本發(fā)明涉及光學(xué)顯微領(lǐng)域，特別是一種分析更為簡單而精確的、能夠測量擴散系數(shù)的一種研究分子遷移運動的裝置。

背景技術(shù)：

光脫色又稱光漂白，是指在光的照射下熒光物質(zhì)所激發(fā)出來的熒光強度隨著時間推移逐步減弱乃至消失的現(xiàn)象。熒光成像的質(zhì)量很大程度上依賴于熒光信號強度，提高激發(fā)光強度可以提高信號強度，但當(dāng)激發(fā)光的強度超過一定限度時，光吸收就趨于飽和，并不可逆地破壞激發(fā)態(tài)分子，這就是光漂白現(xiàn)象。熒光漂白后恢復(fù)技術(shù)是使用親脂性或親水性的熒光分子，如熒光素、綠色熒光蛋白等與蛋白或脂質(zhì)耦聯(lián)，用于檢測所標記分子在活體細胞表面或細胞內(nèi)部運動及其遷移速率。熒光漂白后的恢復(fù)技術(shù)的原理是：利用高能激光照射細胞的某一特定區(qū)域，使該區(qū)域內(nèi)標記的熒光分子不可逆的淬滅，這一區(qū)域稱熒光漂白區(qū)。隨后，由于細胞質(zhì)中的脂質(zhì)分子或蛋白質(zhì)分子的運動，周圍非漂白區(qū)熒光分子不斷向光漂白區(qū)遷移，結(jié)果使熒光漂白區(qū)的熒光強度逐漸地回復(fù)到原有水平，在此基礎(chǔ)上迫切需要一種具有能夠用于測量擴散系數(shù)的裝置及方法。

傳統(tǒng)的使用光漂白后熒光恢復(fù)的方法來研究分子遷移擴散等運動的技術(shù)具有的缺陷有：為了達到實驗中光信號采集的需求，熒光分子的密度需要很高；光束輪廓的測量需要非常精確；光漂白過程的監(jiān)控不容易達到，從而需要較高的光強進行光漂白，這樣有可能會破壞樣品分子的結(jié)構(gòu)，特別是一些生物樣品分子。所述一種研究分子遷移運動的裝置使用平面的光斑對樣品進行光漂白及隨后的監(jiān)控探測，解決了上述缺陷。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了解決上述問題，本發(fā)明裝置使得在樣品表面產(chǎn)生明暗相間的條紋狀的光斑區(qū)域，在亮條紋區(qū)域用強光進行光漂白后，繼續(xù)保持較低強度光照，來探測明暗條紋之間的對比度隨時間的變化，并通過后續(xù)分析來得到待測分子的擴散系數(shù)等信息，布朗擴散系數(shù)可以獨立地得到，其是整個光斑圖案區(qū)域的平均值。

本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：

所述一種研究分子遷移運動的裝置主要包括激光器、起偏器、普克爾盒、檢偏器、分光器、樣品、位移臺、平面鏡、光纖、濾光片、光電倍增管、鎖相放大器、電纜，所述鎖相放大器通過電纜分別連接所述普克爾盒和所述位移臺，所述樣品表面的光能經(jīng)過所述光纖以及所述濾光片傳輸?shù)剿龉怆姳对龉苤?，所述普克爾盒能夠使激光產(chǎn)生一個小于1秒的極短的滿強度的脈沖，所述光電倍增管能收集光漂白后由于分子擴散運動而新出現(xiàn)的熒光信號，然后通過所述鎖相放大器進行分析，從而得到所述樣品表面亮條紋部分與暗條紋部分的熒光強度之平均對比度c(t)。

所述激光器、起偏器、普克爾盒、檢偏器、分光器、樣品同線，能夠使得所述激光器發(fā)射的激光束經(jīng)過所述起偏器、普克爾盒、檢偏器后由所述分光器分為兩束激光，一束激光經(jīng)過距離l直接照射于所述樣品表面，另一束激光經(jīng)過距離a后到達所述平面鏡，經(jīng)過所述平面鏡反射后照射于所述樣品表面，上述照射于所述樣品表面的兩束激光呈θ角，能夠在所述樣品表面處產(chǎn)生光的干涉圖案，所述距離a和l可調(diào)，從而能夠通過改變所述角θ的值改變所述樣品表面干涉條紋間距i；所述位移臺上連接有所述平面鏡、且能夠?qū)λ銎矫骁R進行位置調(diào)制，使得所述平面鏡沿其法向方向以頻率800hz進行正弦振動，從而改變所述樣品表面處干涉條紋位置。

采用本發(fā)明裝置進行研究的方法步驟為：

一.所述激光器發(fā)射的激光束經(jīng)過所述起偏器、普克爾盒、檢偏器后，由所述分光器分為兩束激光，一束激光經(jīng)過距離l直接照射于所述樣品表面，另一束激光經(jīng)過距離a后到達所述平面鏡，經(jīng)過所述平面鏡反射后照射于所述樣品表面，上述照射于所述樣品表面的兩束激光呈θ角，從而在所述樣品表面處產(chǎn)生光的干涉圖案；

二.通過調(diào)節(jié)所述距離a和l的長度，能夠改變所述角θ的值，從而改變所述樣品表面干涉條紋間距i；

三.通過所述普克爾盒使激光產(chǎn)生一個小于1秒的極短的滿強度的脈沖，對亮條紋處的熒光標記的相應(yīng)種類的分子進行光脫色，在光脫色過程結(jié)束后，所述激光器連續(xù)發(fā)射光強為i(r，t)的激光以探測所述樣品表面的熒光變化；

四.通過所述位移臺對所述平面鏡進行位置調(diào)制，使得所述平面鏡沿其法向方向以頻率800hz進行正弦振動，從而改變所述樣品表面處干涉條紋位置；

五.所述光電倍增管收集光漂白后由于分子擴散運動而新出現(xiàn)的熒光信號，然后通過所述鎖相放大器進行分析，從而得到樣品表面亮條紋部分與暗條紋部分的熒光強度之比，即平均對比度c(t)，所述光電倍增管測得的熒光信號f(t)與被熒光標記的分子的濃度cm(r，t)和探測光強i(r，t)相關(guān)

其中和是cm(r，t)和i(r，t)的空間傅里葉變換，f(t)可以分解為調(diào)制頻率的諧波級數(shù)，實驗中，一階和二階的諧波分量f1(t)和f2(t)可以通過所述鎖相放大器同時得到；

六.最終的實驗數(shù)據(jù)給出暗條紋與亮條紋之間的平均對比度上式用一個指數(shù)衰減來表征布朗擴散行為；

七.由能夠求出弛豫時間τq，由弛豫時間τq與擴散系數(shù)d的關(guān)系q為條紋圖案的空間周期，能夠求出擴散系數(shù)d。

所述樣品表面可加上一個有圓形開口的光掩膜，所述樣品表面的測量區(qū)域位于所述開口內(nèi)，光掩膜的材料對光的反射率很小，以能減小由于激光光斑造成的所述樣品表面非測量區(qū)域的雜散光對實驗信噪比的影響；可以使用不同的激光波長488nm、532nm、633nm等來進行實驗，并綜合比較各激光波長條件實驗得到的結(jié)果，以能夠更準確地反映分子的遷移運動；對生物大分子樣品，光漂白時激光光強小于250w/cm²，且脈沖時間小于400ms。

普克爾盒是一種電光器件，它包含一個由光通過的電光晶體，基于普克耳斯效應(yīng)，能夠通過施加到晶體上的電壓來調(diào)控光的偏振方向以及改變光通過晶體后的位相延遲。

由于分子的擴散作用，所述對比度c(t)隨時間減小，使用同一個條紋圖案來對樣品進行光脫色以及探測并收集信號保證了它們由同樣的波長來表征。所述鎖相放大器中探測的熒光強度的基頻的成分隨時間改變，并滿足單模的擴散方程，且對比度c(t)按照簡單的指數(shù)衰減其中弛豫時間τq與擴散系數(shù)d有關(guān)q為條紋圖案的空間周期，這樣，通過改變q，能夠檢驗布朗擴散法則并精確地決定運動分子的擴散系數(shù)。常數(shù)c0、c1與運動分子和不運動分子之間的相對分數(shù)和有關(guān)。

在含有n種不同運動種群的復(fù)雜樣品的情況，可以推廣為

第k種種群的擴散系數(shù)和分數(shù)分別為

本發(fā)明的有益效果是：

本發(fā)明分析更為簡單且精確，更易于探測擴散系數(shù)的較小變化，或是鑒別不同種群之間的區(qū)別；對樣品進行光脫色以及探測并收集信號中使用的周期性正弦圖案可以用于探測一個單模的擴散方程，光脫色的圖案可以是一個更為復(fù)雜的圖形，通常為高斯光斑；另外，本發(fā)明裝置可以更容易地更改干涉條紋的參數(shù)，以在倒易空間直接檢驗擴散法則的真實性，該裝置讀取及光脫色同樣的圖案，能夠應(yīng)用于聚合物在界面的擴散的研究、dna擴散以及電泳等領(lǐng)域。

附圖說明

下面結(jié)合本發(fā)明的圖形進一步說明：

圖1是本發(fā)明示意圖。

圖中，1.激光器，2.起偏器，3.普克爾盒，4.檢偏器，5.分光器，6.樣品，7.位移臺，8.平面鏡，9.光纖，10.濾光片，11.光電倍增管，12.鎖相放大器，13.電纜。

具體實施方式

如圖1是本發(fā)明示意圖，所述一種研究分子遷移運動的裝置主要包括激光器1、起偏器2、普克爾盒3、檢偏器4、分光器5、樣品6、位移臺7、平面鏡8、光纖9、濾光片10、光電倍增管11、鎖相放大器12、電纜13，所述鎖相放大器12通過電纜13分別連接所述普克爾盒3和所述位移臺7，所述樣品6表面的光能經(jīng)過所述光纖9以及所述濾光片10傳輸?shù)剿龉怆姳对龉?1中，所述普克爾盒3能夠使激光產(chǎn)生一個小于1秒的極短的滿強度的脈沖，所述光電倍增管11能收集光漂白后由于分子擴散運動而新出現(xiàn)的熒光信號，然后通過所述鎖相放大器12進行分析，從而得到所述樣品6表面亮條紋部分與暗條紋部分的熒光強度之平均對比度c(t)。

所述激光器1、起偏器2、普克爾盒3、檢偏器4、分光器5、樣品6同線，能夠使得所述激光器1發(fā)射的激光束經(jīng)過所述起偏器2、普克爾盒3、檢偏器4后由所述分光器5分為兩束激光，一束激光經(jīng)過距離l直接照射于所述樣品6表面，另一束激光經(jīng)過距離a后到達所述平面鏡8，經(jīng)過所述平面鏡8反射后照射于所述樣品6表面，上述照射于所述樣品6表面的兩束激光呈θ角，能夠在所述樣品6表面處產(chǎn)生光的干涉圖案，所述距離a和l可調(diào)，從而能夠通過改變所述角θ的值改變所述樣品6表面干涉條紋間距i；所述位移臺7上連接有所述平面鏡8、且能夠?qū)λ銎矫骁R8進行位置調(diào)制，使得所述平面鏡8沿其法向方向以頻率800hz進行正弦振動，從而改變所述樣品6表面處干涉條紋位置。