本發(fā)明涉及藥物分析領(lǐng)域，具體地說是一種檢測羅庫溴銨或其注射液中烯丙基溴含量的方法。

背景技術(shù)：

羅庫溴銨，化學(xué)名：溴化1-[17β-乙酰氧基-2β-(4-嗎啉基)-5α-雄甾烷-3α-羥基-16β-基]-1-(2-丙烯基)吡咯溴化物，分子式：c32h53brn2o4，分子量：609.68，其結(jié)構(gòu)式為：

羅庫溴銨是一種新型中效非去極化神經(jīng)肌肉阻滯劑，為全身麻醉輔助用藥，用于常規(guī)誘導(dǎo)麻醉期間氣管插管，以及維持術(shù)中骨骼肌松弛。它通過競爭性機(jī)制與乙酰膽堿受體結(jié)合，阻止離子通道地激活及細(xì)胞膜地去極化，達(dá)到肌肉松弛地效果。1994年在美國批準(zhǔn)上市，現(xiàn)如今年銷量穩(wěn)定在五千萬美元。目前，國內(nèi)有兩家進(jìn)口和兩家本土企業(yè)也已上市。

目前已報道的羅庫溴銨合成工藝中大多數(shù)使用了大量的烯丙基溴，文獻(xiàn)報道烯丙基溴急性毒性：ld5030mg/kg(豚鼠經(jīng)口)；lc501000mg/m³，1/2小時(大鼠吸入)，其殘留可能會對人體健康造成傷害，需要對產(chǎn)品中烯丙基溴含量進(jìn)行控制。然而，據(jù)文獻(xiàn)檢索可知，當(dāng)前只有一篇名為“hplc法測定羅庫溴銨中溴丙烯的含量”的文章及授權(quán)公告號cn102288705b專利中給出了羅庫溴銨中烯丙基溴含量檢測的方法，同時專利中也提到它的方法在流動相調(diào)ph值之前，拖尾嚴(yán)重，且與羅庫溴銨主峰較接近，另外，方法中使用了離子對試劑四甲基氫氧化銨來配制流動相，一方面增加了檢測成本，另一方面增加了檢測難度：①需使用磷酸調(diào)節(jié)水相的ph值，從強(qiáng)堿性調(diào)節(jié)到5.0；②流動相中加入了四甲基氫氧化銨，會造成系統(tǒng)難以平衡，增加檢測時間；③四甲基氫氧化銨的加入會帶來烯丙基溴主峰保留時間的漂移。

由于上述方法存在這些缺點，研究一種專屬性強(qiáng)、簡單快速的檢測羅庫溴銨及其注射液中烯丙基溴含量的方法顯得尤為重要。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

鑒于現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，本發(fā)明通過對流動相、對照品/供試品配制方式和洗脫方式等特征進(jìn)行改進(jìn)，提供了一種適合于羅庫溴銨原料或其注射液中烯丙基溴含量的方法。該方法具有流動相配制簡單，系統(tǒng)穩(wěn)定，專屬性和重復(fù)性高的優(yōu)點。

本發(fā)明的目的可以通過以下措施達(dá)到：

一種檢測羅庫溴銨或其注射液中烯丙基溴含量的方法，將烯丙基溴對照品溶液、羅庫溴銨供試品溶液分別注入高效液相色譜儀中，以外標(biāo)法檢測計算供試品溶液中烯丙基溴含量；

其中流動相采用梯度洗脫的方式進(jìn)行：0~20min，流動相a：b=70%：30%；25~30min，流動相a：b=50%：50%；35~50min，流動相a：b=70%：30%；所述流動相a為純水相，流動相b為乙腈；

所述烯丙基溴對照品溶液為由烯丙基溴對照品經(jīng)由乙腈水溶液溶解稀釋得到的原料藥對照品溶液或注射液對照品溶液；所述羅庫溴銨供試品溶液為由羅庫溴銨原料藥經(jīng)由乙腈水溶液溶解得到的原料藥供試品溶液或由羅庫溴銨注射液經(jīng)由乙腈水溶液稀釋得到的注射液供試品溶液。

在一種優(yōu)選方案中，原料藥對照品溶液的濃度為0.25~0.30μg/ml，所述注射液對照品溶液的濃度為0.12~0.15μg/ml。羅庫溴銨注射液的濃度為10mg/ml，原料藥供試品溶液的濃度為15~20mg/ml，所述注射液供試品溶液的濃度為4～6mg/ml，優(yōu)選5mg/ml。

在配制烯丙基溴對照品溶液或供試品溶液時，采用的50%~100%的乙腈水溶液，優(yōu)選50%~70%或80%~100%乙腈水溶液，更優(yōu)選50%~60%或85%~100%乙腈水溶液。

本發(fā)明中的色譜條件為：固定相采用十八烷基鍵合硅膠為填料的色譜柱，優(yōu)選150×4.6mm3μm。柱溫35~45℃；流速0.8~1.2ml/min；檢測波長205~215nm。

在進(jìn)行高效液相色譜檢測時，用于檢測原料藥的進(jìn)樣體積為20~30μl，用于檢測注射液的進(jìn)樣體積為40~50μl，以對照品溶液中烯丙基溴計算理論塔板數(shù)不低于5000，拖尾因子為0.9~1.1前提下采用外標(biāo)法對測定結(jié)果進(jìn)行分析。

本發(fā)明的流動相a為純水相，水相為超純水、純化水或飲用水；流動相b為分析級或色譜級乙腈。烯丙基溴對照品為usp級別、cp級別或工作標(biāo)準(zhǔn)品。

以下提供了一種具體的檢測羅庫溴銨或其注射液中烯丙基溴含量的方法，其包括如下步驟：

（1）流動相配制：流動相a為純水相；流動相b為乙腈；

（2）稱取烯丙基溴對照品，用50%~100%乙腈水溶液進(jìn)行溶解，得到對照品儲備液，移取對照品儲備液，再用50%~100%乙腈水溶液進(jìn)行稀釋，得到對照品溶液，即原料藥對照品溶液或注射液對照品溶液；

（3）稱取羅庫溴銨原料藥，用50%~100%乙腈水溶液進(jìn)行稀釋，得到原料藥供試品溶液

（4）移取羅庫溴銨注射液，用50%~100%乙腈水溶液進(jìn)行稀釋，得到注射液供試品溶液；

（5）色譜條件：

色譜柱：固定相是十八烷基鍵合硅膠為填料的色譜柱；

流動相：流動相a為純水相；流動相b為乙腈；

③梯度：0~20min，流動相a：b=70%：30%；25~30min，流動相a：b=50%：50%；35~50min，流動相a：b=70%：30%；

（6）樣品檢測：將烯丙基溴對照品溶液、原料藥供試品溶液分別注入高效液相色譜儀中進(jìn)行檢測，在對照品溶液中以烯丙基溴計算理論塔板數(shù)不低于5000，拖尾因子為0.9~1.1前提下采用外標(biāo)法對測定結(jié)果進(jìn)行分析；或者，

（7）樣品檢測：將烯丙基溴對照品溶液、注射液供試品溶液分別注入高效液相色譜儀中進(jìn)行檢測，在對照品溶液中以烯丙基溴計算理論塔板數(shù)不低于5000，拖尾因子為0.9~1.1前提下采用外標(biāo)法對測定結(jié)果進(jìn)行分析。

在上述步驟（1）中，流動相配制：流動相a為純水相，水相為超純水、純化水或飲用水；流動相b為分析級或色譜級乙腈。

在上述步驟（2）中，稱取烯丙基溴對照品，用50%~100%乙腈水溶液進(jìn)行溶解，優(yōu)選80%~100%乙腈水溶液，再優(yōu)選85%~95%乙腈水溶液；烯丙基溴對照品為usp級別、cp級別或工作標(biāo)準(zhǔn)品；配制的烯丙基溴對照品儲備液濃度在0.25~0.30mg/ml。

在上述步驟（2）中，移取對照品儲備液，再用50%~100%乙腈水溶液進(jìn)行稀釋，優(yōu)選80%~100%乙腈水溶液，再優(yōu)選85%~95%乙腈水溶液用來配制檢測原料藥中烯丙基溴含量的對照品溶液，溶液濃度在0.25~0.30μg/ml；移取對照品儲備液，再用50%~100%乙腈水溶液進(jìn)行稀釋，優(yōu)選50%~70%乙腈水溶液，再優(yōu)選50%~60%乙腈水溶液用來配制檢測注射液中烯丙基溴含量的對照品溶液，溶液濃度在0.12~0.15μg/ml。

在上述步驟（3）中，稱取羅庫溴銨原料藥，用50%~100%乙腈水溶液進(jìn)行溶解，優(yōu)選80%~100%乙腈水溶液，再優(yōu)選85%~95%乙腈水溶液；配制的原料藥供試品溶液濃度為15~20mg/ml。

在上述步驟（4）中，移取羅庫溴銨注射液，羅庫溴銨注射液為50mg:5ml、100mg:10ml或其它規(guī)格的注射劑產(chǎn)品，用50%~100%乙腈水溶液進(jìn)行稀釋，優(yōu)選80%~100%乙腈水溶液，再優(yōu)選85%~100%乙腈水溶液；配制的注射液供試品溶液濃度為5mg/ml。

本發(fā)明中的100%乙腈水溶液是指純乙腈。

在上述步驟（5）中，色譜柱：固定相是十八烷基鍵合硅膠為填料的色譜柱，優(yōu)選150×4.6mm3μm；流動相：流動相a為純水相，如果水相中加入離子對試劑或其它緩沖鹽，比如四甲基氫氧化銨、磷酸二氫鉀、磷酸二氫鈉等會造成高效液相系統(tǒng)長時間難以平衡，或給檢測系統(tǒng)帶來不必要的雜質(zhì)，增加檢測難度，另外影響產(chǎn)品的出峰穩(wěn)定性，實驗室研究發(fā)現(xiàn)流動相中加入這些鹽，會引起烯丙基溴峰型不對稱和漂移。把流動相從鹽溶液換成純水相，省去了ph值調(diào)節(jié)步驟，不會有因為鹽的加入而引入的相關(guān)雜質(zhì)，整個系統(tǒng)的流動相更簡單，而烯丙基溴的出峰時間更穩(wěn)定。

在上述步驟（5）中，③梯度：0~20min，流動相a：b=70%：30%；25~30min，流動相a：b=50%：50%；35~50min，流動相a：b=70%：30%，洗脫方式由現(xiàn)有技術(shù)中的等度改為梯度，加上流動相a的轉(zhuǎn)換，使得檢測結(jié)果中只有烯丙基溴出峰，其它的相關(guān)雜質(zhì)與羅庫溴銨主峰均不會被采集到，經(jīng)過供試品出峰的峰面積/保留時間與烯丙基溴對照品出峰的峰面積/保留時間進(jìn)行比對，驗證出供試品中唯一出現(xiàn)的峰為烯丙基溴峰。由于在本發(fā)明的檢測結(jié)果中只有烯丙基溴唯一的峰，該方法用于檢測烯丙基溴的專屬性非常高，供試品經(jīng)過強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、氧化、高溫、光照破壞后，該方法的強(qiáng)專屬性依然成立。

在上述步驟（5）中，色譜條件如下：柱溫35~45℃；流速0.8~1.2ml/min；進(jìn)樣體積20~50μl，用于檢測原料藥的進(jìn)樣體積為20~30μl，用于檢測注射液的進(jìn)樣體積為40~50μl；檢測波長205~215nm。

在上述步驟（6）和（7）中，無論是檢測原料藥或注射液中烯丙基溴的含量，均以其對應(yīng)的對照品溶液中，以烯丙基溴計算理論塔板數(shù)不低于5000，拖尾因子為0.9~1.1前提下采用外標(biāo)法對測定結(jié)果進(jìn)行分析，如果系統(tǒng)適應(yīng)性達(dá)不到要求（烯丙基溴理論塔板數(shù)低于5000，拖尾因子＜0.9或＞1.1），則不能進(jìn)行供試品溶液中烯丙基溴含量的計算。

本發(fā)明所述的技術(shù)方案是能夠?qū)α_庫溴銨或其注射液中烯丙基溴含量進(jìn)行檢測的，該方法的構(gòu)建解決了現(xiàn)有羅庫溴銨中烯丙基溴含量檢測方法中專屬性差、系統(tǒng)平衡難度大、出峰時間漂移，峰型拖尾的缺點。本發(fā)明采用純水代替含鹽的水相，梯度洗脫代替等度洗脫，使得檢測結(jié)果中僅有烯丙基溴出峰，大大地提高了檢測的專屬性，改善了峰型。本方法具有操作簡單，重復(fù)性好，專屬性強(qiáng)等特點。

附圖說明

圖1羅庫溴銨原料藥中烯丙基溴含量檢測對照品溶液的譜圖；

圖2羅庫溴銨原料藥中烯丙基溴含量檢測供試品溶液的譜圖；

圖3羅庫溴銨注射液中烯丙基溴含量檢測對照品溶液的譜圖；

圖4羅庫溴銨注射液中烯丙基溴含量檢測供試品溶液的譜圖。

具體實施方式

實施例一：

色譜條件如下，色譜柱：agilent，150×4.6mm3μm；柱溫：35℃；流速：1.0ml/min；檢測波長：210nm；梯度：0~20min，流動相a：b=70%：30%；25~30min，流動相a：b=50%：50%；35~50min，流動相a：b=70%：30%。

量取1000ml的純化水加入到流動相瓶中，標(biāo)記為流動相a；量取1000ml的分析級乙腈加入到流動相瓶中，標(biāo)記為流動相b；將流動相a和b兩個瓶子放入到超聲儀中，超聲1-2min后，取出，上液相，進(jìn)行儀器系統(tǒng)平衡。

準(zhǔn)確稱取約28.0mg烯丙基溴對照品（百靈威）于100ml容量瓶中，用50%乙腈水溶液進(jìn)行溶解、稀釋至刻度線，搖勻，得到烯丙基溴對照品儲備液。移取1.0ml上述溶液于100ml容量瓶中，用50%乙腈水溶液稀釋至刻度線，搖勻；再移取5.0ml上述溶液于50ml容量瓶中，用50%乙腈水溶液稀釋至刻度線，搖勻，得到用于檢測原料藥中烯丙基溴對照品溶液（0.25μg/ml）。移取1.0ml烯丙基溴對照品儲備液于200ml容量瓶中，用50%乙腈水溶液稀釋至刻度線，搖勻；再移取5.0ml上述溶液于50ml容量瓶中，用50%乙腈水溶液稀釋至刻度線，搖勻，得到用于檢測注射液中烯丙基溴對照品溶液（0.125μg/ml）。

稱取羅庫溴銨原料藥150mg于10ml容量瓶中，用50%乙腈水溶液進(jìn)行稀釋，得到原料藥供試品溶液（15mg/ml）；移取50mg:5ml規(guī)格的羅庫溴銨注射液5ml于10ml容量瓶中，用50%乙腈水溶液進(jìn)行稀釋，得到注射液供試品溶液（5mg/ml）。

烯丙基溴檢測（原料藥）：分別向高效液相色譜儀中注入烯丙基溴對照品溶液（0.25μg/ml）、原料藥供試品溶液（15mg/ml）30μl，對照品溶液中的烯丙基溴在15.795min出峰，以烯丙基溴計算理論塔板數(shù)為9566，拖尾因子為0.9，供試品溶液中的烯丙基溴在15.796min出峰，濃度=0.25×2862/11700=0.06115μg/ml，含量=0.06115μg/ml/15mg/ml=4.1ppm，符合規(guī)定（≤20ppm）。

烯丙基溴檢測（注射液）：分別向高效液相色譜儀中注入烯丙基溴對照品溶液（0.125μg/ml）、注射液供試品溶液（5mg/ml）50μl，對照品溶液中的烯丙基溴在15.791min出峰，以烯丙基溴計算理論塔板數(shù)為9781，拖尾因子為0.9，供試品溶液中的烯丙基溴在15.788min出峰，濃度=0.125×1154/13337=0.01082μg/ml，含量=0.01082μg/ml/5mg/ml=2.2ppm，符合規(guī)定（≤20ppm）。

實施例二：

色譜條件如下，色譜柱：ymc，150×4.6mm3μm；柱溫：40℃；流速：1.0ml/min；檢測波長：210nm；梯度：0~20min，流動相a：b=70%：30%；25~30min，流動相a：b=50%：50%；35~50min，流動相a：b=70%：30%。

量取1000ml的超純水加入到流動相瓶中，標(biāo)記為流動相a；量取1000ml的色譜級乙腈加入到流動相瓶中，標(biāo)記為流動相b；將流動相a和b兩個瓶子放入到超聲儀中，超聲1-2min后，取出，上液相，進(jìn)行儀器系統(tǒng)平衡。

準(zhǔn)確稱取約28.0mg烯丙基溴對照品（sigma）于100ml容量瓶中，用70%乙腈水溶液進(jìn)行溶解、稀釋至刻度線，搖勻，得到烯丙基溴對照品儲備液。移取1.0ml上述溶液于100ml容量瓶中，用70%乙腈水溶液稀釋至刻度線，搖勻；再移取5.0ml上述溶液于50ml容量瓶中，用70%乙腈水溶液稀釋至刻度線，搖勻，得到用于檢測原料藥中烯丙基溴對照品溶液（0.28μg/ml）。移取1.0ml烯丙基溴對照品儲備液于200ml容量瓶中，用70%乙腈水溶液稀釋至刻度線，搖勻；再移取5.0ml上述溶液于50ml容量瓶中，用70%乙腈水溶液稀釋至刻度線，搖勻，得到用于檢測注射液中烯丙基溴對照品溶液（0.14μg/ml）。

稱取羅庫溴銨原料藥180mg于10ml容量瓶中，用70%乙腈水溶液進(jìn)行稀釋，得到原料藥供試品溶液（18mg/ml）；移取100mg:10ml規(guī)格的羅庫溴銨注射液5ml于10ml容量瓶中，用70%乙腈水溶液進(jìn)行稀釋，得到注射液供試品溶液（5mg/ml）。

烯丙基溴檢測（原料藥）：分別向高效液相色譜儀中注入烯丙基溴對照品溶液（0.28μg/ml）、原料藥供試品溶液（18mg/ml）25μl，對照品溶液中的烯丙基溴在14.618min出峰，以烯丙基溴計算理論塔板數(shù)為8763，拖尾因子為1.0，供試品溶液中的烯丙基溴在14.587min出峰，濃度=0.28×2045/9632=0.05945μg/ml，含量=0.05945μg/ml/18mg/ml=3.3ppm，符合規(guī)定（≤20ppm），見圖1、圖2。

烯丙基溴檢測（注射液）：分別向高效液相色譜儀中注入烯丙基溴對照品溶液（0.14μg/ml）、注射液供試品溶液（5mg/ml）45μl，對照品溶液中的烯丙基溴在14.540min出峰，以烯丙基溴計算理論塔板數(shù)為7545，拖尾因子為1.0，供試品溶液中未檢測出烯丙基溴，符合規(guī)定（≤20ppm）見圖3、圖4。另外，（加標(biāo)100%限度濃度）供試品溶液中的烯丙基溴在14.644min出峰。

實施例三：

色譜條件如下，色譜柱：waters，150×4.6mm3μm；柱溫：45℃；流速：1.2ml/min；檢測波長：215nm；梯度：0~20min，流動相a：b=70%：30%；25~30min，流動相a：b=50%：50%；35~50min，流動相a：b=70%：30%。

量取1000ml的飲用水加入到流動相瓶中，標(biāo)記為流動相a；量取1000ml的色譜級乙腈加入到流動相瓶中，標(biāo)記為流動相b；將流動相a和b兩個瓶子放入到超聲儀中，超聲1-2min后，取出，上液相，進(jìn)行儀器系統(tǒng)平衡。

準(zhǔn)確稱取約30.0mg烯丙基溴對照品（阿拉丁）于100ml容量瓶中，用100%乙腈水溶液（即純乙腈，下同）進(jìn)行溶解、稀釋至刻度線，搖勻，得到烯丙基溴對照品儲備液。移取1.0ml上述溶液于100ml容量瓶中，用100%乙腈水溶液稀釋至刻度線，搖勻；再移取5.0ml上述溶液于50ml容量瓶中，用100%乙腈水溶液稀釋至刻度線，搖勻，得到用于檢測原料藥中烯丙基溴對照品溶液（0.30μg/ml）。移取1.0ml烯丙基溴對照品儲備液于200ml容量瓶中，用100%乙腈水溶液稀釋至刻度線，搖勻；再移取5.0ml上述溶液于50ml容量瓶中，用100%乙腈水溶液稀釋至刻度線，搖勻，得到用于檢測注射液中烯丙基溴對照品溶液（0.15μg/ml）。

稱取羅庫溴銨原料藥200mg于10ml容量瓶中，用100%乙腈水溶液進(jìn)行稀釋，得到原料藥供試品溶液（20mg/ml）；移取100mg:10ml規(guī)格的羅庫溴銨注射液5ml于10ml容量瓶中，用100%乙腈水溶液進(jìn)行稀釋，得到注射液供試品溶液（5mg/ml）。

烯丙基溴檢測（原料藥）：分別向高效液相色譜儀中注入烯丙基溴對照品溶液（0.30μg/ml）、原料藥供試品溶液（20mg/ml）20μl，對照品溶液中的烯丙基溴在13.313min出峰，以烯丙基溴計算理論塔板數(shù)為6571，拖尾因子為1.1，供試品溶液中的烯丙基溴在13.324min出峰，濃度=0.30×1874/9432=0.05961μg/ml，含量=0.05961μg/ml/20mg/ml=3.0ppm，符合規(guī)定（≤20ppm）。

烯丙基溴檢測（注射液）：分別向高效液相色譜儀中注入烯丙基溴對照品溶液（0.15μg/ml）、注射液供試品溶液（5mg/ml）40ul，對照品溶液中的烯丙基溴在13.521min出峰，以烯丙基溴計算理論塔板數(shù)為5432，拖尾因子為1.1，供試品溶液中的烯丙基溴在13.574min出峰，濃度=0.15×789/8565=0.01382μg/ml，含量=0.01382μg/ml/5mg/ml=2.8ppm，符合規(guī)定（≤20ppm）。