本發(fā)明涉及一種雙特異性抗體生物學(xué)活性與滴度檢測方法，具體是涉及一種利用改進的均質(zhì)性時間分辨熒光技術(shù)(htrf)評價和篩選雙特異性抗體的生物學(xué)活性與滴度檢測的方法。

背景技術(shù)：

雙特異性抗體是一類含有兩種特異性抗原結(jié)合位點的人工抗體，除了fc端，兩價抗體中的fab段具有不同特異性?，F(xiàn)有技術(shù)中，雙特異抗體生物學(xué)活性(結(jié)合活性)主要通過elisa的方法，但elisa方法的實驗過程中需要反復(fù)的清洗，多步驟，比較繁瑣耗時，而且不能用一個試驗說明兩種特異性結(jié)合活性。

均質(zhì)性時間分辨熒光技術(shù)(homogeneoustimeresolvedfluorescence，htrf)能夠?qū)晒夤舱衲芰哭D(zhuǎn)移進行時間延遲測量，從而能夠用于均質(zhì)化樣品的定量檢測。fret技術(shù)利用了兩種熒光基團的能量轉(zhuǎn)移，這兩種熒光基團分別稱為(能量)供體和(能量)受體，將供體和受體分別與相互作用的兩個生物分子結(jié)合，生物分子的結(jié)合可以將受體和供體拉到足夠近的距離，產(chǎn)生能量轉(zhuǎn)移。受體受到激發(fā)，發(fā)出特定波長的發(fā)射光。由于受體分子的發(fā)射光來自于能量轉(zhuǎn)移，所以在實驗中不需要將未結(jié)合與已結(jié)合的分子分開，即不需要洗滌步驟。如果與供體和受體結(jié)合的生物分子不存在相互作用，供體和受體距離較遠(yuǎn)，不能產(chǎn)生能量轉(zhuǎn)移。

現(xiàn)階段，生物制藥與生物工藝行業(yè)，多有使用均質(zhì)性時間分辨熒光技術(shù)篩選高產(chǎn)細(xì)胞株的報道，但其局限于應(yīng)用在使用哺乳動物工程細(xì)胞株表達生產(chǎn)單抗或融合蛋白。該方法主要是利用單抗或融合蛋白的fc端來進行檢測篩選，而該方法不能篩選出完整的雙特異性抗體，對于雙特異性抗體是不適用的。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于，提供一種改進的htrf技術(shù)用于雙特異性抗體生物學(xué)活性與滴度檢測方法，能夠從多個角度篩選和評價了雙特異性抗體，為篩選高產(chǎn)量、高雙特異性活性的穩(wěn)定細(xì)胞株提供一種適用范圍更廣、更準(zhǔn)確和有效的方法。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的一種雙特異性抗體生物學(xué)活性與滴度檢測方法，所述雙特異性抗體能與兩種抗原特異性結(jié)合，所述兩種抗原分別是a抗原及b抗原，定義結(jié)合a抗原的輕鏈為lambda鏈，結(jié)合b抗原的輕鏈為kappa鏈，所述方法包括以下步驟：

步驟1.在微孔板中加入細(xì)胞上清液或待測物；

步驟2.加入供體和受體，其中，供體和受體的加入方式可以按以下六種方案中的一種或多種進行：

方案一：加入的供體為anti-his-eu³⁺cryptate(銪穴狀物偶聯(lián)的抗抗his抗體)，或anti-his-tb²⁺cryptate(鋱穴狀物偶聯(lián)的抗his抗體)，或streptavidin-eu³⁺cryptate(銪穴狀物偶聯(lián)的親和鏈霉素)，或streptavidin-tb²⁺cryptate(鋱穴狀物偶聯(lián)的親和鏈霉素)；加入的受體為anti-kappa-d2(d2連接的抗人kappa輕鏈的抗體)；還加入a抗原(帶有his標(biāo)簽或biotin標(biāo)簽)，混勻；

方案二：加入的供體為anti-lambda-eu³⁺cryptate(銪穴狀物偶聯(lián)的抗人lambda輕鏈的抗體)；加入的受體為anti-his-xl665(xl665連接的抗his抗體)，或anti-his-d2(d2連接的抗his抗體)，或streptavidin-d2(d2連接的親和鏈霉素)，或streptavidin-xl665(xl665連接的親和鏈霉素)；還加入b抗原(帶有his標(biāo)簽或biotin標(biāo)簽)，混勻；

方案三：加入的供體為anti-his-eu³⁺cryptate(銪穴狀物偶聯(lián)的抗抗his抗體)，或anti-his-tb²⁺cryptate(鋱穴狀物偶聯(lián)的抗his抗體)，或streptavidin-eu³⁺cryptate(銪穴狀物偶聯(lián)的親和鏈霉素)，或streptavidin-tb²⁺cryptate(鋱穴狀物偶聯(lián)的親和鏈霉素)；加入的受體為streptavidin-d2(d2連接的親和鏈霉素)，或streptavidin-xl665(xl665連接的親和鏈霉素)，或anti-his-xl665(xl665連接的抗his抗體)，或anti-his-d2(d2連接的抗his抗體)；streptavidin僅與his標(biāo)簽配對；還加入a抗原和b抗原(分別帶有his標(biāo)簽和biotin標(biāo)簽)，混勻；

方案四：加入的供體為anti-his-eu³⁺cryptate(銪穴狀物偶聯(lián)的抗his抗體)，或anti-his-tb²⁺cryptate(鋱穴狀物偶聯(lián)的抗his抗體)，或streptavidin-eu³⁺cryptate(銪穴狀物偶聯(lián)的親和鏈霉素)，或streptavidin-tb²⁺cryptate(鋱穴狀物偶聯(lián)的親和鏈霉素)；加入的受體為anti-(h)fc-d2(d2連接的抗人lggfc的抗體)；還加入a抗原(帶有his標(biāo)簽或biotin標(biāo)簽)，混勻；

方案五：加入的供體為anti-his-eu³⁺cryptate(銪穴狀物偶聯(lián)的抗his抗體)，或anti-his-tb²⁺cryptate(鋱穴狀物偶聯(lián)的抗his抗體)，或streptavidin-eu³⁺cryptate(銪穴狀物偶聯(lián)的親和鏈霉素)，或streptavidin-tb(鋱穴狀物偶聯(lián)的親和鏈霉素)；加入的受體為anti-(h)fc-d2(d2連接的抗人lggfc的抗體)；還加入b抗原(帶有his標(biāo)簽或biotin標(biāo)簽)，混勻；

方案六：加入的供體為anti-lambda-eu³⁺cryptate(銪穴狀物偶聯(lián)的抗人lambda輕鏈的抗體)；加入的受體為anti-kappa-d2(d2連接的抗人kappa抗體)，混勻；

步驟3.以目標(biāo)雙特異性抗體作為標(biāo)準(zhǔn)品，在室溫孵育；

步驟4.設(shè)置熒光波長，讀取熒光值，根據(jù)em650/em620(em665/em620*104)熒光的比值與標(biāo)準(zhǔn)品的濃度進行四參數(shù)擬合，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算待測樣品的濃度以及生物學(xué)結(jié)合活性。

本發(fā)明的方法與現(xiàn)有的htrf的區(qū)別在于，本發(fā)明的方法1)既能檢測滴度又能檢測生物學(xué)活性，2)既能檢測輕鏈完整性又能檢測重鏈完整性。而現(xiàn)有的htfr僅限于滴度和重鏈完整性，所以本發(fā)明的方法能夠適用于檢測完整的雙特異性抗體。

其中，在本發(fā)明的步驟2中，所述方案一中的供體和受體分別間接或直接地結(jié)合a抗原和待測物的kappa鏈；所述方案二中的受體和供體分別間接或直接地結(jié)合b抗原和待測物的lambda鏈；所述方案三中的供體和受體分別結(jié)合a抗原和b抗原；所述方案四中的供體和受體分別間接或直接地結(jié)合a抗原和fc；所述方案五中的供體和受體分別間接或直接地結(jié)合b抗原和fc，或反之；所述方案六種的供體和受體分別結(jié)合待測物的lambda鏈和kappa鏈，或反之。

其中，在步驟2中，加入的a抗原及b抗原帶有his標(biāo)簽或biotin標(biāo)簽。

其中，在步驟3中，室溫孵育時間為2小時以上。

其中，在步驟1～3中的細(xì)胞上清液或待測物、供體、受體、a抗原和/或b抗原、以及標(biāo)準(zhǔn)品的用量均為2.5μl/孔。

其中，在步驟4中，所述熒光波長包括excitation313nm，emission665nm/620nm，cutoff630nm/590nm。

本發(fā)明的方法中，當(dāng)待測物(雙特異性抗體或多交叉抗體)同時被htrf熒光團供體或受體直接或間接結(jié)合后，有兩個激發(fā)光620nm和650nm，否則只有620nm一個激發(fā)光。em650/em620(em665/em620*104)熒光的比值與標(biāo)準(zhǔn)品的濃度成線性關(guān)系。

本發(fā)明的方法，可以用于雙特異性治療性抗體高表達細(xì)胞株的篩選。

本發(fā)明的方法，可以用于雙特異性治療性抗體生物學(xué)結(jié)合活性的測定，可以同時檢測雙特異性抗體的兩種結(jié)合活性，也可以同時檢測雙特異性抗體兩種輕鏈的完整性，還可以同時檢測雙特異性抗體輕鏈和重鏈的完整性。

采用本發(fā)明的方法，具有以下有益效果：

1)本發(fā)明的方法能夠更有效地篩選出完整的抗體分子和高雙特異性結(jié)合活性、高表達的細(xì)胞株。

2)本發(fā)明的方法具有低反應(yīng)體積的特點，能最大化節(jié)約了實驗試劑成本。

3)本發(fā)明的方法可大范圍地推廣應(yīng)用在cld克隆的高通量篩選。

4)本發(fā)明的方法用一個方法同時檢測，大大降低了人力、物力成本。

5)在表達雙特異性抗體的細(xì)胞株的建立和篩選階段,本發(fā)明可以更高效地篩選出完整的抗體分子和高雙特異性結(jié)合活性高表達的細(xì)胞株。

6)在原料藥和成品臨床實驗申報或商業(yè)化生產(chǎn)申報階段，提供可以用于雙特異性抗體藥物產(chǎn)品放行和穩(wěn)定性研究的生物學(xué)活性檢測方案。

附圖說明

圖1為實施例一中檢測方法得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；

圖2為實施例一中檢測方法得到的線性相關(guān)圖；

圖3為實施例二中檢測方法得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖一；

圖4為實施例二中檢測方法得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖二；

圖5為實施例二中檢測方法得到的線性相關(guān)圖一；

圖6為實施例二中檢測方法得到的線性相關(guān)圖二。

具體實施方式

下面將結(jié)合附圖對本發(fā)明的技術(shù)方案進行清楚、完整的描述，顯然，所描述的實施例是本發(fā)明的一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動的前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。實施例中使用的各試劑均為商品化試劑，或?qū)⑸唐坊噭┌闯Ｒ?guī)實驗操作處理得到。

本發(fā)明建立了雙特異性抗體活性評價與篩選的平臺，優(yōu)化了兩種創(chuàng)新的htrf技術(shù)，以抗a抗原和抗b抗原的雙特異性抗體為例，結(jié)合a抗原的輕鏈為lambda鏈，結(jié)合b抗原的輕鏈為kappa鏈，有以下六種方案：

方案一：htrf供體和受體分別間接或直接地結(jié)合a抗原和待測物的kappa鏈

1)在384微孔板中加入細(xì)胞上清液或待測物；

2)加入anti-kappa-d2(d2連接的抗人kappa輕鏈的抗體)；

3)加入anti-his-eu³⁺cryptate(銪穴狀物偶聯(lián)的抗抗his抗體)，或anti-his-tb²⁺cryptate(鋱穴狀物偶聯(lián)的抗his抗體)，或streptavidin-eu³⁺cryptate(銪穴狀物偶聯(lián)的親和鏈霉素)或streptavidin-tb²⁺cryptate(鋱穴狀物偶聯(lián)的親和鏈霉素)；

4)加入a抗原(帶有his標(biāo)簽或biotin標(biāo)簽)，混勻；

5)以目標(biāo)雙特異性抗體作為標(biāo)準(zhǔn)品，在室溫孵育約2小時或以上或過夜。

所述步驟1～4中的用量均為2.5μl/孔。

方案二：htrf受體和供體分別間接或直接地結(jié)合b抗原和產(chǎn)品的lambda鏈

1)在384微孔板中加入細(xì)胞上清液或待測物；

2)加入anti-lambda-eu³⁺cryptate(銪穴狀物偶聯(lián)的抗人lambda輕鏈的抗體)；

3)加入anti-his-xl665(xl665連接的抗his抗體)或anti-his-d2(d2連接的抗his抗體)，或streptavidin-d2(d2連接的親和鏈霉素)或streptavidin-xl665(xl665連接的親和鏈霉素)；

4)加入b抗原(帶有his標(biāo)簽或biotin標(biāo)簽)，混勻；

5)以目標(biāo)雙特異性抗體作為標(biāo)準(zhǔn)品，在室溫孵育2小時或以上或過夜。

所述步驟1～4中的用量均為2.5μl/孔。

方案三：htrf供體和受體分別結(jié)合a抗原和b抗原

1)在384微孔板中加入細(xì)胞上清液或待測物；

2)加入anti-his-eu³⁺cryptate(銪穴狀物偶聯(lián)的抗抗his抗體)，或anti-his-tb²⁺cryptate(鋱穴狀物偶聯(lián)的抗his抗體)，或streptavidin-eu³⁺cryptate(銪穴狀物偶聯(lián)的親和鏈霉素)或streptavidin-tb²⁺cryptate(鋱穴狀物偶聯(lián)的親和鏈霉素)；

3)加入供體相對應(yīng)的受體streptavidin-d2(d2連接的親和鏈霉素)或streptavidin-xl665(xl665連接的親和鏈霉素)，或anti-his-xl665(xl665連接的抗his抗體)或anti-his-d2(d2連接的抗his抗體)；streptavidin僅與histag配對；

4)加入a和b抗原(分別帶有his標(biāo)簽和biotin標(biāo)簽)，混勻；

5)以目標(biāo)雙特異性抗體作為標(biāo)準(zhǔn)品，在室溫孵育2小時或以上或過夜。

所述步驟1～4中的用量均為2μl/孔。

方案四：htrf供體和受體分別間接或直接地結(jié)合a抗原和fc

1)在384微孔板中加入細(xì)胞上清液或待測物；

2)加入anti-his-eu³⁺cryptate(銪穴狀物偶聯(lián)的抗his抗體)或anti-his-tb²⁺cryptate(鋱穴狀物偶聯(lián)的抗his抗體)，或streptavidin-eu³⁺cryptate(銪穴狀物偶聯(lián)的親和鏈霉素)或streptavidin-tb²⁺cryptate(鋱穴狀物偶聯(lián)的親和鏈霉素)；

3)加入anti-(h)fc-d2(d2連接的抗人lggfc的抗體)；

4)加入a抗原(帶有his標(biāo)簽或biotin標(biāo)簽)，混勻；

5)以目標(biāo)雙特異性抗體作為標(biāo)準(zhǔn)品，在室溫孵育2小時或以上或過夜。

所述步驟1～4中的用量均為2.5μl/孔。

方案五：htrf供體和受體(或反之，根據(jù)實際情況)分別間接或直接地結(jié)合b抗原和fc

1)在384微孔板中加入細(xì)胞上清液或待測物；

2)加入anti-his-eu³⁺cryptate(銪穴狀物偶聯(lián)的抗his抗體)或anti-his-tb²⁺cryptate(鋱穴狀物偶聯(lián)的抗his抗體)，或streptavidin-eu³⁺cryptate(銪穴狀物偶聯(lián)的親和鏈霉素)或streptavidin-tb(鋱穴狀物偶聯(lián)的親和鏈霉素)；

3)加入anti-(h)fc-d2(d2連接的抗人lggfc的抗體)；

4)加入b抗原(帶有his標(biāo)簽或biotin標(biāo)簽)，混勻；

5)以目標(biāo)雙特異性抗體作為標(biāo)準(zhǔn)品，在室溫孵育2小時或以上或過夜。

所述步驟1～4中的用量均為2.5μl/孔。

方案六：htrf供體和受體(或反之，根據(jù)實際情況)分別結(jié)合產(chǎn)品的lambda和kappa鏈

1)在384微孔板中加入細(xì)胞上清液或待測物；

2)加入anti-lambda-eu³⁺cryptate(銪穴狀物偶聯(lián)的抗人lambda輕鏈的抗體)；

3)加入anti-kappa-d2(d2連接的抗人kappa抗體)，混勻；

4)以目標(biāo)雙特異性抗體作為標(biāo)準(zhǔn)品，在室溫孵育2小時或以上或過夜。

所述步驟1中的用量為5μl/孔，2和3中的用量均為2.5μl/孔。

設(shè)置熒光波長：excitation313nm，emission665nm/620nm，cutoff630nm/590nm，讀取熒光值。根據(jù)em650/em620(em665/em620*104)熒光的比值與標(biāo)準(zhǔn)品的濃度進行四參數(shù)擬合，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算待測樣品的濃度。

用四參數(shù)對待測物和標(biāo)準(zhǔn)品的濃度和熒光比值進行擬合，根據(jù)參考品和待測物四參數(shù)擬合計算得到c值，即ec50值，利用下列公式計算得到待測物的生物學(xué)結(jié)合活性。

本發(fā)明中，當(dāng)待測物(雙特異性抗體或多交叉抗體)同時被htrf熒光團供體或受體直接或間接結(jié)合后，有兩個激發(fā)光620nm和650nm，否則只有620nm一個激發(fā)光。em650/em620(em665/em620*104)熒光的比值與標(biāo)準(zhǔn)品的濃度成線性關(guān)系。

本發(fā)明中，按照產(chǎn)品完整性分為：a)完整輕鏈，可以選擇方案一、二和六；b)完整重鏈，可選擇方案四和五；c)同時檢測完整雙特異性，可選擇方案三。

下面以抗a抗原雙特異性抗體為例，來具體說明本發(fā)明的方法的應(yīng)用。

實施例一，用于檢測輕鏈的完整性以及生物學(xué)活性：

1)在384微孔板中加入細(xì)胞上清液，anti-lambda-eu³⁺cryptate(銪穴狀物偶聯(lián)的抗lambda輕鏈的抗體)，anti-his-xl665(xl665連接的抗his抗體)，帶有his標(biāo)簽的重組人cd4蛋白(即a抗原)，混勻。以抗cd4和抗env的雙特異性抗體作為標(biāo)準(zhǔn)品(終濃度為0～250ng/ml)，在室溫孵育2小時或以上或過夜。

2)設(shè)置熒光波長：excitation313nm，emission665nm/620nm，cutoff630nm/590nm，讀取熒光值。

3)根據(jù)em650/em620(em665/em620*104)熒光的比值與標(biāo)準(zhǔn)品的濃度進行四參數(shù)擬合，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算待測樣品的濃度。標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。圖1中橫坐標(biāo)為雙特異性抗體的濃度，縱坐標(biāo)為相對熒光單位。

4)用不同純度的待測雙特異性抗體對方法進行了確認(rèn)，樣品均呈現(xiàn)良好的稀釋線性(rsd<15％)，htrf的結(jié)果與caliper的產(chǎn)品完整性結(jié)果成良好的正相關(guān)關(guān)系，相關(guān)性圖如圖2所示，r＝0.9529，這說明本方法可以有效地檢測輕鏈的完整性及其生物化學(xué)活性。

實施例二，用于檢測輕鏈和重鏈的完整性以及生物學(xué)活性：

1)在384微孔板#1中加入細(xì)胞上清液，anti-lambda-eu³⁺cryptate(穴狀物偶聯(lián)的抗lambda輕鏈的抗體)，anti-(h)fc-d2(d2連接的抗人lggfc的抗體)，混勻。以目標(biāo)雙特異性抗體作為標(biāo)準(zhǔn)品，在室溫孵育2小時或以上或過夜。

2)在384微孔板中加入細(xì)胞上清液，anti-(h)fc-d2(d2連接的抗人lggfc的抗體)，anti-his-eu³⁺cryptate(銪穴狀物偶聯(lián)的抗his抗體)，cd4蛋白(his標(biāo)簽)，混勻。以目標(biāo)雙特異性抗體作為標(biāo)準(zhǔn)品，在室溫孵育2小時或以上或過夜。

3)設(shè)置熒光波長：excitation313nm,emission665nm/620nm,cutoff630nm/590nm，讀取熒光值。

4)根據(jù)em650/em620(em665/em620*104)熒光的比值與標(biāo)準(zhǔn)品的濃度進行四參數(shù)擬合，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算待測樣品的濃度。其中，輕鏈的標(biāo)準(zhǔn)曲線和不同純度樣品的濃度結(jié)果如圖3所示，圖3中橫坐標(biāo)為雙特異性抗體的濃度，縱坐標(biāo)為相對熒光單位；重鏈和cd4的標(biāo)準(zhǔn)曲線和不同純度樣品的濃度結(jié)果如圖4所示，圖4中橫坐標(biāo)為雙特異性抗體的濃度，縱坐標(biāo)為相對熒光單位。

5)用不同純度的待測雙特異性抗體對方法進行了確認(rèn)，樣品均呈現(xiàn)良好的稀釋線性，htrf的結(jié)果與caliper的結(jié)果成良好的正相關(guān)關(guān)系，相關(guān)性圖分別如圖5(r＝0.9697)和圖6(r＝0.9734)所示。這說明本方法可以有效檢出輕鏈和重鏈的完整性以及生物學(xué)活性。

綜上所述，上述各實施例及附圖僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限定本發(fā)明的保護范圍，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所做的任何修改、等同替換、改進等，皆應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。