本發(fā)明屬于轉(zhuǎn)基因作物的除草劑耐受性無損檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及基于葉綠素?zé)晒獬上竦霓D(zhuǎn)基因玉米草甘膦耐受性表型的檢測方法。

背景技術(shù)：

隨著現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的快速發(fā)展，影響農(nóng)業(yè)生產(chǎn)發(fā)展的農(nóng)田雜草得到廣泛關(guān)注。研究表明，田間雜草影響農(nóng)作物的品質(zhì)，還會使作物的產(chǎn)量達到10％-100％不等的損失，嚴(yán)重威脅農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。目前，雜草的防除主要依靠噴施除草劑。草甘膦是上世紀(jì)70年代開發(fā)最為成功的一種除草劑。由于它殺草譜廣且具有極好的內(nèi)吸傳導(dǎo)性能，能有效防除多年生深根惡性雜草，且對人畜安全，易分解、不污染環(huán)境，已成為目前應(yīng)用最為廣泛的除草劑。但由于其是非選擇性除草劑，在防除雜草的同時殺死農(nóng)作物，這就限制了它的使用范圍和使用時間。因此培育出具有抗草甘膦特性的作物，能大大的提高除草效率降低生產(chǎn)成本，促進草甘膦工業(yè)的發(fā)展。

自從Comai等從鼠傷寒沙門氏菌中分離出抗草甘膦突變基因(aroA)以來，各國科研工作者對抗草甘膦轉(zhuǎn)基因作物進行了廣泛的研究。目前，全球已經(jīng)成功研制多種抗草甘膦作物，其中玉米發(fā)展最為迅速。目前轉(zhuǎn)基因耐草甘膦玉米的檢測方法主要有生物測定法、生理生化法、核酸分析法、蛋白質(zhì)分析法等。但這些方法對樣本具有破壞性，耗費大量人力、物力，且時效性差，不利于推廣應(yīng)用。因此，急需一種快速無損檢測技術(shù)對轉(zhuǎn)基因玉米草甘膦耐受性進行檢測，為轉(zhuǎn)基因耐草甘膦玉米的培育提供技術(shù)支持。

有研究表明噴施草甘膦后，植物體內(nèi)莽草酸含量升高，因此，莽草酸積累是植物經(jīng)草甘膦處理后最早出現(xiàn)的且相對敏感的生理指標(biāo)。葉綠素?zé)晒獬上窦夹g(shù)能夠及時探測外界脅迫對作物內(nèi)部生理的細微變化，簡單、快速、精確地預(yù)測玉米受到脅迫后莽草酸的含量，較好的反映玉米草甘膦的脅迫程度，對轉(zhuǎn)基因玉米草甘膦耐受性表型進行評價，具有廣闊的應(yīng)用前景。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

鑒于原有生物技術(shù)檢測的利弊現(xiàn)狀，本發(fā)明提供一種基于葉綠素?zé)晒獬上竦霓D(zhuǎn)基因玉米草甘膦耐受性表型的檢測方法，應(yīng)用葉綠素?zé)晒獬上窦夹g(shù)結(jié)合化學(xué)計量學(xué)方法對轉(zhuǎn)基因玉米草甘膦耐受性表型進行檢測，模型預(yù)測精度較高，為轉(zhuǎn)基因玉米草甘膦耐受性表型快速檢測提供切實有效的檢測手段

為了實現(xiàn)以上目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：

一種基于葉綠素?zé)晒獬上竦霓D(zhuǎn)基因玉米草甘膦耐受性表型的檢測方法，包括：

(1)：種植同等數(shù)量的轉(zhuǎn)基因玉米和非轉(zhuǎn)基因玉米，在玉米生長過程中，對一部分?jǐn)?shù)量的轉(zhuǎn)基因玉米和非轉(zhuǎn)基因玉米噴施濃度為1080g a.e.ha^-1的草甘膦溶液作為實驗組，對剩余的轉(zhuǎn)基因玉米和非轉(zhuǎn)基因玉米噴施等量的水作為對照組；

(2)通過制定莽草酸標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)合紫外分光光度法，獲得受草甘膦脅迫不同天數(shù)的轉(zhuǎn)基因玉米和非轉(zhuǎn)基因玉米的植株冠層葉片的莽草酸含量；

(3)應(yīng)用葉綠素?zé)晒獬上裣到y(tǒng)，獲取受草甘膦脅迫不同天數(shù)的轉(zhuǎn)基因玉米和非轉(zhuǎn)基因玉米的植株冠層的熒光參數(shù)；

(4)采用主成分分析，選擇對草甘膦脅迫響應(yīng)最敏感的葉綠素?zé)晒鈪?shù)；

(5)通過k-means方法在實驗組和對照組內(nèi)選擇建模集和預(yù)測集；

(6)以建模集內(nèi)樣本選擇的葉綠素?zé)晒鈪?shù)作為輸入，莽草酸含量作為輸出，建立轉(zhuǎn)基因玉米莽草酸PLSR回歸分析模型：

(7)將預(yù)測集內(nèi)樣本的葉綠素?zé)晒鈪?shù)輸入所述轉(zhuǎn)基因玉米莽草酸PLSR回歸分析模型，得到對樣本的莽草酸含量。

在步驟(1)中，分別種植120盆轉(zhuǎn)基因(轉(zhuǎn)入cry1Ab/cry2Aj-G10evo基因)和非轉(zhuǎn)基因玉米，在玉米生長至3葉期時，將濃度為1080g a.e.ha^-1的草甘膦溶液置于便攜式CO2高壓噴霧器中，分別對80株轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因玉米植株進行噴施作為實驗組，噴施壓力為23lb pol^-2，噴施量為120L ha^-1。在同等條件下，分別對40株轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因玉米植株噴施等量的水作為對照組。在噴施后的第2、4、6、8天各取40株株噴施草甘膦的玉米植株(轉(zhuǎn)基因玉米和非轉(zhuǎn)基因玉米各20株)，20株噴施水的玉米植株(轉(zhuǎn)基因玉米和非轉(zhuǎn)基因玉米各10株)進行實驗，共有實驗樣本240個。

在步驟(2)中，采用紫外分光光度法結(jié)合建立莽草酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法測定實驗樣本莽草酸含量。

(2.1)獲取莽草酸提取物：每個樣本取0.1g葉片加入1.5ml的0.25mol/L的HCl提取液，在冰浴狀態(tài)下迅速碾磨，于12000r/min離心10min，收集離心上清液。

(2.2)測定莽草酸提取物的OD值：取200μl的離心上清液加入微量滴定板上，加入2ml濃度為1％的高碘酸，3h后，加入2ml的1mol/L的NaOH溶液，再加入1.2ml的0.1mol/L的甘氨酸，混勻后放置5min，在紫外分光光度計380nm下比色，記錄OD值。

(2.3)測定莽草酸標(biāo)準(zhǔn)品的OD值并繪制莽草酸標(biāo)準(zhǔn)品的濃度與OD值的標(biāo)準(zhǔn)曲線：將sigma莽草酸標(biāo)準(zhǔn)品10mg溶于1.5ml的0.25mol/LHCL中，取0、1、2.5、5、10μl加入0.25mol/L HCL至1.0ml，用上述②步驟測定莽草酸標(biāo)準(zhǔn)品OD值，并繪制莽草酸標(biāo)準(zhǔn)品的濃度與OD值的標(biāo)準(zhǔn)曲線。其中，OD值為吸光度，實驗所測的OD值是用Gen5酶標(biāo)儀(美國博騰儀器有限公司生產(chǎn))來測量的，通過莽草酸標(biāo)準(zhǔn)品的濃度與OD值的標(biāo)準(zhǔn)曲線，可計算得到每個樣本的莽草酸含量。

在步驟(3)中，采用開放式的FluorCam 700成像系統(tǒng)(PSI，Brno，Czech Republic)獲取轉(zhuǎn)基因玉米植株冠層的葉綠素?zé)晒鈪?shù)。該熒光成像系統(tǒng)由CCD(帶電耦合器件)相機以12位分辨率捕獲一系列512×512像素的圖像。系統(tǒng)包括兩對LED光源，其中一對提供紅橙色(620nm)的光化光，強度為120μmol photons m-2s-1。另一對在800ms的白色波長(通常為500nm)中提供飽和脈沖，為強度高達1400μmol photons m-2s-1的冷白光。在測定葉綠素?zé)晒馇?，被測樣本需要暗適應(yīng)30分鐘。黑暗適應(yīng)后測葉綠素?zé)晒鈪?shù)Fo和Fm，23s黑暗后，用連續(xù)光化光(120μmol photons m-2s-1)照射植物92秒，獲得5個飽和脈沖。具體獲得的葉綠素?zé)晒鈪?shù)如下表：

在步驟(4)中，主成分(PCA)分析是一種對數(shù)據(jù)降維的方法，其篩選出的變量既能最大程度的反映原數(shù)據(jù)代表的信息，又能保證其反映出的信息不重疊。分析結(jié)果表明，第一個主成分(PC1)能反映85％的原信息，第三個主成分(PC3)能反映6％的原信息，因此，基于PC1和PC3，可以得到對草甘膦脅迫響應(yīng)最敏感的葉綠素?zé)晒鈪?shù)為Fv和Fq。

在步驟(5)中，基于轉(zhuǎn)基因玉米植株葉綠素?zé)晒鈪?shù)建立PLSR模型，剔除異常樣本15個，用k-means方法選擇建模集樣本70個，預(yù)測集樣本35個。具體算法如下，隨機選取K個聚類質(zhì)心點(cluster centroids)為μ1，μ2，……μk,重復(fù)下面過程直到收斂:

隨機選取K個聚類質(zhì)心點為μ1，μ2，……μk，重復(fù)下面過程直到收斂(樣例和聚類質(zhì)心點都只x方向的坐標(biāo))：

對于每一個樣例i，計算其應(yīng)該屬于的類：

c⁽ⁱ⁾＝argmin_j||x⁽ⁱ⁾-μ_j||2

其中，x⁽ⁱ⁾為第i個樣例的x坐標(biāo)，c⁽ⁱ⁾代表樣例i與k個類中距離最近的那個類，其值是1到k中的一個。

對于每一個類j，重新計算該類的質(zhì)心：

式中，μ_j為第j類的質(zhì)心的x坐標(biāo)。

在步驟(6)中，由于非轉(zhuǎn)基因玉米植株噴施草甘膦后隨時間的變化莽草酸含量變化很小，因此不對非轉(zhuǎn)基因玉米植株進行建模分析。對轉(zhuǎn)基因玉米植株，葉綠素?zé)晒鈪?shù)為Fv、Fq作為輸入，莽草酸含量作為輸出，建立PLSR回歸分析模型，建模集和預(yù)測集的決定系數(shù)為R²＝0.75和0.63。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：

(1)操作簡單環(huán)保，避免了傳統(tǒng)莽草酸含量檢測所需化學(xué)試劑的使用及樣品制備的繁瑣過程，能快速有效地監(jiān)測草甘膦脅迫的轉(zhuǎn)基因玉米植株莽草酸含量，為反映玉米草甘膦的脅迫程度提供有效手段，具有良好的應(yīng)用前景；

(2)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)簡單，易于操作，能夠快速的獲取目標(biāo)植株的表型，基本實現(xiàn)自動化檢測。

附圖說明

圖1是本發(fā)明基于葉綠素?zé)晒獬上窦夹g(shù)的轉(zhuǎn)基因玉米草甘膦耐受性表型檢測的技術(shù)路線圖。

圖2是葉綠素?zé)晒鈪?shù)主成分分析結(jié)果圖。

圖3是本發(fā)明基于轉(zhuǎn)基因玉米植株莽草酸PLSR模型的回歸分析結(jié)果。

具體實施方式

下面結(jié)合附圖和實施例，進一步詳細描述。本具體實施方式是以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進行實施，應(yīng)理解這些方式僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。如圖1所示，本發(fā)明以轉(zhuǎn)雙價基因(cry1Ab/cry2Aj-G10evo)的玉米為實施實例，其他的植物的表型可參照該實施例的方法進行。

1.制備實驗樣本。種植120盆轉(zhuǎn)基因(轉(zhuǎn)入cry1Ab/cry2Aj-G10evo基因)和非轉(zhuǎn)基因玉米，在玉米生長至3葉期時，將濃度為1,080g a.e.ha^-1的草甘膦溶液置于便攜式CO2高壓噴霧器中，分別對80株轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因玉米植株進行噴施作為實驗組，噴施壓力為23lb pol^-2，噴施量為120L ha^-1。在同等條件下，分別對40株轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因玉米植株噴施等量的水作為對照組。在噴施后的第2、4、6、8天各取40株株噴施草甘膦的玉米植株(轉(zhuǎn)基因玉米和非轉(zhuǎn)基因玉米各20株)，20株噴施水的玉米植株(轉(zhuǎn)基因玉米和非轉(zhuǎn)基因玉米各10株)進行實驗，共有實驗樣本240個。

2.采用紫外分光光度法結(jié)合制定莽草酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法測定實驗樣本莽草酸含量。①獲取莽草酸提取物：每個樣本取0.1g葉片加入裝有1.5ml的0.25mol/L的HCl提取液，在冰浴狀態(tài)下迅速碾磨，于12000r/min離心10min，收集離心上清液。②測定莽草酸提取物的OD值：取200μl的離心上清液加入微量滴定板上，加入2ml濃度為1％的高碘酸，3h后，加入2ml的1mol/L的NaOH溶液，再加入1.2ml的0.1mol/L的甘氨酸，混勻后放置5min，在紫外分光光度計380nm下比色，記錄OD值。③測定莽草酸標(biāo)準(zhǔn)品的OD值并繪制莽草酸標(biāo)準(zhǔn)品的濃度與OD值的標(biāo)準(zhǔn)曲線：將sigma莽草酸標(biāo)準(zhǔn)品10mg溶于1.5ml的0.25mol/LHCL中，取0、1、2.5、5、10μl加入0.25mol/L HCL至1.0ml，用上述②步驟測定莽草酸標(biāo)準(zhǔn)品OD值，并繪制莽草酸標(biāo)準(zhǔn)品的濃度與OD值的標(biāo)準(zhǔn)曲線。其中，OD值為吸光度，實驗所測的OD值是用Gen5酶標(biāo)儀(美國博騰儀器有限公司生產(chǎn))來測量的，通過莽草酸標(biāo)準(zhǔn)品的濃度與OD值的標(biāo)準(zhǔn)曲線，可計算得到每個樣本的莽草酸含量。

3.采用開放式的FluorCam 700成像系統(tǒng)(PSI，Brno，Czech Republic)獲取轉(zhuǎn)基因玉米植株冠層的葉綠素?zé)晒鈪?shù)。該熒光成像系統(tǒng)由CCD(帶電耦合器件)相機以12位分辨率捕獲一系列512×512像素的圖像。系統(tǒng)包括兩對LED光源，其中一對提供紅橙色(620nm)的光化光，強度為120μmol photons m-2s-1。另一對在800ms的白色波長(通常為500nm)中提供飽和脈沖，為強度高達1,400μmol photons m-2s-1的冷白光。在測定葉綠素?zé)晒馇?，被測樣本需要暗適應(yīng)30分鐘。黑暗適應(yīng)后測葉綠素?zé)晒鈪?shù)Fo和Fm，23s黑暗后，用連續(xù)光化光(120μmol photons m-2s-1)照射植物92秒，獲得5個飽和脈沖。

4.如圖2所示，采用主成分(PCA)分析，選擇出對草甘膦脅迫響應(yīng)最敏感的葉綠素?zé)晒鈪?shù)為Fv和Fq。主成分(PCA)分析是一種對數(shù)據(jù)降維的方法，其篩選出的變量既能最大程度的反映原數(shù)據(jù)代表的信息，又能保證其反映出的信息不重疊。

5.基于轉(zhuǎn)基因玉米植株葉綠素?zé)晒鈪?shù)建立PLSR模型，剔除異常樣本15個，用k-means方法選擇建模集樣本70個，預(yù)測集樣本35個。

6.如圖3所示，將葉綠素?zé)晒鈪?shù)為Fv、Fq作為輸入，莽草酸含量作為輸出，建立PLSR回歸分析模型，建模集和預(yù)測集的決定系數(shù)為R²分別為0.75和0.63。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施舉例，并不用于限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。