本發(fā)明涉及一種紫外光譜法高通量檢測(cè)對(duì)香豆酸的方法，屬于生物化學(xué)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

對(duì)香豆酸屬于苯丙素類化合物，其具有抗細(xì)菌和降血脂等眾多生理功效和生物活性，已經(jīng)被廣泛的作為食品和藥品的有效成分。由于苯丙素類化合物是由苯環(huán)和3個(gè)碳原子相連而構(gòu)成的一類化合物的總稱，而對(duì)香豆酸是苯丙素類化合物中較為簡(jiǎn)單的化合物。因此，對(duì)香豆酸作為合成更多其他結(jié)構(gòu)更為復(fù)雜的苯丙素類化合物，如黃酮類化合物等的重要前體或中間產(chǎn)物，在代謝工程和合成生物學(xué)中的地位十分重要。

對(duì)香豆酸作為眾多具有藥用價(jià)值的苯丙素類化合物的中間代謝產(chǎn)物，在代謝工程中其在胞內(nèi)的積累水平直接影響到目標(biāo)苯丙素類化合物的生產(chǎn)水平。因此在分子生物學(xué)改造生產(chǎn)苯丙素類化合物時(shí)，常常以發(fā)酵體系中積累的對(duì)香豆酸水平作為從葡萄糖到目標(biāo)化合物的代謝流平衡與否的重要標(biāo)志。對(duì)菌體代謝流帶改造需要隨時(shí)檢測(cè)中間產(chǎn)物對(duì)香豆酸的含量，而目前普遍應(yīng)用的高效液相色譜(HPLC)檢測(cè)方法雖然非常準(zhǔn)確，但是檢測(cè)效率偏低，無(wú)法滿足高通量的快速檢測(cè)需求。

已有研究表明，由L-酪氨酸作為底物合成對(duì)香豆酸等苯丙素類化合物的過(guò)程中，酪氨酸解氨酶(TAL)活性較低是限制苯丙素類化合物的大量合成的關(guān)鍵因素。而由于檢測(cè)方法的限制，對(duì)已有高活性TAL進(jìn)行隨機(jī)突變改造困難重重。雖然早在1987年Abell報(bào)道了在315nm處可檢測(cè)對(duì)香豆酸含量，然而其所應(yīng)用的反應(yīng)體系為純凈的緩沖液體系，無(wú)法應(yīng)用于發(fā)酵工程領(lǐng)域。因此為了加速對(duì)香豆酸合成限速酶TAL的進(jìn)化，建立一套可快速檢測(cè)發(fā)酵液中對(duì)香豆酸含量的檢測(cè)方法對(duì)于推進(jìn)苯丙素類植物天然產(chǎn)物的大規(guī)模合成具有重要意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決上述問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種通過(guò)添加NaBH₄作為助色基團(tuán)的檢測(cè)對(duì)香豆酸的方法。

所述檢測(cè)對(duì)香豆酸的方法，是向待測(cè)樣品中，添加NaBH₄，于300～400nm處檢測(cè)紫外光吸收強(qiáng)度，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定待測(cè)樣品中對(duì)香豆酸的含量。

所述檢測(cè)對(duì)香豆酸的方法，是于339nm處檢測(cè)紫外光吸收強(qiáng)度。

所述待測(cè)樣品，是生物法合成對(duì)香豆酸得到的樣品。包括以微生物發(fā)酵制備對(duì)香豆酸時(shí)，得到的發(fā)酵上清液。

所述待測(cè)樣品的pH呈堿性，例如pH10～12。

所述以微生物發(fā)酵制備對(duì)香豆酸，包括以大腸桿菌作為對(duì)香豆酸生產(chǎn)菌株，以葡萄糖、或L-酪氨酸為底物發(fā)酵制備對(duì)香豆酸。

所述以微生物發(fā)酵制備對(duì)香豆酸，包括以大腸桿菌作為對(duì)香豆酸生產(chǎn)菌株，以MOPS培養(yǎng)基為發(fā)酵培養(yǎng)基。

所述NaBH₄，在待測(cè)樣品中的濃度為0.5％～3％。

所述NaBH₄，在待測(cè)樣品中的濃度為0.5％～1％。

所述NaBH₄，可首先溶解于水、甲醇、乙醇或二甲基亞砜等不干擾檢測(cè)的溶劑中，再添加到待測(cè)樣品中。

所述檢測(cè)對(duì)香豆酸的方法，還包括前處理，以去除菌體、細(xì)胞碎片和固體代謝產(chǎn)物等雜質(zhì)。

所述檢測(cè)對(duì)香豆酸的方法，其中，紫外光吸收強(qiáng)度可利用多功能酶標(biāo)儀和分光光度計(jì)等可檢測(cè)紫外吸收信號(hào)的儀器檢測(cè)。

針對(duì)發(fā)酵工業(yè)中苯丙素類化合物的中間代謝產(chǎn)物對(duì)香豆酸檢測(cè)困難的問(wèn)題，本發(fā)明建立了一種簡(jiǎn)單快捷的發(fā)酵產(chǎn)品對(duì)香豆酸的高通量檢測(cè)方法，首次實(shí)現(xiàn)了通過(guò)添加NaBH₄助色基團(tuán)可使對(duì)香豆酸(紅移47nm)和L-酪氨酸的最大吸收峰分離，并在在339nm處形成一個(gè)新的最大吸收峰，且紫外吸收強(qiáng)度與對(duì)香豆酸含量呈正比。本發(fā)明方法特別適合微生物發(fā)酵體系中對(duì)香豆酸的高通量檢測(cè)，為苯丙素類化合物的微生物法生產(chǎn)的中間代謝產(chǎn)物檢測(cè)提供了方法。對(duì)香豆酸合成相關(guān)的酶學(xué)性質(zhì)檢測(cè)同樣可采用此方法。與傳統(tǒng)的HPLC檢測(cè)方法相比較，本方法最大的優(yōu)勢(shì)是檢測(cè)效率高，無(wú)需復(fù)雜的樣品前處理過(guò)程，可實(shí)現(xiàn)在多孔板中的高通量檢測(cè)。基于此檢測(cè)方法，未來(lái)誘變技術(shù)和隨機(jī)突變方法以及其他的高通量改造策略均可應(yīng)用于對(duì)對(duì)香豆酸等苯丙素類化合物微生物法生產(chǎn)。

附圖說(shuō)明

圖1對(duì)香豆酸和L-酪氨酸全波長(zhǎng)掃描光譜。

圖2不同pH環(huán)境下對(duì)香豆酸和L-酪氨酸全波長(zhǎng)掃描光譜，A：自然pH≈4.5，B：pH＝7，C：pH＝8，D：pH＝10，E：pH＝12。對(duì)香豆酸(實(shí)線)，L-酪氨酸(虛線)。

圖3混合交叉實(shí)驗(yàn)測(cè)定結(jié)果，實(shí)線代表HPLC測(cè)定結(jié)果，虛線代表紫外光檢測(cè)結(jié)果。

具體實(shí)施方式

材料與方法

野生型E.coli BL21(DE3)，NaBH₄，對(duì)香豆酸，L-酪氨酸，N-[三(羥甲基)甲基]甘氨酸，丙二酸鈉，二甲基亞砜，MOPS均購(gòu)自上海生工。紫外可透的96潛孔板購(gòu)自康寧公司。多功能酶標(biāo)儀Cytation 3 plate reader(BioTek)用于檢測(cè)樣品熒光強(qiáng)度。

實(shí)施例1光譜學(xué)性質(zhì)分析

首先以二甲基亞砜(DMSO)為溶劑配制200mg/L的對(duì)香豆酸、50mg/L的L-酪氨酸。由于L-酪氨酸是對(duì)香豆酸的直接前體，為了驗(yàn)證L-酪氨酸與對(duì)香豆酸的紫外吸收是否會(huì)相互干擾，將配制好的樣品置于多功能酶標(biāo)儀Cytation 3 plate reader(BioTek)進(jìn)行230～999nm全波長(zhǎng)掃描。結(jié)果顯示兩種物質(zhì)均在290nm處具有最大吸收峰(圖1)。即在不添加助色基團(tuán)時(shí)是無(wú)法分離L-酪氨酸和對(duì)香豆酸的最大吸收峰的，因此無(wú)法針對(duì)對(duì)香豆酸定量分析。

實(shí)施例2檢測(cè)波長(zhǎng)對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響

發(fā)酵產(chǎn)品產(chǎn)量檢測(cè)的一個(gè)重要挑戰(zhàn)之一是，發(fā)酵液中存在的復(fù)雜成分可能會(huì)干擾目標(biāo)化合物的檢測(cè)。我們利用MOPS培養(yǎng)基培養(yǎng)野生型的大腸桿菌BL21(DE3)48h。隨后將發(fā)酵液12000rpm離心5min，取上清液作為溶劑(自然pH≈4.5)，配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2％的NaBH₄溶液作為助色基團(tuán)，再分別添加10mg/L對(duì)香豆酸、50mg/L L-酪氨酸。隨后，利用多功能酶標(biāo)儀進(jìn)行230～999nm的全波長(zhǎng)掃描，掃描結(jié)果顯示，當(dāng)以MOPS作為發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)大腸桿菌BL21(DE3)得到的發(fā)酵液中，NaBH₄作為助色基團(tuán)時(shí)，對(duì)香豆酸在339nm處可形成一個(gè)新的吸收峰，且與L-酪氨酸在290nm處形成的吸收峰重疊區(qū)域較少(圖2A)。由此可知，以MOPS作為發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)大腸桿菌BL21(DE3)時(shí)，在339nm處以NaBH₄作為助色基團(tuán)可定量檢測(cè)發(fā)酵液中對(duì)香豆酸的含量。

利用M9培養(yǎng)基培養(yǎng)野生型的大腸桿菌BL21(DE3)得到的發(fā)酵液與NaBH₄溶液、對(duì)香豆酸混合時(shí)會(huì)形成沉淀，無(wú)法檢測(cè)對(duì)香豆酸。

實(shí)施例3 NBH₄溶液濃度與發(fā)酵液pH對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響

(1)利用MOPS培養(yǎng)基培養(yǎng)野生型的大腸桿菌BL21(DE3)48h，隨后將發(fā)酵液12000rpm離心5min，取上清液作為溶劑(自然pH≈4.5)，分別配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1％、2％、4％和6％的NaBH₄溶液作為溶劑用于檢測(cè)對(duì)香豆酸。

(2)分別以DMSO為溶劑配制濃度為4、8、12、16和20mg/L的對(duì)香豆酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。將對(duì)香豆酸標(biāo)準(zhǔn)溶液分別與步驟(1)得到的濃度為1％、2％、4％和6％的NaBH₄溶液等體積混合，隨后于多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)紫外吸收強(qiáng)度，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。以標(biāo)準(zhǔn)曲線R²為評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果顯示如表1：

表1 NaBH₄濃度優(yōu)化

測(cè)定結(jié)果顯示，以MOPS為發(fā)酵培養(yǎng)基時(shí)，以發(fā)酵上清配制0.5％的NaBH₄溶液用于檢測(cè)對(duì)香豆酸時(shí)，能獲得很好的標(biāo)準(zhǔn)曲線(R²＝0.9998)。

由于NaBH₄是一種強(qiáng)還原劑，在酸性條件下不穩(wěn)定會(huì)生成大量氣泡，在堿性條件下卻可以穩(wěn)定存在，而大腸桿菌發(fā)酵液顯酸性，從而影響了檢測(cè)準(zhǔn)確性。因此，需要對(duì)發(fā)酵液pH進(jìn)行調(diào)整。利用KOH溶液調(diào)節(jié)以MOPS培養(yǎng)基、大腸桿菌BL21(DE3)發(fā)酵得到的發(fā)酵上清的pH分別為4.5(自然pH)、7、8、10和12。應(yīng)用調(diào)節(jié)過(guò)pH后的發(fā)酵上清配制0.5％的NaBH₄溶液，隨后分別與10mg/L的對(duì)香豆酸和50mg/L的L-酪氨酸等體積混合。全波長(zhǎng)掃描結(jié)果顯示在pH＝12時(shí)具有最大的紫外吸收信號(hào)(圖2)。由于在高堿性條件下NaBH₄可以更穩(wěn)定的存在，因此可知，pH＝12時(shí)是對(duì)香豆酸檢測(cè)的最佳檢測(cè)pH。

實(shí)施例4 HPLC與紫外檢測(cè)方法比較

由于在真實(shí)的發(fā)酵體系中，需檢測(cè)的目標(biāo)化合物往往與中間代謝產(chǎn)物和培養(yǎng)基混合在一起，混合的檢測(cè)體系可能會(huì)對(duì)檢測(cè)的準(zhǔn)確性造成干擾。為驗(yàn)證混合體系對(duì)對(duì)香豆酸的紫外光譜檢測(cè)方法造成的干擾程度，實(shí)驗(yàn)將對(duì)香豆酸和其直接前體L-酪氨酸以及以MOPS培養(yǎng)基、大腸桿菌BL21(DE3)發(fā)酵得到的發(fā)酵上清按照不同的比例混合，從而配制出不同的混合體系，分別利用本發(fā)明和常用的HPLC檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)。混合體系中的各成分含量見(jiàn)表2。

表2 0.5％NaBH₄混合體系各成分比例

當(dāng)混合體系中L-酪氨酸含量逐漸增加時(shí)，以發(fā)酵上清配制的0.5％的NaBH₄溶液作為助色基團(tuán)，在339nm處檢測(cè)時(shí)，對(duì)香豆酸含量檢測(cè)結(jié)果總體與HPLC檢測(cè)結(jié)果相吻合(誤差±10％)(圖3)。從而可知此紫外光譜法檢測(cè)發(fā)酵體系中對(duì)香豆酸含量具有一定的準(zhǔn)確性。

雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例公開(kāi)如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動(dòng)與修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書(shū)所界定的為準(zhǔn)。