反應(yīng)的克倫特羅，-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 2)塞曼特羅，馬布特羅，馬賁特羅-載體蛋白復(fù)合物制備同上。
3)沙丁胺醇-載體蛋白復(fù)合物制備取80mg(0.33mmol)沙丁胺醇游離堿溶于10ml甲醇，蒸去溶劑，將殘留物溶于16ml乙醇，攪拌下加入36mg(0.36mmol)琥珀酸酐，離心，用乙醇將沉淀物洗滌3次，干燥。將40mg(0.12mmol)干燥物溶于二氧六環(huán)-水-三乙胺(25+3+0.3)，攪拌下逐滴加入30ul(0.23mmol)氯甲酸異丁酯，逐滴加入25ml溶解有80mg(0.0012mmol)BSA的蒸餾水中，4℃過(guò)夜，經(jīng)磷酸鹽緩沖液(PBS)透析凍存?zhèn)溆谩?br> 4)特布他林-載體蛋白復(fù)合物制備同上。
(2)選擇β-興奮劑類(lèi)藥-載體蛋白復(fù)合物的一種或組合，如下1)克倫特羅-載體蛋白復(fù)合物；2)塞曼特羅-載體蛋白復(fù)合物；3)馬布特羅-載體蛋白復(fù)合物；4)馬賁特羅-載體蛋白復(fù)合物；5)沙丁胺醇-載體蛋白復(fù)合物；6)特布他林-載體蛋白復(fù)合物；7)克倫特羅-載體蛋白復(fù)合物與沙丁胺醇-載體蛋白復(fù)合物組合；8)克倫特羅-載體蛋白復(fù)合物與馬布特羅-載體蛋白復(fù)合物組合；9)克倫特羅-載體蛋白復(fù)合物，沙丁胺醇-載體蛋白復(fù)合物與馬布特羅-載體蛋白復(fù)合物組合；10)克倫特羅-載體蛋白復(fù)合物，塞曼特羅-載體蛋白復(fù)合物，馬布特羅-載體蛋白復(fù)合物與馬賁特羅-載體蛋白復(fù)合物組合；11)沙丁胺醇-載體蛋白復(fù)合物與特布他林-載體蛋白復(fù)合物組合；12)克倫特羅-載體蛋白復(fù)合物，沙丁胺醇-載體蛋白復(fù)合物與特布他林-載體蛋白復(fù)合物組合。
(3)檢測(cè)線(xiàn)和質(zhì)控線(xiàn)的制備將硝酸纖維素膜按25mm寬的尺寸剪裁。將經(jīng)生理鹽水緩沖液充分透析，濃度調(diào)整為0.01-0.3mg/ml的β-興奮劑類(lèi)藥-載體蛋白復(fù)合物的一種或組合溶液在膜上線(xiàn)狀點(diǎn)樣作為檢測(cè)線(xiàn)，檢測(cè)線(xiàn)點(diǎn)樣位置離膜底邊4-16mm。然后在膜的頂端噴涂一條膠體金標(biāo)記抗體的抗抗體作為質(zhì)控線(xiàn)，室溫干燥30min，將膜置于1％牛血清白蛋白的生理鹽水中浸泡30min，取出吸干水分，于37℃孵育30min，置室溫下干燥處密封儲(chǔ)藏。
3.膠體金結(jié)合物墊的制備(1)選擇和β-興奮劑類(lèi)藥對(duì)應(yīng)的抗β-興奮劑類(lèi)藥抗體的一種或組合選擇的抗β-興奮劑類(lèi)藥抗體組合如下，抗β-興奮劑類(lèi)藥抗體可以選擇單克隆抗體，也可選擇多克隆抗體1)抗克倫特羅抗體；2)抗塞曼特羅抗體；3)抗馬布特羅抗體；4)抗馬賁特羅抗體；5)抗沙丁胺醇抗體；6)抗特布他林抗體；7)抗克倫特羅抗體與抗沙丁胺醇抗體組合；8)抗克倫特羅抗體與抗馬布特羅抗體組合；9)抗克倫特羅抗體，抗沙丁胺醇抗體與抗馬布特羅抗體組合；10)抗克倫特羅抗體，抗塞曼特羅抗體，抗馬布特羅抗體與抗馬賁特羅抗體組合；11)抗沙丁胺醇抗體與抗特布他林抗體組合；12)抗克倫特羅，抗沙丁胺醇與抗特布他林組合。
(2)抗β-興奮劑類(lèi)藥抗體標(biāo)記膠體金顆粒1)膠體金溶膠制備取0.01％四氯化金水溶液200ml，加熱至沸騰，加入1-20ml 1％檸檬酸鈉水溶液，煮沸5min，出現(xiàn)橙紅色，膠體金顆粒直徑由電鏡測(cè)定為10-80nm；2)抗β-興奮劑類(lèi)藥抗體標(biāo)記膠體金顆粒取50ml膠體金，用0.1mol/L碳酸鉀調(diào)pH至8.0，攪拌下將膠體金溶膠和抗β-興奮劑類(lèi)藥抗體混合，再加入聚乙二醇水溶液，使最終濃度為0.05％。將粗制品6000g離心45min，沉淀用生理鹽水混懸至1.5ml，4℃保存。
(3)膠體金結(jié)合物墊制備將標(biāo)記膠體金顆粒的抗β-興奮劑類(lèi)藥抗體按比例混合分散在厚度為1mm的玻璃纖維紙上，凍干密封干燥保存。
4.試紙條的組裝①在襯墊上加上樣品墊；②在襯墊上加上分散有抗β-興奮劑類(lèi)藥抗體的一種或組合的膠體金結(jié)合物墊；③在襯墊上加上有β-興奮劑類(lèi)藥-載體蛋白復(fù)合物的一種或組合線(xiàn)狀點(diǎn)樣作為檢測(cè)線(xiàn)，有膠體金標(biāo)記抗體的抗抗體線(xiàn)狀點(diǎn)樣作為質(zhì)控線(xiàn)的硝酸纖維素膜；④在襯墊上加上吸水墊；組裝為檢測(cè)試紙條。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)及應(yīng)用范圍簡(jiǎn)單，快速，單份測(cè)定，除商品試劑外不需任何儀器設(shè)備，成本低，幾分鐘即可用肉眼觀察結(jié)果，既可檢測(cè)一種β-興奮劑類(lèi)藥又可同時(shí)檢測(cè)數(shù)種β-興奮劑類(lèi)藥的總量。用于β-興奮劑類(lèi)藥的快速篩查，方便在基層單位的使用推廣。
本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，主要用于飼料，奶品，肉品，血漿，尿液中β-興奮劑類(lèi)藥的快速篩查。本發(fā)明的試紙條的使用單位主要為食品安全檢測(cè)的執(zhí)法部門(mén)，奶品、肉品生產(chǎn)及消費(fèi)個(gè)人或單位，海關(guān)等進(jìn)出口部門(mén)，以及科研部門(mén)等。
檢測(cè)原理是這樣的在樣品墊2上滴加樣品，如果樣品中有β-興奮劑類(lèi)藥8，則β-興奮劑類(lèi)藥8經(jīng)層析作用移動(dòng)到膠體金結(jié)合物墊3，和限量的抗β-興奮劑類(lèi)藥抗體10結(jié)合，當(dāng)移動(dòng)到檢測(cè)線(xiàn)6時(shí)，無(wú)多余的膠體金9標(biāo)記的抗β-興奮劑類(lèi)藥抗體10和檢測(cè)線(xiàn)6上的β-興奮劑類(lèi)藥8結(jié)合，檢測(cè)線(xiàn)6不顯色。膠體金9標(biāo)記的抗β-興奮劑類(lèi)藥抗體10繼續(xù)向前移動(dòng)到質(zhì)控線(xiàn)7，和質(zhì)控線(xiàn)7上有抗β-興奮劑類(lèi)藥抗體10的抗抗體11反應(yīng)，質(zhì)控線(xiàn)7顯紅色。若樣品中無(wú)β-興奮劑類(lèi)藥8，則膠體金結(jié)合物墊3上的膠體金9標(biāo)記的抗β-興奮劑類(lèi)藥抗體10和檢測(cè)線(xiàn)6上的β-興奮劑類(lèi)藥8結(jié)合，檢測(cè)線(xiàn)6顯紅色，質(zhì)控線(xiàn)7同上顯紅色。
(1)待檢樣品的處理1)畜尿樣本處理取適量尿樣直接進(jìn)行試驗(yàn)(尿樣混濁時(shí)建議離心或過(guò)濾)。
2)飼料樣本處理用乳缽研碎飼料樣品，稱(chēng)2.0g研碎的飼料樣品，加入2ml 1M HCl，加入16ml雙蒸水。旋流3分鐘，放振蕩器上振蕩15分鐘。2000rpm離心20分鐘，轉(zhuǎn)移出上清液并加入2ml 1M NaOH至上清液中混合，檢查pH值是否在6.5-7.5之間。離心20分鐘2000rpm，轉(zhuǎn)移出上清液。(如果上清液仍然渾濁可提高轉(zhuǎn)速或用濾紙過(guò)濾)。用雙蒸水10倍稀釋上清液(加100μl上清液到900μl雙蒸水中并且混合好)，此時(shí)樣品總的稀釋倍數(shù)為100。取適量的稀釋上清液用于進(jìn)行檢測(cè)。
(2)硝酸纖維素膜的制備克倫特羅-牛甲狀腺蛋白復(fù)合物制備將5mg鹽酸克倫特羅溶于0.5ml 0.5mol/L硫酸，加入2mg亞硝酸鈉水溶液0.2ml，室溫下攪拌反應(yīng)10min，加入20mg牛甲狀腺蛋白(預(yù)先溶于1.8ml 1mol/L碳酸鈉，pH10)，室溫下攪拌反應(yīng)5h，離心取上清液用凝膠柱除去未反應(yīng)的克倫特羅，-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 檢測(cè)線(xiàn)和質(zhì)控線(xiàn)的制備將硝酸纖維素膜按25mm寬的尺寸剪裁。將經(jīng)生理鹽水緩沖液充分透析，濃度調(diào)整為0.01-0.04mg/ml的克倫特羅-牛甲狀腺蛋白復(fù)合物溶液在膜上線(xiàn)狀點(diǎn)樣作為檢測(cè)線(xiàn)，檢測(cè)線(xiàn)點(diǎn)樣位置離膜底邊8-15mm。然后在膜的頂端噴涂一條抗小鼠IgG抗體作為質(zhì)控線(xiàn)，室溫干燥30min，將膜置于1％牛血清白蛋白的生理鹽水中浸泡30min，取出吸干水分，于37℃孵育30min，置室溫下干燥處密封儲(chǔ)藏。
(3)膠體金結(jié)合物墊的制備取50ml顆粒直徑為30-50nm膠體金，用0.1mol/L碳酸鉀調(diào)pH至8.0，攪拌下將膠體金溶膠和鼠源性抗克倫特羅單克隆抗體混合，再加入聚乙二醇水溶液，使最終濃度為0.05％。將粗制品6000g離心45min，沉淀用生理鹽水混懸至1.5ml，4℃保存。將標(biāo)記膠體金顆粒的抗克倫特羅抗體分散在厚度為1mm的玻璃纖維紙上，凍干密封干燥保存。
(4)試紙條的組裝①在襯墊上加上樣品墊；②在襯墊上加上分散有膠體金標(biāo)記抗克倫特羅抗體的膠體金結(jié)合物墊；③在襯墊上加上有克倫特羅-牛甲狀腺蛋白復(fù)合物線(xiàn)狀點(diǎn)樣作為檢測(cè)線(xiàn)，有抗小鼠IgG抗體線(xiàn)狀點(diǎn)樣作為質(zhì)控線(xiàn)的硝酸纖維素膜；④在襯墊上加上吸水墊；組裝為檢測(cè)試紙條。
(5)檢測(cè)畜尿和飼料樣本畜尿樣本試紙垂直插入尿樣，插入深度不超過(guò)樣品墊，在樣本中停留約5秒，垂直取出試紙，5分鐘后觀察。質(zhì)控線(xiàn)顯色說(shuō)明檢測(cè)有效，檢測(cè)線(xiàn)不顯色說(shuō)明結(jié)果為陽(yáng)性，尿樣克倫特羅濃度超過(guò)5ng/ml，反之為陰性。
飼料樣本試紙垂直插入飼料提取液，插入深度不超過(guò)樣品墊，在樣本中停留約5秒，垂直取出試紙，5分鐘后觀察。質(zhì)控線(xiàn)顯色說(shuō)明檢測(cè)有效，檢測(cè)線(xiàn)不顯色說(shuō)明結(jié)果為陽(yáng)性，飼料提取液克倫特羅濃度超過(guò)5ng/ml，反之為陰性。
實(shí)施例二沙丁胺醇免疫層析試紙的制備并用于檢測(cè)畜尿和飼料樣本本實(shí)施例分為5部分(1)待檢樣品的處理；(2)硝酸纖維素膜的制備；(3)膠體金結(jié)合物墊的制備；(4)試紙條的組裝；(5)檢測(cè)畜尿和飼料樣本。
(1)待檢樣品的處理1)畜尿樣本處理取適量尿樣直接進(jìn)行試驗(yàn)(尿樣混濁時(shí)建議離心或過(guò)濾)。
2)飼料樣本處理用乳缽研碎飼料樣品，稱(chēng)2.0g研碎的飼料樣品，加入2ml 1M HCl，加入16ml雙蒸水。旋流3分鐘，放振蕩器上振蕩15分鐘。2000rpm離心20分鐘，轉(zhuǎn)移出上清液并加入2ml 1M NaOH至上清液中混合，檢查pH值是否在6.5-7.5之間。離心20分鐘2000rpm，轉(zhuǎn)移出上清液。(如果上清液仍然渾濁可提高轉(zhuǎn)速或用濾紙過(guò)濾)。用雙蒸水10倍稀釋上清液(加100μl上清液到900μl雙蒸水中并且混合好)，此時(shí)樣品總的稀釋倍數(shù)為100。取適量的稀釋上清液用于進(jìn)行檢測(cè)。
(2)硝酸纖維素膜的制備沙丁胺醇-BSA復(fù)合物制備取80mg(0.33mmol)沙丁胺醇游離堿溶于10ml甲醇，蒸去溶劑，將殘留物溶于16ml乙醇，攪拌下加入36mg(0.36mmol)琥珀酸酐，離心，用乙醇將沉淀物洗滌3次，干燥。將40mg(0.12mmol)干燥物溶于二氧六環(huán)-水-三乙胺(25+3+0.3)，攪拌下逐滴加入30ul(0.23mmol)氯甲酸異丁酯，逐滴加入25ml溶解有80mg(0.0012mmol)BSA的蒸餾水中，4℃過(guò)夜，經(jīng)PBS透析凍存?zhèn)溆谩?br> 檢測(cè)線(xiàn)和質(zhì)控線(xiàn)的制備將硝酸纖維素膜按25mm寬的尺寸剪裁。將經(jīng)生理鹽水緩沖液充分透析，濃度調(diào)整為0.01-0.04mg/ml的沙丁胺醇-BSA復(fù)合物溶液在膜上線(xiàn)狀點(diǎn)樣作為檢測(cè)線(xiàn)，檢測(cè)線(xiàn)點(diǎn)樣位置離膜底邊8-15mm。然后在膜的頂端噴涂一條抗小鼠IgG抗體作為質(zhì)控線(xiàn)，室溫干燥30min，將膜置于1％牛血清白蛋白的生理鹽水中浸泡30min，取出吸干水分，于37℃孵育30min，置室溫下干燥處密封儲(chǔ)藏。
(3)膠體金結(jié)合物墊的制備取50ml顆粒直徑為30-50nm膠體金，用0.1mol/L碳酸鉀調(diào)pH至8.0，攪拌下將膠體金溶膠和鼠源性抗沙丁胺醇單克隆抗體混合，再加入聚乙二醇水溶液，使最終濃度為0.05％。將粗制品6000g離心45min，沉淀用生理鹽水混懸至1.5ml，4℃保存。將標(biāo)記膠體金顆粒的抗沙丁胺醇抗體分散在厚度為1mm的玻璃纖維紙上，凍干密封干燥保存。
(4)試紙條的組裝①在襯墊上加上樣品墊；②在襯墊上加上分散有膠體金標(biāo)記抗沙丁胺醇抗體的膠體金結(jié)合物墊；③在襯墊上加上有沙丁胺醇-BSA復(fù)合物線(xiàn)狀點(diǎn)樣作為檢測(cè)線(xiàn)，有抗小鼠IgG抗體線(xiàn)狀點(diǎn)樣作為質(zhì)控線(xiàn)的硝酸纖維素膜；④在襯墊上加上吸水墊；組裝為檢測(cè)試紙條。
(5)檢測(cè)畜尿和飼料樣本畜尿樣本試紙垂直插入尿樣，插入深度不超過(guò)樣品墊，在樣本中停留約5秒，垂直取出試紙，5分鐘后觀察。質(zhì)控線(xiàn)顯色說(shuō)明檢測(cè)有效，檢測(cè)線(xiàn)不顯色說(shuō)明結(jié)果為陽(yáng)性，尿樣沙丁胺醇濃度超過(guò)5ng/ml，反之為陰性。
飼料樣本試紙垂直插入飼料提取液，插入深度不超過(guò)樣品墊，在樣本中停留約5秒，垂直取出試紙，5分鐘后觀察。質(zhì)控線(xiàn)顯色說(shuō)明檢測(cè)有效，檢測(cè)線(xiàn)不顯色說(shuō)明結(jié)果為陽(yáng)性，飼料提取液沙丁胺醇濃度超過(guò)5ng/ml，反之為陰性。
實(shí)施例三馬布特羅免疫層析試紙的制備并用于檢測(cè)畜尿和飼料樣本本實(shí)施例分為5部分(1)待檢樣品的處理；(2)硝酸纖維素膜的制備；(3)膠體金結(jié)合物墊的制備；(4)試紙條的組裝；(5)檢測(cè)畜尿和飼料樣本。
(1)待檢樣品的處理畜尿樣本處理取適量尿樣直接進(jìn)行試驗(yàn)(尿樣混濁時(shí)建議離心或過(guò)濾)。
飼料樣本處理用乳缽研碎飼料樣品，稱(chēng)2.0g研碎的飼料樣品，加入2ml 1M HCl，加入16ml雙蒸水。旋流3分鐘，放振蕩器上振蕩15分鐘。2000rpm離心20分鐘，轉(zhuǎn)移出上清液并加入2ml 1M NaOH至上清液中混合，檢查pH值是否在6.5-7.5之間。離心20分鐘2000rpm，轉(zhuǎn)移出上清液。(如果上清液仍然渾濁可提高轉(zhuǎn)速或用濾紙過(guò)濾)。用雙蒸水10倍稀釋上清液(加100μl上清液到900μl雙蒸水中并且混合好)，此時(shí)樣品總的稀釋倍數(shù)為100。取適量的稀釋上清液用于進(jìn)行檢測(cè)。
(2)硝酸纖維素膜的制備馬布特羅-BSA復(fù)合物制備將5mg馬布特羅溶于0.5ml0.5mol/L硫酸，加入2mg亞硝酸鈉水溶液0.2ml，室溫下攪拌反應(yīng)10min，加入20mgBSA(預(yù)先溶于1.8ml 1mol/L碳酸鈉，pH10)，室溫下攪拌反應(yīng)5h，離心取上清液用凝膠柱除去未反應(yīng)的馬布特羅，-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 檢測(cè)線(xiàn)和質(zhì)控線(xiàn)的制備將硝酸纖維素膜按25mm寬的尺寸剪裁。將經(jīng)生理鹽水緩沖液充分透析，濃度調(diào)整為0.01-0.04mg/ml的馬布特羅-BSA復(fù)合物溶液在膜上線(xiàn)狀點(diǎn)樣作為檢測(cè)線(xiàn)，檢測(cè)線(xiàn)點(diǎn)樣位置離膜底邊8-15mm。然后在膜的頂端噴涂一條抗小鼠IgG抗體作為質(zhì)控線(xiàn)，室溫干燥30min，將膜置于1％牛血清白蛋白的生理鹽水中浸泡30min，取出吸干水分，于37℃孵育30min，置室溫下干燥處密封儲(chǔ)藏。
(3)膠體金結(jié)合物墊的制備取50ml顆粒直徑為30-50nm膠體金，用0.1mol/L碳酸鉀調(diào)pH至8.0，攪拌下將膠體金溶膠和鼠源性抗馬布特羅單克隆抗體混合，再加入聚乙二醇水溶液，使最終濃度為0.05％。將粗制品6000g離心45min，沉淀用生理鹽水混懸至1.5ml，4℃保存。將標(biāo)記膠體金顆粒的抗馬布特羅抗體分散在厚度為1mm的玻璃纖維紙上，凍干密封干燥保存。
(4)試紙條的組裝①在襯墊上加上樣品墊；②在襯墊上加上分散有膠體金標(biāo)記抗馬布特羅抗體的膠體金結(jié)合物墊；③在襯墊上加上有馬布特羅-BSA復(fù)合物線(xiàn)狀點(diǎn)樣作為檢測(cè)線(xiàn)，有抗小鼠IgG抗體線(xiàn)狀點(diǎn)樣作為質(zhì)控線(xiàn)的硝酸纖維素膜；④在襯墊上加上吸水墊；組裝為檢測(cè)試紙條。
(5)檢測(cè)畜尿和飼料樣本畜尿樣本試紙垂直插入尿樣，插入深度不超過(guò)樣品墊，在樣本中停留約5秒，垂直取出試紙，5分鐘后觀察。質(zhì)控線(xiàn)顯色說(shuō)明檢測(cè)有效，檢測(cè)線(xiàn)不顯色說(shuō)明結(jié)果為陽(yáng)性，尿樣馬布特羅濃度超過(guò)5ng/ml，反之為陰性。
飼料樣本試紙垂直插入飼料提取液，插入深度不超過(guò)樣品墊，在樣本中停留約5秒，垂直取出試紙，5分鐘后觀察。質(zhì)控線(xiàn)顯色說(shuō)明檢測(cè)有效，檢測(cè)線(xiàn)不顯色說(shuō)明結(jié)果為陽(yáng)性，飼料提取液馬布特羅濃度超過(guò)5ng/ml，反之為陰性。
實(shí)施例四克倫特羅和沙丁胺醇免疫層析試紙的制備并用于檢測(cè)畜尿和飼料樣本本實(shí)施例分為5部分(1)待檢樣品的處理；(2)硝酸纖維素膜的制備；(3)膠體金結(jié)合物墊的制備；(4)試紙條的組裝；(5)檢測(cè)畜尿和飼料樣本。
(1)待檢樣品的處理1)畜尿樣本處理取適量尿樣直接進(jìn)行試驗(yàn)(尿樣混濁時(shí)建議離心或過(guò)濾)。
2)飼料樣本處理用乳缽研碎飼料樣品，稱(chēng)2.0g研碎的飼料樣品，加入2ml 1M HCl，加入16ml雙蒸水。旋流3分鐘，放振蕩器上振蕩15分鐘。2000rpm離心20分鐘，轉(zhuǎn)移出上清液并加入2ml 1M NaOH至上清液中混合，檢查pH值是否在6.5-7.5之間。離心20分鐘2000rpm，轉(zhuǎn)移出上清液。(如果上清液仍然渾濁可提高轉(zhuǎn)速或用濾紙過(guò)濾)。用雙蒸水10倍稀釋上清液(加100μl上清液到900μl雙蒸水中并且混合好)，此時(shí)樣品總的稀釋倍數(shù)為100。取適量的稀釋上清液用于進(jìn)行檢測(cè)。
(2)硝酸纖維素膜的制備克倫特羅-牛甲狀腺蛋白復(fù)合物制備將5mg鹽酸克倫特羅溶于0.5ml 0.5mol/L硫酸，加入2mg亞硝酸鈉水溶液0.2ml，室溫下攪拌反應(yīng)10min，加入20mg牛甲狀腺蛋白(預(yù)先溶于1.8ml 1mol/L碳酸鈉，pH10)，室溫下攪拌反應(yīng)5h，離心取上清液用凝膠柱除去未反應(yīng)的克倫特羅，-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 沙丁胺醇-BSA復(fù)合物制備取80mg(0.33mmol)沙丁胺醇游離堿溶于10ml甲醇，蒸去溶劑，將殘留物溶于16ml乙醇，攪拌下加入36mg(0.36mmol)琥珀酸酐，離心，用乙醇將沉淀物洗滌3次，干燥。將40mg(0.12mmol)干燥物溶于二氧六環(huán)-水-三乙胺(25+3+0.3)，攪拌下逐滴加入30ul(0.23mmol)氯甲酸異丁酯，逐滴加入25ml溶解有80mg(0.0012mmol)BSA的蒸餾水中，4℃過(guò)夜，經(jīng)PBS透析凍存?zhèn)溆谩?br> 檢測(cè)線(xiàn)和質(zhì)控線(xiàn)的制備將硝酸纖維素膜按25mm寬的尺寸剪裁。將經(jīng)生理鹽水緩沖液充分透析，濃度調(diào)整為0.02-0.08mg/ml的克倫特羅-牛甲狀腺蛋白復(fù)合物和沙丁胺醇-BSA復(fù)合物按溶液2∶1混合在膜上線(xiàn)狀點(diǎn)樣作為檢測(cè)線(xiàn)，檢測(cè)線(xiàn)點(diǎn)樣位置離膜底邊8-15mm。然后在膜的頂端噴涂一條抗小鼠IgG抗體作為質(zhì)控線(xiàn)，室溫干燥30min，將膜置于1％牛血清白蛋白的生理鹽水中浸泡30min，取出吸干水分，于37℃孵育30min，置室溫下干燥處密封儲(chǔ)藏。
(3)膠體金結(jié)合物墊的制備取50ml顆粒直徑為30-50nm膠體金，用0.1mol/L碳酸鉀調(diào)pH至8.0，攪拌下將膠體金溶膠和抗克倫特羅羊多克隆抗體混合，再加入聚乙二醇水溶液，使最終濃度為0.05％。將粗制品6000g離心45min，沉淀用生理鹽水混懸至1.5ml，4℃保存。同上法，用膠體金標(biāo)記抗沙丁胺醇羊多克隆抗體。按2∶1混合膠體金標(biāo)記的抗克倫特羅羊多克隆抗體和抗沙丁胺醇羊多克隆抗體。將混合物分散在厚度為1mm的玻璃纖維紙上，凍干密封干燥保存。
(4)試紙條的組裝按附

圖1在襯墊上加上樣品墊，膠體金結(jié)合物墊，硝酸纖維素膜，吸水墊部件，組裝為檢測(cè)試紙條。
(5)檢測(cè)畜尿和飼料樣本畜尿樣本試紙垂直插入尿樣，插入深度不超過(guò)樣品墊，在樣本中停留約5秒，垂直取出試紙，5分鐘后觀察。質(zhì)控線(xiàn)顯色說(shuō)明檢測(cè)有效，檢測(cè)線(xiàn)不顯色說(shuō)明結(jié)果為陽(yáng)性，尿樣克倫特羅和沙丁胺醇等β-興奮劑類(lèi)藥濃度超過(guò)5ng/ml，反之為陰性。
飼料樣本試紙垂直插入飼料提取液，插入深度不超過(guò)樣品墊，在樣本中停留約5秒，垂直取出試紙，5分鐘后觀察。質(zhì)控線(xiàn)顯色說(shuō)明檢測(cè)有效，檢測(cè)線(xiàn)不顯色說(shuō)明結(jié)果為陽(yáng)性，飼料提取液克倫特羅和沙丁胺醇等β-興奮劑類(lèi)藥濃度超過(guò)5ng/ml，反之為陰性。
實(shí)施例五克倫特羅，沙丁胺醇與馬布特羅免疫層析試紙的制備并用于檢測(cè)畜尿和飼料樣本本實(shí)施例分為5部分(1)待檢樣品的處理；(2)硝酸纖維素膜的制備；(3)膠體金結(jié)合物墊的制備；(4)試紙條的組裝；(5)檢測(cè)畜尿和飼料樣本。
(1)待檢樣品的處理1)畜尿樣本處理取適量尿樣直接進(jìn)行試驗(yàn)(尿樣混濁時(shí)建議離心或過(guò)濾)。
2)飼料樣本處理用乳缽研碎飼料樣品，稱(chēng)2.0g研碎的飼料樣品，加入2ml 1M HCl，加入16ml雙蒸水。旋流3分鐘，放振蕩器上振蕩15分鐘。2000rpm離心20分鐘，轉(zhuǎn)移出上清液并加入2ml 1M NaOH至上清液中混合，檢查pH值是否在6.5-7.5之間。離心20分鐘2000rpm，轉(zhuǎn)移出上清液。(如果上清液仍然渾濁可提高轉(zhuǎn)速或用濾紙過(guò)濾)。用雙蒸水10倍稀釋上清液(加100μl上清液到900μl雙蒸水中并且混合好)，此時(shí)樣品總的稀釋倍數(shù)為100。取適量的稀釋上清液用于進(jìn)行檢測(cè)。
(2)硝酸纖維素膜的制備克倫特羅-牛甲狀腺蛋白復(fù)合物制備將5mg鹽酸克倫特羅溶于0.5ml 0.5mol/L硫酸，加入2mg亞硝酸鈉水溶液0.2ml，室溫下攪拌反應(yīng)10min，加入20mg牛甲狀腺蛋白(預(yù)先溶于1.8ml 1mol/L碳酸鈉，pH10)，室溫下攪拌反應(yīng)5h，離心取上清液用凝膠柱除去未反應(yīng)的克倫特羅，-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 沙丁胺醇-BSA復(fù)合物制備取80mg(0.33mmol)沙丁胺醇游離堿溶于10ml甲醇，蒸去溶劑，將殘留物溶于16ml乙醇，攪拌下加入36mg(0.36mmol)琥珀酸酐，離心，用乙醇將沉淀物洗滌3次，干燥。將40mg(0.12mmol)干燥物溶于二氧六環(huán)-水-三乙胺(25+3+0.3)，攪拌下逐滴加入30ul(0.23mmol)氯甲酸異丁酯，逐滴加入25ml溶解有80mg(0.0012mmol)BSA的蒸餾水中，4℃過(guò)夜，經(jīng)PBS透析凍存?zhèn)溆谩?br> 馬布特羅-BSA復(fù)合物制備將5mg馬布特羅溶于0.5ml0.5mol/L硫酸，加入2mg亞硝酸鈉水溶液0.2ml，室溫下攪拌反應(yīng)10min，加入20mgBSA(預(yù)先溶于1.8ml 1mol/L碳酸鈉，pH10)，室溫下攪拌反應(yīng)5h，離心取上清液用凝膠柱除去未反應(yīng)的馬布特羅，-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 檢測(cè)線(xiàn)和質(zhì)控線(xiàn)的制備將硝酸纖維素膜按25mm寬的尺寸剪裁。將經(jīng)生理鹽水緩沖液充分透析，濃度調(diào)整為0.03-0.12mg/ml的克倫特羅-牛甲狀腺蛋白復(fù)合物，沙丁胺醇-BSA復(fù)合物和馬布特羅-BSA復(fù)合物按溶液1∶1∶1混合在膜上線(xiàn)狀點(diǎn)樣作為檢測(cè)線(xiàn)，檢測(cè)線(xiàn)點(diǎn)樣位置離膜底邊8-15mm。然后在膜的頂端噴涂一條抗小鼠IgG抗體作為質(zhì)控線(xiàn)，室溫干燥30min，將膜置于1％牛血清白蛋白的生理鹽水中浸泡30min，取出吸干水分，于37℃孵育30min，置室溫下干燥處密封儲(chǔ)藏。
(3)膠體金結(jié)合物墊的制備取50ml顆粒直徑為30-50nm膠體金，用0.1mol/L碳酸鉀調(diào)pH至8.0，攪拌下將膠體金溶膠和抗克倫特羅羊多克隆抗體混合，再加入聚乙二醇水溶液，使最終濃度為0.05％。將粗制品6000g離心45min，沉淀用生理鹽水混懸至1.5ml，4℃保存。同上法，用膠體金標(biāo)記抗沙丁胺醇羊多克隆抗體和抗馬布特羅羊多克隆抗體。按1∶1∶1混合膠體金標(biāo)記的抗克倫特羅羊多克隆抗體，抗沙丁胺醇羊多克隆抗體和抗馬布特羅羊多克隆抗體。將混合物分散在厚度為1mm的玻璃纖維紙上，凍干密封干燥保存。
(4)試紙條的組裝按附圖1在襯墊上加上樣品墊，膠體金結(jié)合物墊，硝酸纖維素膜，吸水墊部件，組裝為檢測(cè)試紙條。
(5)檢測(cè)畜尿和飼料樣本畜尿樣本試紙垂直插入尿樣，插入深度不超過(guò)樣品墊，在樣本中停留約5秒，垂直取出試紙，5分鐘后觀察。質(zhì)控線(xiàn)顯色說(shuō)明檢測(cè)有效，檢測(cè)線(xiàn)不顯色說(shuō)明結(jié)果為陽(yáng)性，尿樣克倫特羅，沙丁胺醇和馬布特羅等β-興奮劑類(lèi)藥濃度超過(guò)5ng/ml，反之為陰性。
飼料樣本試紙垂直插入飼料提取液，插入深度不超過(guò)樣品墊，在樣本中停留約5秒，垂直取出試紙，5分鐘后觀察。質(zhì)控線(xiàn)顯色說(shuō)明檢測(cè)有效，檢測(cè)線(xiàn)不顯色說(shuō)明結(jié)果為陽(yáng)性，飼料提取液克倫特羅，沙丁胺醇和馬布特羅等β-興奮劑類(lèi)藥濃度超過(guò)5ng/ml，反之為陰性。
權(quán)利要求
1.一種免疫層析一步法檢測(cè)β-腎上腺素激動(dòng)劑類(lèi)藥物的方法，包括如下步驟(1)待檢樣品的處理，(2)硝酸纖維素膜的制備，(3)膠體金結(jié)合物墊的制備，(4)組裝試紙條；其特征是所述的硝酸纖維素膜制備，包括如下步驟(1)制備β-興奮劑類(lèi)藥-載體蛋白復(fù)合物；(2)選擇β-興奮劑類(lèi)藥-載體蛋白復(fù)合物的一種或組合；(3)檢測(cè)線(xiàn)和質(zhì)控線(xiàn)的制備。
2.根據(jù)權(quán)利要求書(shū)1所述的一種免疫層析一步法檢測(cè)β-腎上腺素激動(dòng)劑類(lèi)藥物的方法，其特征是所述的選擇β-興奮劑類(lèi)藥-載體蛋白復(fù)合物的一種或組合，如下1)克倫特羅-載體蛋白復(fù)合物；2)塞曼特羅-載體蛋白復(fù)合物；3)馬布特羅-載體蛋白復(fù)合物；4)馬賁特羅-載體蛋白復(fù)合物；5)沙丁胺醇-載體蛋白復(fù)合物；6)特布他林-載體蛋白復(fù)合物；7)克倫特羅-載體蛋白復(fù)合物與沙丁胺醇-載體蛋白復(fù)合物組合；8)克倫特羅-載體蛋白復(fù)合物與馬布特羅-載體蛋白復(fù)合物組合；9)克倫特羅-載體蛋白復(fù)合物，沙丁胺醇-載體蛋白復(fù)合物與馬布特羅-載體蛋白復(fù)合物組合；10)克倫特羅-載體蛋白復(fù)合物，塞曼特羅-載體蛋白復(fù)合物，馬布特羅-載體蛋白復(fù)合物與馬賁特羅-載體蛋白復(fù)合物組合；11)沙丁胺醇-載體蛋白復(fù)合物與特布他林-載體蛋白復(fù)合物組合；12)克倫特羅-載體蛋白復(fù)合物，沙丁胺醇-載體蛋白復(fù)合物與特布他林-載體蛋白復(fù)合物組合。
3.根據(jù)權(quán)利要求書(shū)1所述的一種免疫層析一步法檢測(cè)β-腎上腺素激動(dòng)劑類(lèi)藥物的方法，其特征是所述的檢測(cè)線(xiàn)和質(zhì)控線(xiàn)是這樣制備的將硝酸纖維素膜按25mm寬的尺寸剪裁；將經(jīng)生理鹽水緩沖液充分透析，濃度調(diào)整為0.01-0.3mg/ml的β-興奮劑類(lèi)藥-載體蛋白復(fù)合物的一種或組合溶液在膜上線(xiàn)狀點(diǎn)樣作為檢測(cè)線(xiàn)，檢測(cè)線(xiàn)點(diǎn)樣位置離膜底邊4-16mm；然后在膜的頂端噴涂一條膠體金標(biāo)記抗體的抗抗體條帶作為質(zhì)控線(xiàn)，室溫干燥30min，將膜置于1％牛血清白蛋白(BSA)的生理鹽水中浸泡30min，取出吸干水分，于37℃孵育30min，置室溫下干燥處密封儲(chǔ)藏。
4.根據(jù)權(quán)利要求書(shū)1所述的一種免疫層析一步法檢測(cè)β-腎上腺素激動(dòng)劑類(lèi)藥物的方法，其特征是所述的膠體金結(jié)合物墊的制備，包括如下步驟(1)選擇和β-興奮劑類(lèi)藥對(duì)應(yīng)的抗β-興奮劑類(lèi)藥抗體的一種或組合；(2)抗β-興奮劑類(lèi)藥抗體標(biāo)記膠體金顆粒；(3)膠體金結(jié)合物墊制備。
5.根據(jù)權(quán)利要求書(shū)4所述的一種免疫層析一步法檢測(cè)β-腎上腺素激動(dòng)劑類(lèi)藥物的方法，其特征是所述的選擇和β-興奮劑類(lèi)藥對(duì)應(yīng)的抗β-興奮劑類(lèi)藥抗體的一種或組合，組合是這樣的1)抗克倫特羅抗體；2)抗塞曼特羅抗體；3)抗馬布特羅抗體；4)抗馬賁特羅抗體；5)抗沙丁胺醇抗體；6)抗特布他林抗體；7)抗克倫特羅抗體與抗沙丁胺醇抗體組合；8)抗克倫特羅抗體與抗馬布特羅抗體組合；9)抗克倫特羅抗體，抗沙丁胺醇抗體與抗馬布特羅抗體組合；10)抗克倫特羅抗體，抗塞曼特羅抗體，抗馬布特羅抗體與抗馬賁特羅抗體組合；11)抗沙丁胺醇抗體與抗特布他林抗體組合；12)抗克倫特羅，抗沙丁胺醇與抗特布他林組合。
6.根據(jù)權(quán)利要求書(shū)4所述的一種免疫層析一步法檢測(cè)β-腎上腺素激動(dòng)劑類(lèi)藥物的方法，其特征是所述的選擇和β-興奮劑類(lèi)藥對(duì)應(yīng)的抗β-興奮劑類(lèi)藥抗體的一種或組合，抗體是指抗克倫特羅抗體，抗塞曼特羅抗體，抗沙丁胺醇抗體，抗馬布特羅抗體，抗馬賁特羅抗體和抗特布他林抗體其中的一種或其組合，抗體是單克隆抗體或多克隆抗體。
7.根據(jù)權(quán)利要求書(shū)4所述的一種免疫層析一步法檢測(cè)β-腎上腺素激動(dòng)劑類(lèi)藥物的方法，其特征是所述的抗β-興奮劑類(lèi)藥抗體標(biāo)記膠體金顆粒，步驟如下1)膠體金溶膠制備取0.01％四氯化金水溶液200ml，加熱至沸騰，加入1-20ml 1％檸檬酸鈉水溶液，煮沸5min，出現(xiàn)橙紅色，膠體金顆粒直徑由電鏡測(cè)定為10-80nm；2)抗β-興奮劑類(lèi)藥抗體標(biāo)記膠體金顆粒取50ml膠體金，用0.1mol/L碳酸鉀調(diào)pH至8.0，攪拌下將膠體金溶膠和抗β-興奮劑類(lèi)藥抗體混合，再加入聚乙二醇水溶液，使最終濃度為0.05％；將粗制品6000g離心45min，沉淀用生理鹽水混懸至1.5ml，4℃保存。
8.根據(jù)權(quán)利要求書(shū)1所述的一種免疫層析一步法檢測(cè)β-腎上腺素激動(dòng)劑類(lèi)藥物的方法，其特征是所述的組裝試紙條，步驟如下①在襯墊上加上樣品墊；②在襯墊上加上分散有抗β-興奮劑類(lèi)藥抗體的一種或組合的膠體金結(jié)合物墊；③在襯墊上加上有β-興奮劑類(lèi)藥-載體蛋白復(fù)合物的一種或組合線(xiàn)狀點(diǎn)樣作為檢測(cè)線(xiàn)，有抗膠體金標(biāo)記抗體的抗抗體線(xiàn)狀點(diǎn)樣作為質(zhì)控線(xiàn)的硝酸纖維素膜；④在襯墊上加上吸水墊；組裝為檢測(cè)試紙條。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，是一種免疫層析一步法檢測(cè)β－腎上腺素激動(dòng)劑(簡(jiǎn)稱(chēng)β－興奮劑類(lèi)藥)的方法及試紙的制備，β－興奮劑類(lèi)藥為克倫特羅，塞曼特羅，沙丁胺醇，馬布特羅，馬賁特羅和特布他林其中的一種或其組合。試紙制作步驟為(1)待檢樣品的處理；(2)硝酸纖維素膜的制備；(3)膠體金結(jié)合物墊的制備；(4)組裝試紙條；樣品中的β－興奮劑類(lèi)藥和膠體金結(jié)合物墊上的限量的膠體金標(biāo)記抗β－興奮劑類(lèi)藥抗體結(jié)合，多余的膠體金標(biāo)記抗β－興奮劑類(lèi)藥抗體再和硝酸纖維素膜上的β－興奮劑類(lèi)藥反應(yīng)，達(dá)到簡(jiǎn)便、快速、單份篩查β－興奮劑類(lèi)藥的一種或多種之目的。主要用于飼料、奶品、肉類(lèi)、血漿、尿液中β－興奮劑類(lèi)藥的快速篩選。
文檔編號(hào)G01N33/531GK1402004SQ0213132
公開(kāi)日2003年3月12日 申請(qǐng)日期2002年9月27日 優(yōu)先權(quán)日2002年9月27日
發(fā)明者陳高明 申請(qǐng)人:江西中德生物工程有限公司