本發(fā)明涉及化合物同位素豐度的檢測方法，尤其是涉及一種測定葡萄中穩(wěn)定同位素標(biāo)記¹⁵n或¹³c氨基酸及其代謝物同位素豐度的方法。

背景技術(shù)：

葡萄中的氨基酸具有抗氧化、抗菌、表面活性和乳化的作用，同時也是葡萄酒釀造所需的重要氮源，其組成和含量受葡萄品種、產(chǎn)地、年份、氣候和肥料使用等因素影響，在某種程度上決定了葡萄酒的特征。其中，氨基酸通過生物代謝轉(zhuǎn)化為高級醇、酯類、醛類和酮酸等芳香性成分。有研究表明，通過外加氨基酸的方法可以提高葡萄酒芳香物質(zhì)的含量，從而加快葡萄酒發(fā)酵速度，提高葡萄酒的品質(zhì)。此外，某些氨基酸如精氨酸、瓜氨酸等在葡萄酒發(fā)酵過程中會產(chǎn)生氨基甲酸乙酯(ec)，ec為發(fā)酵酒中廣泛存在的“2a”類致癌物，通過葡萄中氨基酸代謝途徑的研究，可為葡萄品質(zhì)改善和葡萄酒加工特性研究提供依據(jù)。因此，監(jiān)測葡萄中相關(guān)氨基酸及其代謝產(chǎn)物的變化有著重要的應(yīng)用價值。

穩(wěn)定同位素示蹤技術(shù)是利用穩(wěn)定同位素標(biāo)記的化合物作為示蹤劑，研究物質(zhì)轉(zhuǎn)化或變化規(guī)律的方法。由于標(biāo)記化合物與其相應(yīng)的非標(biāo)記化合物(被追蹤物質(zhì))具有相同的化學(xué)和生物學(xué)性質(zhì)，在生物機體內(nèi)所發(fā)生的化學(xué)變化和生物過程也完全相同。將二者混合后,通過同位素豐度或比值的變化測出同種非標(biāo)記化合物含量,從而反映被追蹤物質(zhì)在有機體內(nèi)的生物利用率及代謝規(guī)律。同位素標(biāo)記方法被認(rèn)為是繼顯微鏡發(fā)明以來,生物學(xué)和醫(yī)學(xué)科學(xué)歷史上最大的成就之一。穩(wěn)定同位素標(biāo)記的氨基酸是普通氨基酸中的一種或幾種元素被穩(wěn)定同位素所取代(如¹³c、¹⁵n或²h)，從而具有示蹤性。將穩(wěn)定標(biāo)記氨基酸引入生物體內(nèi)，通過測定代謝過程中氨基酸及其代謝產(chǎn)物的穩(wěn)定同位素豐度變化，能夠揭開生物體或細(xì)胞內(nèi)代謝的理化過程，了解生物體的新陳代謝規(guī)律，代謝路徑如下所示。

其中，在代謝過程中穩(wěn)定同位素氨基酸及其代謝產(chǎn)物同位素豐度的準(zhǔn)確測定是該技術(shù)的關(guān)鍵，直接影響到了代謝規(guī)律的準(zhǔn)確表達(dá)?，F(xiàn)有方法通常是使用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用或氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，通過質(zhì)譜圖中不同質(zhì)量數(shù)峰強的差異定性地反應(yīng)標(biāo)記氨基酸的豐度變化情況，然而并未對同位素豐度量化。目前，國內(nèi)研究人員對植物中氨基酸的研究大多集中在含量測定方面，對引入的穩(wěn)定同位素標(biāo)記氨基酸，以及氨基酸代謝相關(guān)產(chǎn)物的同位素豐度檢測方法鮮有研究。傳統(tǒng)的氣體同位素質(zhì)譜法適合單一化合物的同位素豐度測定，無法得到復(fù)雜基質(zhì)中多種待測組分的同位素豐度。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的就是為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷而提供一種測定葡萄中穩(wěn)定同位素標(biāo)記¹⁵n或¹³c氨基酸及其代謝物同位素豐度的方法，通過氣相色譜將葡萄樣品中多個氨基酸及代謝物組分依次分離，進(jìn)而通過質(zhì)譜圖中質(zhì)譜峰簇的分布，準(zhǔn)確地對每種組分的同位素豐度進(jìn)行表征。

本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)：

測定葡萄中15n或13c標(biāo)記氨基酸及代謝物同位素豐度的方法，采用以下步驟：

(1)氨基酸及氨基酰胺類樣品前處理

(1-1)將葡萄或葡萄皮破碎、研磨并勻漿后加入到酸溶液中，超聲提取10min～45min，以5000～10000r/min的速度離心，取上清液經(jīng)固相萃取小柱凈化濃縮，經(jīng)spe處理后的溶液經(jīng)氮吹儀吹干，之后加入衍生化試劑，充分混合后在40℃～80℃下反應(yīng)2小時，過濾待用；

(1-2)使用相同的前處理和衍生化步驟，對氨基酸及氨基酰胺的天然豐度標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行處理；

(2)吡嗪類樣品前處理

(2-1)將葡萄或葡萄皮破碎、研磨并勻漿，然后以10000r/min的速度離心，取上清液經(jīng)固相萃取小柱凈化濃縮；首先使用甲醇和去離子水分別對小柱進(jìn)行活化，再經(jīng)去離子水淋洗后用甲醇洗脫，過濾待用；

(2-2)使用相同的步驟對吡嗪類化合物的天然豐度標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行處理；

(3)檢測

利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀分別對經(jīng)過前處理的天然豐度標(biāo)準(zhǔn)品和葡萄樣品溶液進(jìn)行測定，選擇特征碎片離子進(jìn)行同位素豐度值的計算，利用同位素峰簇的比值計算出標(biāo)記試劑的同位素豐度值。

步驟(1)中所述的酸溶液為20g/l～100g/l的磺基水楊酸溶液或6mol/l的鹽酸水溶液，葡萄或葡萄皮與酸溶液的比例關(guān)系為0.1g～1g：5ml～20ml。

步驟(1)中所述的固相萃取小柱的填料為混合型陽離子交換(mcx)、強陽離子交換(scx)、弱陽離子交換(wcx)強陰離子交換(sax)或混合型弱陰離子交換(wax)基質(zhì)。

步驟(1)中所述的衍生化試劑為n-甲基-n-(三甲基硅烷)三氟乙酰胺(mstfa)或雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(bstfa)，葡萄或葡萄皮與衍生化試劑的比例關(guān)系為0.1g～1g：100μl～1000μl。

步驟(2)中所述的固相萃取小柱的填料為混合型陽離子交換(mcx)、反相(c18或c8)或氨基(nh2)基質(zhì)。

步驟(2)中葡萄或葡萄皮與活化用的甲醇和去離子水的比例關(guān)系為0.1g～1g：1ml～5ml，葡萄或葡萄皮與淋洗用去離子水的比例關(guān)系為0.1g～1g：3ml～10ml，葡萄或葡萄皮與洗脫用甲醇的比例關(guān)系為0.1g～1g：3ml～10ml。

步驟(3)中氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀中：

氣相色譜條件為：色譜柱為hp-5、hp-1或db-1ms毛細(xì)管柱；載氣為高純氦，流速為0.1ml/min～2.0ml/min；進(jìn)樣量0.1μl～1.0μl，分流比為(5～100):1；進(jìn)樣口溫度為200℃～300℃；柱升溫程序從60℃～80℃以(25～40)℃/min升至200℃～230℃，

質(zhì)譜分析條件為：電子轟擊離子源(ei)；掃描范圍(m/z)為10～500；離子源溫度為150℃～280℃，四級桿溫度為150℃～300℃，接口溫度為200℃～300℃；電離能量為50ev～100ev。

步驟(3)中選擇特征碎片離子進(jìn)行同位素豐度值的計算，利用同位素峰簇的比值計算出標(biāo)記試劑的同位素豐度值具體采用以下步驟：

a)對天然豐度標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行分析，將采集的質(zhì)譜圖中特征碎片離子峰峰簇質(zhì)荷比(m/z)為m，m+1和m+2的峰強度數(shù)據(jù)記為a^m，a^m+1和a^m+2，將峰強度值代入式(1)歸一化得到a，b，c，

a^m:a^m+1:a^m+2＝a:b:c(1)

a+b+c＝1

b)采集樣品質(zhì)譜圖中質(zhì)荷比為m和m+1的峰強度數(shù)據(jù)，代入式(2)計算，解得x0和x1；

amix^m＝x0·a(2)

amix^m+1＝x0b+x1·a

其中：amix^m和amix^m+1為質(zhì)荷比為m和m+1的質(zhì)譜峰強度值；x0為天然豐度待測組分分子的摩爾分?jǐn)?shù)，x1為標(biāo)記一個穩(wěn)定同位素(¹³c或¹⁵n)的待測組分分子的摩爾分?jǐn)?shù)，同位素豐度值以e計，按公式(3)計算：

e＝x1/(x0+x1)·100％(3)。

待測組分結(jié)構(gòu)式對應(yīng)的特征碎片離子峰峰簇質(zhì)荷比如下所示：

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的前處理步驟能夠保證目標(biāo)化合物的同位素豐度在前處理過程中不發(fā)生同位素豐度稀釋效應(yīng)，本發(fā)明可以同時測定葡萄樣品中多種氨基酸及其代謝產(chǎn)物的同位素豐度；經(jīng)過氣相色譜進(jìn)入質(zhì)譜分析的是葡萄樣品中目標(biāo)化合物標(biāo)記位點的同位素豐度值，而非混合物的平均豐度。

附圖說明

圖1為亮氨酸、亮氨酰氨、2-甲氧基-3-異丁基吡嗪和2-甲氧基-3-異丙基吡嗪的質(zhì)譜圖。

圖中，a、亮氨酸；b、亮氨酰氨；c、2-甲氧基-3-異丁基吡嗪；d、2-甲氧基-3-異丙基吡嗪。

具體實施方式

下面結(jié)合附圖和具體實施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。以下實施例將有助于本領(lǐng)域的技術(shù)人員進(jìn)一步理解本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)指出的是，對本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)。這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

實施例1

葡萄組織中亮氨酸和亮氨酰氨同位素豐度分析，包括以下步驟：

1)樣品的前處理

取0.1g～1g葡萄樣品破碎、研磨并勻漿后，加入5ml～20ml鹽酸(濃度為6mol/l)，超聲提取20min，以10000r/min的速度離心，取上清液經(jīng)固相萃取小柱凈化濃縮。首先使用5ml～10ml甲醇和去離子水分別對小柱進(jìn)行活化。以0.5滴/秒的速度上樣，之后用10ml去離子水淋洗，用0.5mol/l的氨水溶液3ml洗脫，待用。

(1)樣品的衍生化

經(jīng)spe處理后的溶液經(jīng)氮吹儀吹干，之后加入100μl衍生化試劑n-甲基-n-(三甲基硅烷)三氟乙酰胺(mstfa)，充分混合后60℃下反應(yīng)兩小時，待用。使用相同的前處理和衍生化步驟，對待測組分的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行處理，待用。

(2)檢測條件

樣品經(jīng)前處理后進(jìn)入氣質(zhì)聯(lián)用分析。氣相色譜條件如下：色譜柱為hp-5ms毛細(xì)管柱；載氣為高純氦，流速為1.0ml/min；進(jìn)樣量0.5μl，分流比為(5～100):1；進(jìn)樣口溫度為250℃；柱升溫程序從60℃～80℃以25℃/min升至230℃～280℃。質(zhì)譜分析條件為電子轟擊離子源(ei)；掃描范圍(m/z)為50～200；離子源溫度為250℃，四級桿溫度為150℃，接口溫度為280℃；電離能量為70ev。

(4)同位素豐度的計算

亮氨酸及亮氨酰氨經(jīng)衍生化反應(yīng)后成為衍生化產(chǎn)物，根據(jù)各組分的特征碎片離子的峰簇分布進(jìn)行同位素豐度的計算。

a)首先，對天然豐度標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行分析。將采集的質(zhì)譜圖中(圖1中a、b)特征離子峰峰簇質(zhì)荷比(m/z)為158，159和160的峰強度數(shù)據(jù)記為a¹⁵⁸，a¹⁵⁹和a¹⁶⁰，從譜圖結(jié)果中得到a¹⁵⁸，a¹⁵⁹和a¹⁶⁰，然后將峰強度值歸一化，

i)亮氨酸a¹⁵⁸:a¹⁵⁹:a¹⁶⁰＝a:b:c＝100:15.7:4.38＝0.833:0.131:0.0365

ii)亮氨酰胺a¹⁵⁸:a¹⁵⁹:a¹⁶⁰＝a:b:c＝100:15.6:4.68＝0.837:0.123:0.0392

b)將前處理完畢的葡萄樣品進(jìn)入質(zhì)譜分析。質(zhì)譜圖中質(zhì)荷比為158和159的峰強度數(shù)據(jù)分別代入下式計算，解得x0和x1。

i)亮氨酸amix¹⁵⁸＝x0·a＝0.833x0＝100

amix¹⁵⁹＝x0b+x1·a＝0.131x0+0.833x1＝17

ii)亮氨酰胺amix¹⁵⁸＝x0·a＝0.833x0＝100

amix¹⁵⁹＝x0b+x1·a＝0.131x0+0.833x1＝22.5

其中：amix¹⁵⁸和amix¹⁵⁹為質(zhì)荷比為158和159的質(zhì)譜峰強度值；x0為天然豐度亮氨酸或亮氨酰氨的摩爾分?jǐn)?shù)，x1為標(biāo)記一個穩(wěn)定同位素¹³c的亮氨酸或亮氨酰氨分子的摩爾分?jǐn)?shù)。同位素豐度值以e計，e＝x1/(x0+x1)·100％。質(zhì)譜采集數(shù)據(jù)及計算結(jié)果列于表1。

表1亮氨酸及亮氨酰氨的質(zhì)譜采集數(shù)據(jù)和計算結(jié)果

實施例2

葡萄組織中2-甲氧基-3-異丁基吡嗪同位素豐度分析，包括以下步驟：

(1)取0.1g～1g葡萄樣品破碎、研磨并勻漿后，以10000r/min的速度離心，取上清液經(jīng)固相萃取小柱凈化濃縮。首先使用5ml～10ml甲醇和去離子水分別對小柱進(jìn)行活化。以(0.5～3)滴/秒的速度上樣10ml，之后用10ml去離子水淋洗，用甲醇(3～5)ml洗脫，待用。

(2)樣品經(jīng)前處理后進(jìn)入氣質(zhì)聯(lián)用分析。氣相色譜條件如下：色譜柱為hp-5ms毛細(xì)管柱；載氣為高純氦，流速為1.0ml/min；進(jìn)樣量0.5μl，分流比為(5～100):1；進(jìn)樣口溫度為250℃；柱升溫程序從60℃～80℃以25℃/min升至230℃～280℃。質(zhì)譜分析條件為電子轟擊離子源(ei)；掃描范圍(m/z)為50～200；離子源溫度為250℃，四級桿溫度為150℃，接口溫度為280℃；電離能量為70ev。

(3)同位素豐度的計算

a)首先，對天然豐度標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行分析。將采集的質(zhì)譜圖(圖1中c)中特征離子峰峰簇質(zhì)荷比(m/z)為124，125和126的峰強度數(shù)據(jù)記為a¹²⁴，a¹²⁵和a¹²⁶。將峰強度值代入下式歸一化可得，

a¹²⁴:a¹²⁵:a¹²⁶＝a:b:c＝100:7.5:0.45＝0.93:0.069:0.004

b)采集樣品質(zhì)譜圖中質(zhì)荷比為124和125的峰強度數(shù)據(jù)分別為100和12.1，代下式計算，解得x0和x1。

amix¹²⁴＝x0·a＝0.93·x0＝100

amix¹²⁵＝x0b+x1·a＝0.069·x1+0.93·x1＝12.1

其中：amix¹²⁴和amix¹²⁵為質(zhì)荷比為124和125的質(zhì)譜峰強度值；x0為天然豐度2-甲氧基-3-異丁基吡嗪的摩爾分?jǐn)?shù)，x1為標(biāo)記一個穩(wěn)定同位素¹³c的2-甲氧基-3-異丁基吡嗪的摩爾分?jǐn)?shù)。解得x0和x1分別為108.0和5.0，同位素豐度值以e計，e＝x1/(x0+x1)·100％＝4.4％。

實施例3

葡萄組織中2-甲氧基-3-異丙基吡嗪同位素豐度分析，包括以下步驟：

(1)取0.1g～1g葡萄樣品破碎、研磨并勻漿后，以10000r/min的速度離心，取上清液經(jīng)固相萃取小柱凈化濃縮。首先使用5ml～10ml甲醇和去離子水分別對小柱進(jìn)行活化。以(0.5～3)滴/秒的速度上樣10ml，之后用10ml去離子水淋洗，用甲醇(3～5)ml洗脫，待用。

(2)樣品經(jīng)前處理后進(jìn)入氣質(zhì)聯(lián)用分析。氣相色譜條件如下：色譜柱為hp-5ms毛細(xì)管柱；載氣為高純氦，流速為1.0ml/min；進(jìn)樣量0.5μl，分流比為(5～100):1；進(jìn)樣口溫度為250℃；柱升溫程序從60℃～80℃以25℃/min升至230℃～280℃。質(zhì)譜分析條件為電子轟擊離子源(ei)；掃描范圍(m/z)為50～200；離子源溫度為250℃，四級桿溫度為150℃，接口溫度為280℃；電離能量為70ev。

(3)同位素豐度的計算

a)首先，對天然豐度標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行分析。將采集的質(zhì)譜圖(圖1中d)中特征離子峰峰簇質(zhì)荷比(m/z)為137，138和139的峰強度數(shù)據(jù)記為a¹³⁷，a¹³⁸和a¹³⁹。將峰強度值代入下式歸一化可得，

a¹³⁷:a¹³⁸:a¹³⁹＝a:b:c＝100:8.10:0.51＝0.92:0.075:0.005

b)采集樣品質(zhì)譜圖中質(zhì)荷比為137和138的峰強度數(shù)據(jù)分別為100和14.7，代下式計算，解得x0和x1。

amix¹³⁷＝x0·a＝0.92·x0＝100

amix¹³⁸＝x0b+x1·a＝0.075·x1+0.92·x1＝14.7

其中：amix¹³⁷和amix¹³⁸為質(zhì)荷比為137和138的質(zhì)譜峰強度值；x0為天然豐度2-甲氧基-3-異丙基吡嗪的摩爾分?jǐn)?shù)，x1為標(biāo)記一個穩(wěn)定同位素¹³c的2-甲氧基-3-異丙基吡嗪的摩爾分?jǐn)?shù)。解得x0和x1分別為108.6和7.2，同位素豐度值以e計，e＝x1/(x0+x1)·100％＝6.2％。

實施例4

測定葡萄中同位素¹⁵n或¹³c標(biāo)記氨基酸及代謝物豐度的方法，采用以下步驟：

(1)氨基酸及氨基酰胺類樣品前處理

(1-1)將葡萄破碎、研磨并勻漿后加入到20g/l的磺基水楊酸溶液中，葡萄與酸溶液的比例關(guān)系為0.1g：5ml，超聲提取10min，以5000r/min的速度離心，取上清液經(jīng)固相萃取小柱凈化濃縮，固相萃取小柱的填料為混合型陽離子交換(mcx)基質(zhì)，經(jīng)spe處理后的溶液經(jīng)氮吹儀吹干，之后加入衍生化試劑n-甲基-n-(三甲基硅烷)三氟乙酰胺(mstfa)，葡萄與衍生化試劑的比例關(guān)系為0.1g：1000μl，充分混合后在40℃下反應(yīng)2小時，過濾待用；

(1-2)使用相同的前處理和衍生化步驟，對氨基酸及氨基酰胺的天然豐度標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行處理；

(2)吡嗪類樣品前處理

(2-1)將葡萄破碎、研磨并勻漿，然后以10000r/min的速度離心，取上清液經(jīng)固相萃取小柱凈化濃縮；首先使用甲醇和去離子水分別對小柱進(jìn)行活化，葡萄與活化用的甲醇和去離子水的比例關(guān)系為0.1g：1ml，再經(jīng)去離子水淋洗后用甲醇洗脫，葡萄與淋洗用去離子水的比例關(guān)系為0.1g：3ml，與洗脫用甲醇的比例關(guān)系為0.1g：3ml，過濾待用；

(2-2)使用相同的步驟對吡嗪類化合物的天然豐度標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行處理；

(3)檢測

利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀分別對經(jīng)過前處理的天然豐度標(biāo)準(zhǔn)品和葡萄樣品溶液進(jìn)行測定，選擇特征碎片離子進(jìn)行同位素豐度值的計算，利用同位素峰簇的比值計算出標(biāo)記試劑的同位素豐度值。氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀中：

氣相色譜條件為：色譜柱為hp-5毛細(xì)管柱；載氣為高純氦，流速為0.1ml/min；進(jìn)樣量0.1μl，分流比為5:1；進(jìn)樣口溫度為200℃；柱升溫程序從60℃以25℃/min升至200℃，

質(zhì)譜分析條件為：電子轟擊離子源(ei)；掃描范圍(m/z)為10；離子源溫度為150℃，四級桿溫度為150℃，接口溫度為200℃；電離能量為50ev。

步驟(3)中選擇特征碎片離子進(jìn)行同位素豐度值的計算，利用同位素峰簇的比值計算出標(biāo)記試劑的同位素豐度值具體采用以下步驟：

a)對天然豐度標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行分析，將采集的質(zhì)譜圖中特征碎片離子峰峰簇質(zhì)荷比(m/z)為m，m+1和m+2的峰強度數(shù)據(jù)記為a^m，a^m+1和a^m+2，將峰強度值代入式(1)歸一化得到a，b，c，

a^m:a^m+1:a^m+2＝a:b:c(1)

a+b+c＝1

b)采集樣品質(zhì)譜圖中質(zhì)荷比為m和m+1的峰強度數(shù)據(jù)，代入式(2)計算，解得x0和x1；

amix^m＝x0·a(2)

amix^m+1＝x0b+x1·a

其中：amix^m和amix^m+1為質(zhì)荷比為m和m+1的質(zhì)譜峰強度值；x0為天然豐度待測組分分子的摩爾分?jǐn)?shù)，x1為標(biāo)記一個穩(wěn)定同位素(¹³c或¹⁵n)的待測組分分子的摩爾分?jǐn)?shù)，同位素豐度值以e計，按公式(3)計算：

e＝x1/(x0+x1)·100％(3)。

實施例5

測定葡萄中同位素¹⁵n或¹³c標(biāo)記氨基酸及代謝物豐度的方法，采用以下步驟：

(1)氨基酸及氨基酰胺類樣品前處理

(1-1)將葡萄皮破碎、研磨并勻漿后加入到6mol/l的鹽酸水溶液中，葡萄皮與酸溶液的比例關(guān)系為1g：20ml，超聲提取45min，以10000r/min的速度離心，取上清液經(jīng)固相萃取小柱凈化濃縮，固相萃取小柱的填料為強陰離子交換(sax)基質(zhì)，經(jīng)spe處理后的溶液經(jīng)氮吹儀吹干，之后加入衍生化試劑雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(bstfa)，葡萄皮與衍生化試劑的比例關(guān)系為1g：100μl，充分混合后在80℃下反應(yīng)2小時，過濾待用；

(1-2)使用相同的前處理和衍生化步驟，對氨基酸及氨基酰胺的天然豐度標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行處理；

(2)吡嗪類樣品前處理

(2-1)將葡萄皮破碎、研磨并勻漿，然后以10000r/min的速度離心，取上清液經(jīng)固相萃取小柱凈化濃縮，固相萃取小柱的填料為混合型陽離子交換(mcx)；首先使用甲醇和去離子水分別對小柱進(jìn)行活化，葡萄皮與活化用的甲醇和去離子水的比例關(guān)系為1g：5ml，再經(jīng)去離子水淋洗后用甲醇洗脫，葡萄皮與淋洗用去離子水的比例關(guān)系為1g：10ml，與洗脫用甲醇的比例關(guān)系為1g：10ml，過濾待用；

(2-2)使用相同的步驟對吡嗪類化合物的天然豐度標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行處理；

(3)檢測

利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀分別對經(jīng)過前處理的天然豐度標(biāo)準(zhǔn)品和葡萄樣品溶液進(jìn)行測定，選擇特征碎片離子進(jìn)行同位素豐度值的計算，利用同位素峰簇的比值計算出標(biāo)記試劑的同位素豐度值。

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀中，氣相色譜條件為：色譜柱為hp-5、hp-1或db-1ms毛細(xì)管柱；載氣為高純氦，流速為2.0ml/min；進(jìn)樣量1.0μl，分流比為100:1；進(jìn)樣口溫度為300℃；柱升溫程序從80℃以40℃/min升至230℃，

質(zhì)譜分析條件為：電子轟擊離子源(ei)；掃描范圍(m/z)為500；離子源溫度為280℃，四級桿溫度為300℃，接口溫度為300℃；電離能量為100ev。

步驟(3)中選擇特征碎片離子進(jìn)行同位素豐度值的計算，利用同位素峰簇的比值計算出標(biāo)記試劑的同位素豐度值的步驟與實施例4相同。

本發(fā)明并不局限于上述特定實施方式，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在權(quán)利要求的范圍內(nèi)做出各種變形或修改，這并不影響本發(fā)明的實質(zhì)內(nèi)容。