本發(fā)明涉及半導(dǎo)體材料與器件以及生物化學(xué)領(lǐng)域，特別是利用gan基高電子遷移率晶體管(hemt)研制的檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物的核酸適配子傳感器及其制備方法。

背景技術(shù)：

眾所周知，癌癥威脅著全球人類的健康，由癌癥引發(fā)的死亡人數(shù)也呈逐年增長(zhǎng)的趨勢(shì)。癌癥作為世界上第二大致死因素，在2015年已經(jīng)累計(jì)造成880萬起死亡病例，約占全球死亡總數(shù)的六分之一。其中，肺癌、胃癌、肝癌、結(jié)直腸癌、食管癌、女性乳腺癌、甲狀腺癌、宮頸癌、腦瘤和胰腺癌是我國主要的惡性腫瘤，約占全部新發(fā)病例的75％。肺癌、肝癌、胃癌、食管癌、結(jié)直腸癌、胰腺癌、乳腺癌、腦瘤、白血病和淋巴瘤是主要的腫瘤死因，約占全部腫瘤死亡病例的80％。中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院院長(zhǎng)赫捷表示，大多數(shù)惡性腫瘤有10年至15年的潛伏時(shí)間來糾正，然而超六成患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已到中晚期。實(shí)際上，目前我國腫瘤發(fā)病率在世界范圍內(nèi)處于較低水平，但治愈率也較低，其中一個(gè)原因就是發(fā)現(xiàn)晚。因此，實(shí)現(xiàn)惡性腫瘤的早期診斷，具有極其深遠(yuǎn)的意義。

腫瘤標(biāo)志物是腫瘤細(xì)胞通過基因表達(dá)而合成、分泌，或是機(jī)體對(duì)腫瘤反應(yīng)而異常產(chǎn)生或表達(dá)水平異常的一類物質(zhì)，它在患者體內(nèi)含量遠(yuǎn)高于健康成人體內(nèi)含量，在腫瘤早期發(fā)現(xiàn)、診斷及預(yù)后中均起到重要作用。腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)是臨床上發(fā)現(xiàn)腫瘤的重要手段，目前臨床常用的腫瘤標(biāo)志物及其主診的腫瘤類型主要有：癌胚抗原(cea)，癌抗原19-9(ca19-9)，甲胎蛋白(afp)，醛縮酶，癌胚鐵蛋白，鐵蛋白(sf)可作為肝癌的有效診斷標(biāo)志物；前列腺特異抗原(psa)在前列腺癌中陽性率高達(dá)30％～86％，其升高水平與腫瘤密切相關(guān)；癌胚抗原(cea)等其他相應(yīng)腫瘤標(biāo)志物在乳腺癌，結(jié)腸直腸癌，膽囊癌，食管癌，卵巢癌，胃癌等的早期診斷，預(yù)后判斷和治療中發(fā)揮著重要作用。

核酸適配子(aptamer)是一小段經(jīng)過體外篩選selex技術(shù)(systematicevolutionofligandsbyexponentialenrichment，即指數(shù)式富集法配體演化技術(shù))而得到的寡核苷酸鏈，它是從人工合成的dna或rna隨機(jī)庫中篩選出來的，能與對(duì)應(yīng)的配體靶分子進(jìn)行高親和力和強(qiáng)特異性的結(jié)合，是目前應(yīng)用最廣泛的dna探針。相對(duì)于傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)抗體，核酸適配子具有很多優(yōu)點(diǎn)，如親和力高，特異性強(qiáng)，制備簡(jiǎn)單，易于進(jìn)行化學(xué)修飾與分離，靶分子分布范圍廣，與目標(biāo)靶分子的結(jié)合條件可控，穩(wěn)定性好等。核酸適配子與靶分子結(jié)合原理完全不同于傳統(tǒng)的抗原與抗體結(jié)合的機(jī)理，一般情況下，無需知道結(jié)合內(nèi)部結(jié)構(gòu)及原理，只要通過selex技術(shù)篩選出特定的具有很高的結(jié)合力的核酸序列即可，已經(jīng)被應(yīng)用于生物化學(xué)，醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)，藥物合成篩選，環(huán)境監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域，有著廣泛的發(fā)展空間和良好的應(yīng)用前景。

近年來，以氮化鎵(gan)為典型代表的第三代寬禁帶半導(dǎo)體材料和器件的研發(fā)、突破和逐步走向成熟，與傳統(tǒng)的si和gaas半導(dǎo)體相比，gan具有禁帶寬度大、擊穿電場(chǎng)高、電子遷移率高、抗輻射能力強(qiáng)、對(duì)生物分子無毒性和良好的化學(xué)穩(wěn)定性等優(yōu)異特性；而且gan可以與algan和alingan等合金材料構(gòu)成異質(zhì)結(jié)，其異質(zhì)結(jié)界面上大的能帶帶階不連續(xù)及壓電極化和自發(fā)極化可產(chǎn)生高濃度的二維電子氣(2deg)，電子濃度比algaas/gaas異質(zhì)結(jié)提高了一個(gè)數(shù)量級(jí)。因此，基于gan材料的hemt器件在生化檢測(cè)領(lǐng)域具有十分重要的應(yīng)用價(jià)值。algan/gan異質(zhì)結(jié)構(gòu)中，即使algan勢(shì)壘層非故意摻雜，在異質(zhì)結(jié)界面處也能獲得高濃度的二維電子氣(10¹³cm^-2量級(jí))，這主要是由以下兩個(gè)方面造成：一是由于gan/algan異質(zhì)結(jié)存在非常強(qiáng)的自發(fā)極化和壓電極化作用；二是由于gan和algan材料存在大的導(dǎo)帶帶階不連續(xù)，使得形成的二維電子氣被有效的限制在禁帶寬度較窄的gan一側(cè)。二維電子氣密度和gan基外延材料的表面狀態(tài)息息相關(guān)，材料表面狀態(tài)的微小變化便可以引起二維電子氣濃度的改變。由于algan/gan異質(zhì)結(jié)構(gòu)材料的這一特性，使得其在傳感器領(lǐng)域日漸顯露出獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。

現(xiàn)有的gan基hemt生物傳感器在檢測(cè)癌癥抗原方面都采用的是傳統(tǒng)的抗原與抗體結(jié)合機(jī)理，檢測(cè)極限濃度比較高，例如b.s.kang等人針對(duì)乳腺癌抗原和前列腺癌抗原的檢測(cè)極限濃度分別為0.25μg/ml，10pg/ml，李加?xùn)|等人的無柵型algan/ganhemt生物傳感器檢測(cè)前列腺癌的極限濃度為0.1pg/ml。由于核酸適配子相對(duì)于抗體對(duì)抗原的親和力更強(qiáng)，更易捕獲溶液中微量的抗原分子，因此gan基核酸適配子生物傳感器可以檢測(cè)到更低濃度的抗原溶液，靈敏度更高，檢測(cè)極限濃度可以達(dá)到pg/ml以下甚至fg/ml量級(jí)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于，提高腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)的靈敏度，使檢測(cè)極限濃度達(dá)到pg/ml以下甚至fg/ml量級(jí)。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

本發(fā)明提供一種用于腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)的gan基hemt核酸適配子傳感器，包括：

gan基hemt，其包括柵極區(qū)域、源極區(qū)域和漏極區(qū)域，柵極區(qū)域位于源極區(qū)域和漏極區(qū)域之間；

源極電極和漏極電極，分別與所述gan基hemt上的源極區(qū)域和漏極區(qū)域形成歐姆接觸；

柵極電極，與所述gan基hemt上的柵極區(qū)域形成肖特基接觸；

氮化硅薄膜保護(hù)層，其位于所述源極電極、漏極電極和所述柵極電極的周邊及上側(cè)，僅露出與各電極接觸的區(qū)域；

核酸適配子單鏈，形成于所述柵極電極上，其能對(duì)腫瘤標(biāo)志物進(jìn)行高靈敏性及特異性識(shí)別。

其中，腫瘤標(biāo)志物本身所帶的電荷會(huì)影響到所述柵極電極表面電荷的分布，進(jìn)而影響到所述gan基hemt溝道中的二維電子氣濃度，從而使源漏電流發(fā)生變化。

優(yōu)選的，在上述的gan基hemt核酸適配子傳感器中，所述源極電極和漏極電極之間的距離為5μm-30μm。

優(yōu)選的，在上述的gan基hemt核酸適配子傳感器中，所述柵極電極由以下材料之一構(gòu)成：ni/au薄膜、au薄膜或au納米顆粒。

優(yōu)選的，在上述的gan基hemt核酸適配子傳感器中，所述柵極電極的厚度為5nm-50nm，柵極區(qū)域面積為200μm²-1200μm²。

優(yōu)選的，在上述的gan基hemt核酸適配子傳感器中，所述柵極電極均制備獨(dú)立的電極引線，所述電極引線通過施加電壓來測(cè)試器件的柵控能力并以此來衡量傳感器件的靈敏性，提高腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)的靈敏性也避免了試劑的浪費(fèi)。

優(yōu)選的，在上述的gan基hemt核酸適配子傳感器中，所述核酸適配子單鏈分子通過共價(jià)鍵合法或非共價(jià)結(jié)合法在柵極電極上固定，能對(duì)腫瘤標(biāo)志物進(jìn)行高靈敏性及特異性識(shí)別，所述核酸適配子通過末端修飾的巰基官能團(tuán)在柵極電極表面形成au-s鍵，從而實(shí)現(xiàn)在傳感器柵極電極上的固定。

相應(yīng)地，本發(fā)明還公開了一種檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物的gan基hemt核酸適配子傳感器的制備方法，包括：

步驟1：制備gan基hemt；

步驟2：在所述gan基hemt上制作源極電極和漏極電極；

步驟3：在所述gan基hemt的柵極區(qū)域制作柵極電極；

步驟4：利用磁控濺射工藝在所述gan基hemt上濺射ti/al/ti/au作為各電極的金屬引線pad；

步驟5：利用pecvd(plasmaenhancedchemicalvapordeposition，等離子體增強(qiáng)化學(xué)氣相沉積法)工藝沉積氮化硅薄膜用作保護(hù)層，并通過icp刻蝕僅露出與各電極接觸的區(qū)域窗口；

步驟6：在柵極電極上固定經(jīng)巰基修飾后的生物敏感膜。

其中，步驟6中的該生物敏感膜能特異性識(shí)別腫瘤標(biāo)志物，受到腫瘤標(biāo)志物本身電荷的影響，使得所述柵極表面電荷分布發(fā)生變化，進(jìn)而影響所述gan基hemt溝道中二維電子氣濃度，使得源漏電流發(fā)生變化。

優(yōu)選的，在上述檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物的gan基hemt核酸適配子傳感器的制備方法中，所述步驟1中的gan基hemt，其結(jié)構(gòu)包括：

藍(lán)寶石襯底或硅襯底或碳化硅襯底；

高阻半絕緣gan緩沖層，形成于所述襯底上，其生長(zhǎng)厚度為2μm-3.5μm；

高遷移率gan溝道層，形成于所述高阻半絕緣gan緩沖層上，其生長(zhǎng)厚度為50nm-100nm；

薄層aln插入層，形成于所述高遷移率gan溝道層上，其生長(zhǎng)厚度為1nm-5nm；

n型摻雜或非故意摻雜algan勢(shì)壘層，形成于所述薄層aln插入層上，其生長(zhǎng)厚度為20nm-30nm。

gan蓋帽層，形成于所述n型摻雜或非故意摻雜algan勢(shì)壘層上，其生長(zhǎng)厚度為1nm–10nm。

本發(fā)明的有益成果在于：本發(fā)明結(jié)合gan基hemt高的電子遷移率及二維電子氣濃度等優(yōu)點(diǎn)，以及對(duì)腫瘤標(biāo)志物抗原具有高親和力的核酸適配子在傳感器柵區(qū)表面形成的生物敏感膜，可以將以癌胚抗原(cea)為例的腫瘤標(biāo)志物的檢測(cè)極限提升到一個(gè)新的高度，預(yù)計(jì)可以達(dá)到pg/ml以下甚至fg/ml量級(jí)，大大提高了傳感器檢測(cè)靈敏度，實(shí)現(xiàn)惡性腫瘤的早期診斷，造福廣大癌癥患者。本發(fā)明可對(duì)腫瘤標(biāo)志物實(shí)現(xiàn)快速，實(shí)時(shí)檢測(cè)，特異性強(qiáng)，靈敏度高，有助于惡性腫瘤的預(yù)防醫(yī)治，實(shí)現(xiàn)醫(yī)療裝置的便攜化、智能化。

附圖說明

為進(jìn)一步說明本發(fā)明的具體技術(shù)內(nèi)容，以下結(jié)合附圖詳細(xì)說明如下，其中：

圖1是本發(fā)明中用于檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物的gan基hemt核酸適配子傳感器的結(jié)構(gòu)示意圖；

圖2是本發(fā)明中柵區(qū)表面核酸適配子固定及捕獲癌胚抗原(cea)的過程示意圖。

圖3是本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例的cea核酸適配子傳感器檢測(cè)不同濃度的cea溶液時(shí)ids隨時(shí)間變化示意圖。

圖4是本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例的cea核酸適配子傳感器的i-v測(cè)試結(jié)果圖。

【附圖標(biāo)記說明】

1gan基hemt

2源極電極和漏極電極

3柵極電極

4電極引線pad

5氮化硅薄膜保護(hù)層

6核酸適配子單鏈

10襯底

11高阻半絕緣gan緩沖層

12高遷移率gan溝道層

13薄層aln插入層

14n型摻雜或非故意摻雜algan勢(shì)壘層

15gan蓋帽層

具體實(shí)施方式

為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合具體實(shí)施例，并參照附圖，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。

圖1是本發(fā)明中用于檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物的gan基hemt核酸適配子傳感器的一個(gè)實(shí)施例的結(jié)構(gòu)示意圖。如圖1所示，該實(shí)施例的傳感器包括gan基hemt1，該gan基hemt1上端面分布有柵極區(qū)域、源極區(qū)域和漏極區(qū)域，柵極區(qū)域位于源極區(qū)域和漏極區(qū)域之間，源極電極和漏極電極2，分別與所述gan基hemt上的源極區(qū)域和漏極區(qū)域形成歐姆接觸，柵極電極3，與所述gan基hemt上的柵極區(qū)域形成肖特基接觸，氮化硅薄膜保護(hù)層5，其位于所述源、漏電極和所述柵極電極的周邊及上側(cè)，僅露出與各電極接觸的區(qū)域，在所述柵極電極上固定有核酸適配子單鏈6，用于檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物。

該實(shí)施例中，gan基hemt包括襯底10，以及依次形成于襯底10上的高阻半絕緣gan緩沖層11，高遷移率gan溝道層12，薄層aln插入層13，n型摻雜或非故意摻雜algan勢(shì)壘層14，gan蓋帽層15。

該實(shí)施例中，gan基hemt上的源、漏電極是用磁控濺射法生長(zhǎng)的厚度約220nm的鈦鋁鈦金合金，并在880℃氮?dú)夥諊?0s快速退火形成歐姆接觸。氮化硅，二氧化硅或光刻膠用作器件保護(hù)層，防止水溶液等影響到器件檢測(cè)性能。電極引線pad4分別連接于源、漏電極，用于與外電路相連接，便于檢測(cè)電流信號(hào)變化。

所述柵極電極用來固定生物敏感膜，其材質(zhì)為ni/au薄膜、au薄膜和au納米顆粒之一，厚度為5nm-50nm，柵極區(qū)域面積為200μm²-1200μm²。

所述核酸適配子的分子通過共價(jià)鍵合法或非共價(jià)結(jié)合法在柵極電極上固定，能對(duì)腫瘤標(biāo)志物進(jìn)行高靈敏性及特異性識(shí)別，所述核酸適配子通過末端修飾的巰基官能團(tuán)在柵極電極表面形成au-s鍵，從而實(shí)現(xiàn)在傳感器柵極電極上的固定。

上述用于檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物的gan基hemt核酸適配子傳感器的制備方法包括：

步驟1：制備gan基hemt。

在該實(shí)施例中，采用金屬有機(jī)物汽相外延方法(mocvd)在藍(lán)寶石襯底上依次生長(zhǎng)高阻半絕緣gan緩沖層，高遷移率gan溝道層，薄層aln插入層，n型摻雜或非故意摻雜algan勢(shì)壘層，gan蓋帽層。

步驟2：在所述gan基hemt上制作源、漏電極。

在該實(shí)施例中，光刻曝光出歐姆接觸區(qū)域，利用磁控濺射工藝，在歐姆接觸區(qū)域?yàn)R射ti/al/ti/au，丙酮?jiǎng)冸x后在氮?dú)猸h(huán)境下退火30秒，退火溫度為880℃，形成源極和漏極。接著，利用光刻膠保護(hù)器件有源區(qū)，用icp干法刻蝕的方法刻蝕掉除有源區(qū)以外的區(qū)域，直至刻蝕到緩沖層，得到器件所在的有源區(qū)臺(tái)面。

步驟3：在所述gan基hemt的柵極區(qū)域制作柵金屬電極。

在該實(shí)施例中，利用磁控濺射工藝在柵極區(qū)域?yàn)R射au薄膜，薄膜厚度為5nm-50nm。

步驟4：利用磁控濺射工藝在所述gan基hemt上濺射ti/al/ti/au作為源漏電極、柵極電極的金屬引線pad。

步驟5：利用pecvd工藝沉積氮化硅薄膜用作保護(hù)層，并通過icp刻蝕僅露出與各電極接觸的區(qū)域窗口。

步驟6：在柵極電極上固定經(jīng)巰基修飾后的核酸適配子。

在該實(shí)施例中，首先要合成核酸適配子，即一段特定序列的核苷酸堿基序列(5’-hs-(ch2)6-ataccagcttattcaatt-3’)，其可以對(duì)癌胚抗原(cea)進(jìn)行特異性識(shí)別，在其末端修飾有巰基官能團(tuán)。取適量核酸適配子，溶解于te緩沖溶液(10mmoll^-1tris-hcl,1mmoll^-1edta,0.1moll^-1nacl,ph＝7.40)中，使得最終濃度為50μm，將配置好的核酸適配子溶液儲(chǔ)存于-20℃環(huán)境中。金電極表面經(jīng)piranha溶液(30％h2o2/70％濃h2so4)清洗處理后，將其浸沒在50μl核酸適配子溶液中，在常溫下過夜反應(yīng)(12小時(shí))，形成用于檢測(cè)cea的生物敏感膜，然后用上述te緩沖溶液沖洗，將電極表面未結(jié)合的物質(zhì)洗脫，接著將金電極浸泡在1mm巰基乙醇溶液中1h，以封閉可能殘余的活性位點(diǎn)，避免非特異性吸附，得到gan基hemt核酸適配子傳感器。

圖2是本發(fā)明中柵區(qū)表面核酸適配子固定及捕獲癌胚抗原(cea)的過程示意圖。如圖2所示，金電極表面在固定核酸適配子之后，進(jìn)一步用巰基乙醇(mch)來封閉活性位點(diǎn)，以及最后核酸適配子捕獲癌胚抗原(cea)的過程。

圖3是本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例的cea核酸適配子傳感器檢測(cè)不同濃度的cea溶液的ids隨時(shí)間變化示意圖。如圖3所示，在0.5v恒定偏壓下，當(dāng)向傳感區(qū)域分別滴加0.5pg/ml和5pg/ml的抗原溶液時(shí)，漏電流并沒有發(fā)生明顯的改變，當(dāng)?shù)渭?0pg/ml的抗原溶液時(shí)，電流有了很明顯的上升，增長(zhǎng)值約為11.5μa。此測(cè)試結(jié)果圖證明了gan基hemt傳感器與核酸適配子結(jié)合是可以對(duì)一些腫瘤標(biāo)志物進(jìn)行檢測(cè)的，且檢測(cè)極限濃度已達(dá)pg/ml量級(jí)。

圖4是本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例的cea核酸適配子傳感器的i-v測(cè)試結(jié)果圖。如圖4所示，在0-7v源漏電壓范圍內(nèi)，分別測(cè)試了gan基hemt傳感器在柵極固定核酸適配子前后，以及檢測(cè)不同濃度的cea溶液時(shí)漏電流的變化情況。固定核酸適配子之后，傳感器的漏電流有了很明顯的上升，向傳感區(qū)域分別滴加濃度范圍為50pg/ml-5ng/ml的cea溶液，飽和電流隨著濃度的增加而單調(diào)上升。在漏電壓2.5v處，柵區(qū)固定核酸適配子之后，漏電流上升了500μa，當(dāng)?shù)渭?0pg/ml的cea溶液時(shí)，電流上升了300μa，當(dāng)?shù)渭訚舛葹?0ng/ml的抗原溶液時(shí)，飽和電流不再有明顯改變。圖4中，自下至上依次為柵區(qū)未固定核酸適配子(hemt)、固定cea核酸適配子(modifiedceaaptamer)、滴加50pg/ml的cea溶液、滴加500pg/ml的cea溶液、滴加5ng/ml的cea溶液和滴加50ng/ml的cea溶液各情形下的器件的i-v曲線。

經(jīng)過實(shí)踐驗(yàn)證，本發(fā)明的技術(shù)方案可適用于癌胚抗原(cea)，癌抗原19-9(ca19-9)，癌抗原125(ca125)，甲胎蛋白(afp)，醛縮酶，癌胚鐵蛋白，鐵蛋白(sf)，前列腺特異抗原(psa)，神經(jīng)元特異性烯醇化酶(nse)，鱗狀上皮細(xì)胞癌抗原(scc)等腫瘤標(biāo)志物生物傳感器的研制。

以上所述的具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益效果進(jìn)行了進(jìn)一步詳細(xì)說明，應(yīng)理解的是，以上所述僅為本發(fā)明的具體實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所做的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。