本發(fā)明涉及民族藥材質(zhì)量控制領(lǐng)域，具體涉及朝藥腎炎草指紋圖譜的建立方法及其指紋圖譜。

背景技術(shù)：

我國的民族醫(yī)藥之一的朝醫(yī)藥是我國歷史文化遺產(chǎn)的瑰寶，是在延邊這一特殊的地理環(huán)境下，朝鮮族醫(yī)學(xué)家在掌握古朝鮮東醫(yī)學(xué)理論和技術(shù)基礎(chǔ)上，在長期的與疾病作斗爭(zhēng)的過程中形成和發(fā)展的既區(qū)別于朝鮮東醫(yī)學(xué)又不同于中醫(yī)學(xué)的較完整的醫(yī)學(xué)體系。它豐富了中華民族的醫(yī)藥學(xué)寶庫，為民族藥新藥研究提供了一個(gè)巨大的資源庫。朝藥的研究與開發(fā)在我國醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展中具有明顯的區(qū)域特色和代表性。

民族藥的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)是民族藥產(chǎn)品核心競(jìng)爭(zhēng)力的基本要素，是發(fā)展民族藥產(chǎn)業(yè)的重要技術(shù)保證。在國家中醫(yī)藥管理局等大力支持下，近年來朝藥的理論、物質(zhì)基礎(chǔ)、臨床應(yīng)用等方面取得了很大的成果，但在品種的整理和質(zhì)量控制上仍然存在嚴(yán)重的標(biāo)準(zhǔn)缺失，制約了朝藥的發(fā)展。制訂全面、系統(tǒng)、科學(xué)合理的朝藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，不僅推進(jìn)朝藥生產(chǎn)的規(guī)范化、標(biāo)準(zhǔn)化、現(xiàn)代化產(chǎn)生積極而深遠(yuǎn)的影響，對(duì)控制朝藥質(zhì)量，保證臨床用藥的安全有效有著極其重要的意義。

朝藥腎炎草是石竹科植物光萼女婁菜(melandriumfirmumrohrb.)及其變型疏毛女婁菜(melandriumpubescensmakino.)的干燥地上部分，廣泛分布于長白山地區(qū)，植物資源豐富，也有大量栽培。朝藥腎炎草為朝醫(yī)學(xué)中少陽人要藥，在《東醫(yī)寶鑒》、《朝醫(yī)學(xué)》、《朝鮮藥典》、《實(shí)用東藥學(xué)》、《中國民族藥志》、《朝藥志》等民族藥古書籍文獻(xiàn)中均有記載，并且具有清熱解毒，活血利尿、止血調(diào)經(jīng)，祛風(fēng)止痛等功效，用于急、慢性腎炎、尿路感染，月經(jīng)不調(diào)，關(guān)節(jié)炎，子宮出血等疾病。

目前為止，國內(nèi)外對(duì)該民族藥的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究尚未見任何報(bào)道，故對(duì)其進(jìn)行高效液相(hplc)指紋圖譜研究，彌補(bǔ)腎炎草質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)下的空白，為全面建立腎炎草的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供科學(xué)依據(jù)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明設(shè)計(jì)開發(fā)了朝藥腎炎草指紋圖譜的建立方法，本發(fā)明的發(fā)明目的是通過朝藥腎炎草高效液相指紋圖譜的建立方法，能夠?yàn)槌幠I炎草的鑒別和質(zhì)量控制提供可靠依據(jù)。

本發(fā)明設(shè)計(jì)開發(fā)了朝藥腎炎草指紋圖譜的建立方法得到的指紋圖譜，本發(fā)明的發(fā)明目的是通過得到的朝藥腎炎草高效液相指紋圖譜，能夠?yàn)槌幠I炎草的鑒別和質(zhì)量控制提供可靠依據(jù)。

本發(fā)明提供的技術(shù)方案為：

朝藥腎炎草指紋圖譜的建立方法，包括如下步驟：

取夏佛塔苷、葒草苷、牡荊素對(duì)照品，加甲醇溶解，定容，作為對(duì)照品溶液；

取腎炎草藥材，用乙醇溶液提取，定容，作為供試品溶液；

經(jīng)高效液相分離檢測(cè)，以體積分?jǐn)?shù)0.4％乙酸溶液為a相，體積分?jǐn)?shù)100％乙腈溶液為b相，組成流動(dòng)相，采用梯度洗脫，以相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積標(biāo)定指紋特征，從而得到所述指紋圖譜。

優(yōu)選的是，所述高效液相分離檢測(cè)條件為：采用色譜柱以十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相，柱溫為50℃，檢測(cè)波長為253nm，流速為1ml/min，分析時(shí)間為70min，采用進(jìn)樣量為10μl注入高效液相色譜儀。

優(yōu)選的是，所述梯度洗脫的洗脫程序如下：

0分鐘時(shí)，流動(dòng)相a為90％的乙酸溶液，流動(dòng)相b為10％的乙腈溶液；

35分鐘時(shí)，流動(dòng)相a為75％的乙酸溶液，流動(dòng)相b為25％的乙腈溶液；

50分鐘時(shí)，流動(dòng)相a為70％的乙酸溶液，流動(dòng)相b為30％的乙腈溶液；

60分鐘時(shí)，流動(dòng)相a為60％的乙酸溶液，流動(dòng)相b為40％的乙腈溶液；

70分鐘時(shí)，流動(dòng)相a為10％的甲醇溶液，流動(dòng)相b為90％的乙腈溶液；

柱溫為50℃；流速：1ml/min；進(jìn)樣量：10μl。

優(yōu)選的是，朝藥腎炎草供試品溶液的制備工藝包括：取腎炎草藥材粉末1.0g，精密稱定，置25ml的容量瓶中加入70％乙醇溶液，稱定初始重量，室溫下超聲lh，冷卻至室溫，用乙醇溶液補(bǔ)足減失重量，搖勻，用0.45μm微孔濾膜過濾，即得供試品。

優(yōu)選的是，對(duì)照品溶液的制備工藝包括：精密稱定夏佛塔苷、葒草苷、牡荊素對(duì)照品，分別稱取5mg，5mg，2mg依次置于10ml、25ml、10ml容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，定容，制成濃度分別為500ppm，200ppm，200ppm的溶液，經(jīng)0.45μm微孔濾膜濾過，即得對(duì)照品溶液備用。

優(yōu)選的是，所述指紋圖譜共有21個(gè)共有指紋峰，相對(duì)保留時(shí)間分別為：

1號(hào)峰：0.281；2號(hào)峰：0.368；3號(hào)峰：0.444；4號(hào)峰：0.603；5號(hào)峰：0.824；6號(hào)峰為參照峰：1.000；7號(hào)峰：1.053；8號(hào)峰：1.079；9號(hào)峰：1.150；10號(hào)峰：1.185；11號(hào)峰：1.206；12號(hào)峰：1.225；13號(hào)峰：1.271；14號(hào)峰：1.332；15號(hào)峰：1.362；16號(hào)峰：1.380；17號(hào)峰：1.413；18號(hào)峰：1.498；19號(hào)峰：1.559；20號(hào)峰：1.741；21號(hào)峰：1.768。

優(yōu)選的是，所述指紋圖譜共有21個(gè)共有指紋峰，相對(duì)峰面積分別為：

1號(hào)峰：0.662；2號(hào)峰：0.744；3號(hào)峰：0.303；4號(hào)峰：0.092；5號(hào)峰：0.242；6號(hào)峰為參照峰：1.000；7號(hào)峰：0.152；8號(hào)峰：0.061；9號(hào)峰：0.398；10號(hào)峰：1.015；11號(hào)峰：0.136；12號(hào)峰：0.370；13號(hào)峰：1.671；14號(hào)峰：0.547；15號(hào)峰：0.189；16號(hào)峰：0.318；17號(hào)峰：0.133；18號(hào)峰：0.177；19號(hào)峰：0.107；20號(hào)峰：0.159；21號(hào)峰：1.907。

朝藥腎炎草指紋圖譜的建立方法得到的指紋圖譜，將朝藥腎炎草制備成乙醇溶液后，經(jīng)過高效液相分離檢測(cè)，獲得所述朝藥腎炎草的指紋圖譜。

優(yōu)選的是，所述高效液相分離檢測(cè)條件為：采用色譜柱以十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相，以體積分?jǐn)?shù)0.4％乙酸溶液為a相，體積分?jǐn)?shù)100％乙腈溶液為b相，組成流動(dòng)相，采用梯度洗脫，柱溫為50℃，檢測(cè)波長為253nm，流速為1ml/min，分析時(shí)間為70min，采用進(jìn)樣量為10μl注入高效液相色譜儀；以及

所述梯度洗脫的洗脫程序如下：

0分鐘時(shí)，流動(dòng)相a為90％的乙酸溶液，流動(dòng)相b為10％的乙腈溶液；

35分鐘時(shí)，流動(dòng)相a為75％的乙酸溶液，流動(dòng)相b為25％的乙腈溶液；

50分鐘時(shí)，流動(dòng)相a為70％的乙酸溶液，流動(dòng)相b為30％的乙腈溶液；

60分鐘時(shí)，流動(dòng)相a為60％的乙酸溶液，流動(dòng)相b為40％的乙腈溶液；

70分鐘時(shí)，流動(dòng)相a為10％的甲醇溶液，流動(dòng)相b為90％的乙腈溶液。

優(yōu)選的是，所述指紋圖譜共有21個(gè)共有指紋峰；

所述共有指紋峰的相對(duì)保留時(shí)間分別為：1號(hào)峰：0.281；2號(hào)峰：0.368；3號(hào)峰：0.444；4號(hào)峰：0.603；5號(hào)峰：0.824；6號(hào)峰為參照峰：1.000；7號(hào)峰：1.053；8號(hào)峰：1.079；9號(hào)峰：1.150；10號(hào)峰：1.185；11號(hào)峰：1.206；12號(hào)峰：1.225；13號(hào)峰：1.271；14號(hào)峰：1.332；15號(hào)峰：1.362；16號(hào)峰：1.380；17號(hào)峰：1.413；18號(hào)峰：1.498；19號(hào)峰：1.559；20號(hào)峰：1.741；21號(hào)峰：1.768；

所述共有指紋峰的相對(duì)峰面積分別為：1號(hào)峰：0.662；2號(hào)峰：0.744；3號(hào)峰：0.303；4號(hào)峰：0.092；5號(hào)峰：0.242；6號(hào)峰為參照峰：1.000；7號(hào)峰：0.152；8號(hào)峰：0.061；9號(hào)峰：0.398；10號(hào)峰：1.015；11號(hào)峰：0.136；12號(hào)峰：0.370；13號(hào)峰：1.671；14號(hào)峰：0.547；15號(hào)峰：0.189；16號(hào)峰：0.318；17號(hào)峰：0.133；18號(hào)峰：0.177；19號(hào)峰：0.107；20號(hào)峰：0.159；21號(hào)峰：1.907。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比較所具有的有益效果：本發(fā)明依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)藥材和延邊不同產(chǎn)地9批供試品檢測(cè)結(jié)果，選擇了其保留時(shí)間和峰面積穩(wěn)定的21個(gè)共有峰標(biāo)定為腎炎草化學(xué)成分的指紋圖譜，且共有峰峰面積大于總峰面積的90％，非共有峰峰面積小于總峰面積的10％，表明具有良好的系統(tǒng)性、特征性和重復(fù)性。經(jīng)過相似度評(píng)價(jià)，所選擇的延邊不同縣市腎炎草指紋圖譜相似度基本都大于0.90，具有良好的相關(guān)性，完成了延邊地產(chǎn)腎炎草藥材指紋圖譜的建立。該方法可靠，簡(jiǎn)便，可作為腎炎草的鑒定與質(zhì)量控制的有效方法。

附圖說明

圖1為dad檢測(cè)器不同波長下腎炎草的高效液相色譜圖。

圖2為對(duì)照品供試液的高效液相色譜圖。

圖3為朝藥腎炎草標(biāo)準(zhǔn)藥材溶液的高效液相色譜圖。

圖4為10批朝藥腎炎草的高效液相指紋圖譜；其中，r：共有圖譜；s1：標(biāo)準(zhǔn)藥材；s2：龍井市；s3：汪清縣；s4：安圖縣；s5：琿春市；s6：圖們市；s7：敦化市；s8：延吉市1；s9：延吉市2；s10：和龍縣。

圖5為朝藥腎炎草共有峰指紋圖譜。

圖6為朝藥腎炎草精密度實(shí)驗(yàn)高效液相色圖譜。

圖7為朝藥腎炎草重復(fù)性實(shí)驗(yàn)高效液相色圖譜。

圖8為朝藥腎炎草穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)高效液相色圖譜。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說明，以令本領(lǐng)域技術(shù)人員參照說明書文字能夠據(jù)以實(shí)施。

如圖1～8所示，本發(fā)明提供朝藥腎炎草指紋圖譜的建立方法，包括如下步驟：

取夏佛塔苷、葒草苷、牡荊素對(duì)照品，加甲醇溶解，定容，作為對(duì)照品溶液；

取腎炎草藥材，用乙醇溶液提取，定容，作為供試品溶液；

經(jīng)高效液相分離檢測(cè)，以體積分?jǐn)?shù)0.4％乙酸溶液為a相，體積分?jǐn)?shù)100％乙腈溶液為b相，組成流動(dòng)相，采用梯度洗脫，以相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積標(biāo)定指紋特征，從而得到所述指紋圖譜。

在另一種實(shí)施例中，高效液相分離檢測(cè)條件為：采用色譜柱以十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相，柱溫為50℃，檢測(cè)波長為253nm，流速為1ml/min，分析時(shí)間為70min，采用進(jìn)樣量為10μl注入高效液相色譜儀。

在另一種實(shí)施例中，梯度洗脫的洗脫程序如下：

0分鐘時(shí)，流動(dòng)相a為90％的乙酸溶液，流動(dòng)相b為10％的乙腈溶液；

35分鐘時(shí)，流動(dòng)相a為75％的乙酸溶液，流動(dòng)相b為25％的乙腈溶液；

50分鐘時(shí)，流動(dòng)相a為70％的乙酸溶液，流動(dòng)相b為30％的乙腈溶液；

60分鐘時(shí)，流動(dòng)相a為60％的乙酸溶液，流動(dòng)相b為40％的乙腈溶液；

70分鐘時(shí)，流動(dòng)相a為10％的甲醇溶液，流動(dòng)相b為90％的乙腈溶液；

所述柱溫為50℃；所述流速：1ml/min；所述進(jìn)樣量：10μl。

在另一種實(shí)施例中，朝藥腎炎草供試品溶液的制備工藝包括：取腎炎草標(biāo)準(zhǔn)藥材粉末1.0g，精密稱定，置25ml的容量瓶中加入70％乙醇溶液，稱定初始重量，室溫下超聲lh，冷卻至室溫，用乙醇溶液補(bǔ)足減失重量，搖勻，用0.45μm微孔濾膜過濾，即得供試品。

在另一種實(shí)施例中，對(duì)照品溶液的制備工藝包括：精密稱定夏佛塔苷、葒草苷、牡荊素對(duì)照品，分別稱取5mg，5mg，2mg依次置于10ml、25ml、10ml容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，定容，制成濃度分別為500ppm，200ppm，200ppm的溶液，經(jīng)0.45μm微孔濾膜濾過，即得對(duì)照品溶液備用。

在另一種實(shí)施例中，指紋圖譜共有21個(gè)共有指紋峰，相對(duì)保留時(shí)間分別為：1號(hào)峰：0.281；2號(hào)峰：0.368；3號(hào)峰：0.444；4號(hào)峰：0.603；5號(hào)峰：0.824；6號(hào)峰為參照峰：1.000；7號(hào)峰：1.053；8號(hào)峰：1.079；9號(hào)峰：1.150；10號(hào)峰：1.185；11號(hào)峰：1.206；12號(hào)峰：1.225；13號(hào)峰：1.271；14號(hào)峰：1.332；15號(hào)峰：1.362；16號(hào)峰：1.380；17號(hào)峰：1.413；18號(hào)峰：1.498；19號(hào)峰：1.559；20號(hào)峰：1.741；21號(hào)峰：1.768；相對(duì)峰面積分別為：1號(hào)峰：0.662；2號(hào)峰：0.744；3號(hào)峰：0.303；4號(hào)峰：0.092；5號(hào)峰：0.242；6號(hào)峰為參照峰：1.000；7號(hào)峰：0.152；8號(hào)峰：0.061；9號(hào)峰：0.398；10號(hào)峰：1.015；11號(hào)峰：0.136；12號(hào)峰：0.370；13號(hào)峰：1.671；14號(hào)峰：0.547；15號(hào)峰：0.189；16號(hào)峰：0.318；17號(hào)峰：0.133；18號(hào)峰：0.177；19號(hào)峰：0.107；20號(hào)峰：0.159；21號(hào)峰：1.907。

本發(fā)明還提供了朝藥腎炎草指紋圖譜的建立方法得到的指紋圖譜，將朝藥腎炎草制備成乙醇溶液后，經(jīng)過高效液相分離檢測(cè)，獲得所述朝藥腎炎草的指紋圖譜。

在另一種實(shí)施例中，所述高效液相分離檢測(cè)條件為：采用色譜柱以十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相，以體積分?jǐn)?shù)0.4％乙酸溶液為a相，體積分?jǐn)?shù)100％乙腈溶液為b相，組成流動(dòng)相，采用梯度洗脫，柱溫為50℃，檢測(cè)波長為253nm，流速為1ml/min，分析時(shí)間為70min，采用進(jìn)樣量為10μl注入高效液相色譜儀；梯度洗脫的洗脫程序如下：

0分鐘時(shí)，流動(dòng)相a為90％的乙酸溶液，流動(dòng)相b為10％的乙腈溶液；

35分鐘時(shí)，流動(dòng)相a為75％的乙酸溶液，流動(dòng)相b為25％的乙腈溶液；

50分鐘時(shí)，流動(dòng)相a為70％的乙酸溶液，流動(dòng)相b為30％的乙腈溶液；

60分鐘時(shí)，流動(dòng)相a為60％的乙酸溶液，流動(dòng)相b為40％的乙腈溶液；

70分鐘時(shí)，流動(dòng)相a為10％的甲醇溶液，流動(dòng)相b為90％的乙腈溶液。

在另一種實(shí)施例中，指紋圖譜共有21個(gè)共有指紋峰；

所述共有指紋峰的相對(duì)保留時(shí)間分別為：1號(hào)峰：0.281；2號(hào)峰：0.368；3號(hào)峰：0.444；4號(hào)峰：0.603；5號(hào)峰：0.824；6號(hào)峰為參照峰：1.000；7號(hào)峰：1.053；8號(hào)峰：1.079；9號(hào)峰：1.150；10號(hào)峰：1.185；11號(hào)峰：1.206；12號(hào)峰：1.225；13號(hào)峰：1.271；14號(hào)峰：1.332；15號(hào)峰：1.362；16號(hào)峰：1.380；17號(hào)峰：1.413；18號(hào)峰：1.498；19號(hào)峰：1.559；20號(hào)峰：1.741；21號(hào)峰：1.768；共有指紋峰的相對(duì)峰面積分別為：1號(hào)峰：0.662；2號(hào)峰：0.744；3號(hào)峰：0.303；4號(hào)峰：0.092；5號(hào)峰：0.242；6號(hào)峰為參照峰：1.000；7號(hào)峰：0.152；8號(hào)峰：0.061；9號(hào)峰：0.398；10號(hào)峰：1.015；11號(hào)峰：0.136；12號(hào)峰：0.370；13號(hào)峰：1.671；14號(hào)峰：0.547；15號(hào)峰：0.189；16號(hào)峰：0.318；17號(hào)峰：0.133；18號(hào)峰：0.177；19號(hào)峰：0.107；20號(hào)峰：0.159；21號(hào)峰：1.907。

1、材料

1.1供試品藥材

標(biāo)準(zhǔn)藥材(s1)：由延邊民族醫(yī)藥研究所提供；s2：龍井市；s3：汪清縣；s4：安圖縣；s5：琿春市；s6：圖們市；s7：敦化市；s8：延吉市1；s9：延吉市2；s10：和龍縣。

1.2對(duì)照品

夏佛塔苷對(duì)照品(51938-32-0，上海融禾醫(yī)藥科技有限公司)，葒草苷對(duì)照品(28608-75-5，上海融禾醫(yī)藥科技有限公司)，牡荊素對(duì)照品(3681-93-4，上海融禾醫(yī)藥科技有限公司)。

1.3試劑

乙腈(色譜級(jí)，fisherscientific，美國)，甲醇(色譜級(jí)，fisherscientific，美國)，乙醇(分析純，遼寧泉瑞試劑有限公司)，甲醇(分析純，遼寧泉瑞試劑有限公司)，甲酸(分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)，三氟乙酸(色譜級(jí)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)，乙酸(冰乙酸，分析純，公主嶺市化學(xué)試劑廠)，蒸餾水、超純水(延邊大學(xué)自制)。

1.4儀器

cp214型電子分析天平(奧豪斯儀器(常州)有限公司)，抽濾真空裝置(上海昕滬實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)，移液槍(100μl，河南兄弟儀器設(shè)備有限公司)，移液槍(200μl，法國)，hitachi高效液相色譜儀(日本日立公司)，primaide-1410紫外檢測(cè)器(日本日立公司)，primaide-5430二級(jí)陣列管(dad)檢測(cè)器(日本日立公司)，工作站:primaide色譜工作站(日本日立公司)。

2、方法與結(jié)果

2.1色譜條件

2.1.1檢測(cè)波長的選擇

如圖1所示，為了在指紋圖譜中獲得最豐富的腎炎草化學(xué)成分信息，利用二極管陣列檢測(cè)器(dad)檢測(cè)器對(duì)200～400nm范圍內(nèi)進(jìn)行全波段掃描。結(jié)果顯示在253nm下指紋圖譜的色譜峰數(shù)目最多，代表的化學(xué)成分信息量最大，峰的分離度也較好，所以最終確定253nm為檢測(cè)波長，如圖1所示。

2.1.2流動(dòng)相的選擇

分別以乙腈-水和甲醇-水系統(tǒng)為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，結(jié)果顯示乙腈-水溶劑系統(tǒng)洗脫所得的譜圖效果更好，但分離度仍然不夠理想，為了改善其峰形，嘗試了在水相中添加甲酸、乙酸和三氟乙酸溶液來改善分離度。結(jié)果顯示0.4％乙酸溶液作為流動(dòng)相中的水相時(shí)峰形最好，所以選取乙腈-0.4％乙酸溶液作為流動(dòng)相洗脫時(shí)間程序如表1所示。

表1.流動(dòng)相洗脫系統(tǒng)

2.1.3實(shí)驗(yàn)條件的確定

色譜柱為sunfirec18(5μm，4.6×250mm)；流動(dòng)相溶劑系統(tǒng)中b為乙腈溶液(acn)，a為0.4％乙酸溶液(hac)(a+b＝100％)；流速1ml/min；柱溫50℃；檢測(cè)波長253nm；進(jìn)樣量10μl；色譜記錄時(shí)間為70min，表2所示。

表2.hplc的色譜條件

2.2樣品溶液制備

2.2.1對(duì)照品溶液的制備

精密稱定夏佛塔苷、葒草苷、牡荊素對(duì)照品，分別為5mg，5mg，2mg依次置于10ml、25ml、10ml容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，定容，制成濃度分別為500ppm，200ppm，200ppm的溶液，經(jīng)0.45μm微孔濾膜濾過，備用。

2.2.2供試品溶液的制備

取腎炎草藥材和9批供試品藥材粉末約1.0g，精密稱定，置25ml的容量瓶中加入70％乙醇溶液，稱定初始重量，室溫下超聲l小時(shí)，冷卻至室溫，用乙醇溶液補(bǔ)足減失重量，搖勻，用0.45μm微孔濾膜過濾，即得供試品。

2.3朝藥腎炎草指紋圖譜建立

如圖2、圖3所示，依以上色譜條件，對(duì)1～10批供試品進(jìn)樣分析，確定了分離度大于1.0的共有峰21個(gè)，對(duì)照品混合液的圖譜通過保留時(shí)間定性可知，標(biāo)準(zhǔn)藥材中峰6，7，10分別為夏佛塔苷，葒草苷和牡荊素的色譜峰；其中，夏佛塔苷的色譜峰(峰6)含量較高，且保留時(shí)間穩(wěn)定，將其作為參照峰；10批腎炎草21個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積如表3，表4所示；其中，相對(duì)保留時(shí)間＝各組分峰的保留時(shí)間/參照峰的保留時(shí)間，相對(duì)保留峰面積＝各組分峰的峰面積/參照峰的峰面積；

表310批腎炎草指紋圖譜中共有指紋峰的相對(duì)保留時(shí)間

表410批腎炎草指紋圖譜中共有指紋峰的相對(duì)峰面積

由圖表可知，延邊地區(qū)不同產(chǎn)地的腎炎草藥材hplc指紋圖譜共有峰的相對(duì)保留時(shí)間的rsd為0.04-0.2％，小于3％，說明了重現(xiàn)性很好；但是相對(duì)峰面積值存在較為顯著的差異(rsd為17-81％)，這說明了10批不同產(chǎn)地藥材因?yàn)槠渖a(chǎn)環(huán)境的不同導(dǎo)致了其化學(xué)成分含量的差別。

2.4相似度的計(jì)算

分別按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣分析，利用《中國藥典》“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2004a版”，將1～10批腎炎草供試品圖譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入，經(jīng)多點(diǎn)校正和數(shù)據(jù)匹配，以中位數(shù)生成對(duì)照指紋圖譜，建立共有模式的指紋圖譜(圖5)，根據(jù)匹配的數(shù)據(jù)，確定了21個(gè)共有峰，對(duì)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間進(jìn)行了分析，其21個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間的rsd在0.1％～1％之間，各產(chǎn)地藥材的共有峰保留時(shí)間基本一致(圖4)。

2.5不同產(chǎn)地之間的相似度比較

根據(jù)以上提到的色譜條件，分別將延邊不同產(chǎn)地的腎炎草供試品進(jìn)行分析，記錄色譜圖，利用《中國藥典》“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2004b版”，將1～10批腎炎草藥材圖譜生成的對(duì)照譜圖導(dǎo)入，計(jì)算延邊不同產(chǎn)地樣品與共有模式間的的相似度比較，結(jié)果如表5所示。

表5.延邊不同產(chǎn)地腎炎草藥材的相似度

2.5方法學(xué)驗(yàn)證

2.5.1精密度實(shí)驗(yàn)

精密吸取同一份供試品溶液1.0ml，按以上色譜條件連續(xù)進(jìn)樣5次，經(jīng)“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)a版”對(duì)各主要色譜峰的峰面積和保留時(shí)間考察計(jì)算，結(jié)果顯示，其主要色譜峰的峰面積以及保留時(shí)間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于3％，表明儀器精密度良好，如圖6、表6所示。

表6方法精密度測(cè)試

2.5.2重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

精密吸取同一份供試品溶液5份，按以上色譜條件分別進(jìn)樣，經(jīng)“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)a版”對(duì)各主要色譜峰的峰面積和保留時(shí)間考察計(jì)算，結(jié)果顯示其主要色譜峰的峰面積以及保留時(shí)間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于3％，說明方法重復(fù)性良好，如圖7、表7所示。

表7方法重復(fù)性測(cè)試

2.5.3穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

精密吸取同一份供試品溶液，按以上色譜條件，分別在1、4、8、12、24h進(jìn)樣，經(jīng)“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)a版”對(duì)各主要色譜峰的峰面積和保留時(shí)間考察計(jì)算，結(jié)果顯示其主要色譜峰的峰面積以及保留時(shí)間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于3％，表明供試品溶液在24h小時(shí)內(nèi)基本穩(wěn)定，如圖8、表8所示。

表8樣品穩(wěn)定性測(cè)試

盡管本發(fā)明的實(shí)施方案已公開如上，但其并不僅僅限于說明書和實(shí)施方式中所列運(yùn)用，它完全可以被適用于各種適合本發(fā)明的領(lǐng)域，對(duì)于熟悉本領(lǐng)域的人員而言，可容易地實(shí)現(xiàn)另外的修改，因此在不背離權(quán)利要求及等同范圍所限定的一般概念下，本發(fā)明并不限于特定的細(xì)節(jié)和這里示出與描述的圖例。