本發(fā)明涉及成分檢測
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體地指一種維生素b12的液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜聯(lián)用檢測方法。
背景技術(shù)：
：維生素b12又稱鈷胺素或氰鈷素，是一種由含鈷的卟啉類化合物組成的b族維生素。維生素b12的檢測至今是國際上食品分析的難題之一，首先是動物食品中的維生素b12有氰鈷胺、羥鈷胺、腺苷鈷胺和甲基鈷胺等多種結(jié)構(gòu)形式，傳統(tǒng)的分析方法很難反映其實際含量；其次維生素b12在食品中的含量低，為10-9級，通常食品含量在0.4～3μg/100g；另外，維生素b12主要以維生素b12-內(nèi)因子復合物的形式存在，充分提取和分離難度很大，樣品中其他色譜行為與維生素b12相近的水溶性維生素也會對它的分離檢測造成很大干擾。目前，維生素b12的測定標準方法涉及微生物法(gb5413.14-2010食品安全國家標準嬰幼兒食品和乳品中維生素b12的測定)、高效液相色譜法(gb/t5009.217-2008保健食品中微生物b12的測定)、液相色譜法-串聯(lián)質(zhì)譜法(sn/t4258-2015出口食品中水溶性維生素的測定方法第二部分)，尚無hplc-icp/ms的方法。以往的研究表明，分光光度法成本低、靈敏度也低；微生物法檢出限低，但步驟繁瑣、費時費力、易受污染且準確度不高；原子吸收光譜法適用于測定總鈷；hplc方法檢出限較高，只適用于維生素b12含量較高的保健品的測定；高效毛細管電泳法靈敏性低，但可以測定不同形態(tài)，目前主要應(yīng)用于基礎(chǔ)和理論研究之中；lc-ms/ms靈敏度高，準確性好，檢出限低，但是基質(zhì)干擾較為嚴重。綜上所述，由于食品中維生素b12含量難以檢測，而使用其他方法存在提取不充分和準確度不高等問題。由此可見，目前尚未有一種試樣處理簡單又快速準確測定食品中維生素b12含量的方法產(chǎn)生。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的就是要克服現(xiàn)有技術(shù)靈敏度不高、檢出限高、基質(zhì)干擾嚴重的缺陷，提供一種靈敏度高、檢出限低、準確性好且操作便捷的維生素b12的液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜聯(lián)用檢測方法。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所設(shè)計的維生素b12的液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜聯(lián)用檢測方法，其步驟如下：(1)將含有維生素b12的原料經(jīng)過前處理后溶解定容，或?qū)⒃现械拟挵匪亟?jīng)過預處理得到性質(zhì)穩(wěn)定的氰鈷胺后溶解定容，得到待凈化液；(2)將待凈化液通過已活化的固相萃取柱，以低濃度的乙腈溶液洗去干擾物質(zhì)，再以高濃度的乙腈溶液將維生素b12洗脫，收集全部洗脫液，根據(jù)含量稀釋洗脫液，微孔濾膜后，得到待測液，待檢測分析；(3)進行維生素b12的hplc-icp/ms檢測，所述液相色譜中選用的色譜柱為c18色譜柱。優(yōu)選地，上述方法中，所述原料的取用量精確至0.01g。優(yōu)選地，上述方法中，所述步驟(2)中低濃度的乙腈溶液的濃度為5～10％v/v；高濃度的乙腈溶液的濃度為20～40％v/v。優(yōu)選地，上述方法中，所述c18色譜柱，液相條件：流動相為a：5～10mmol乙酸銨：b甲醇＝81:19，等度洗脫，0.4ml/min；柱溫24℃；進樣量20μl。優(yōu)選地，上述方法中，電感耦合等離子體質(zhì)譜儀的使用參數(shù)為：冷卻氣流速：14.0l/min；輔助氣流速：0.8l/min；霧化器流速：1.05l/min；碰撞氣流速：4.8ml/min；采樣錐孔徑：1.1mm；截取錐孔徑：0.5mm；霧室溫度：2℃；功率：1550w。本方法具有較低檢測下限，可以達到0.02μg/kg，如果ms的測量條件由ked模式改為std模式，該方法的檢測下限還可以提高3～5倍。而hplc-ms/ms法的檢出限為0.5μg/kg。本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明通過將高效液相色譜與電感耦合等離子體質(zhì)譜聯(lián)用，得到了一種穩(wěn)定可靠、抗基質(zhì)干擾強、檢出限低、操作簡便、快速的維生素b12檢測方法，特別適合于食品中維生素b12的測定，為食品中維生素b12的檢測分析提供了新的借鑒和參考。附圖說明圖1為采用本發(fā)明方法測定的標準溶液色譜圖。圖2為采用本發(fā)明方法測定的標準溶液得出的標準曲線。圖3為本發(fā)明方法中采用不同甲醇比例下維生素b12的色譜圖。圖4為本發(fā)明方法中流動相引入8mmol乙酸銨后對維生素b12分離的影響效果圖。具體實施方式以下結(jié)合附圖和具體實施例對本發(fā)明作進一步的詳細描述。以下本發(fā)明實施例采用的實驗設(shè)備：dionexultimate3000液相色譜儀(美國賽默飛世爾儀器公司)；c18色譜柱(美國賽默飛世爾儀器公司)；icapq電感耦合等離子體質(zhì)譜儀及其工作站(美國賽默飛世爾儀器公司)；me204電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)；ms3digital渦旋儀(德國ika公司)；centrifuge5810離心機(艾本德中國有限公司)實施例中所用試劑：維生素b12(氰鈷胺，美國sigma-aldrich公司)；乙酸銨、乙腈、甲醇、甲酸均為色譜純，鹽酸、三氯乙酸均為分析純；果汁飲料、谷物制品、含乳飲料、保健品為市售；所有用水均為超純水(自制)實施例1維生素b12的液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜聯(lián)用檢測方法，步驟如下：(1)樣品處理：樣品一：果汁樣品稱取果汁樣品10g(精確至0.01g)于25ml棕色容量瓶中，用水定容至刻度，得到待凈化液1；樣品二：谷物制品稱取谷物制品5g(精確至0.01g)于50ml離心管中，加入25ml0.01mol/l鹽酸溶液，渦旋混勻1min，超聲15min，以3900r/min離心15min，收集上清液于50ml棕色容量瓶中，固體殘留物用20ml0.01mol/l鹽酸溶液再提取一次，合并提取上清液，并用水定容至刻度，得到待凈化液2；樣品三：含乳飲料稱取含乳飲料10g(精確至0.01g)于50ml離心管中，加入10ml40g/l三氯乙酸溶液，渦旋混勻1min，超聲15min，以3900r/min離心15min，收集上清液于50ml棕色容量瓶中，用水定容至刻度，得到待凈化液3；樣品四：保健品稱取保健品0.5g(精確至0.01g)于50ml離心管中，加入25ml0.01mol/l鹽酸溶液，渦旋混勻1min，超聲15min，以3900r/min離心15min，收集上清液置于50ml棕色容量瓶中，殘留物用20ml0.01mol/l鹽酸溶液再提取一次，合并提取上清液，并用水定容至刻度，得到待凈化液4。需要說明的是，牛奶、雞蛋、肉類等食品中含有天然維生素b12，其維生素b12的形態(tài)主要為甲鈷胺及腺苷鈷胺兩種。尤其是動物內(nèi)臟中含量較高，早期維生素b12就是從動物內(nèi)臟提煉獲得的，要想準確測定該類食品維生素b12的含量，首先必須用氰化鉀將羥鈷胺素、甲鈷胺素和5-脫氧腺苷鈷胺素等轉(zhuǎn)化為較穩(wěn)定的氰鈷胺素再進行測定。對于這類產(chǎn)品在前處理過程中要加入氰化這一步驟：在150ml錐形瓶中準確稱取待測樣5～10g(準確到0.01g)，依次加入50ml乙酸鈉緩沖液、2g胃蛋白酶、0.5gtaka-淀粉酶，充分混合使樣品充分溶解，在37℃水浴30min后加入2ml氰化鉀(或氰化鈉)溶液，轉(zhuǎn)入100℃水浴中，保持60min，冷卻至室溫。(2)分別準確移取上述待凈化液1～4各10ml，通過已活化的固相萃取柱，用5ml7％v/v乙腈溶液將干擾物質(zhì)從固相萃取柱上淋洗下來，最后用3.0ml25％v/v乙腈溶液將維生素b12洗脫，收集全部洗脫液，根據(jù)含量稀釋洗脫液，過0.22μm微孔濾膜后，得到待測液，待檢測分析。(3)分別準確移取維生素b12的標準工作液5μl、10μl、25μl、50μl、100μl、125μl、250μl，用ph5.0的水溶液定容至10ml。其濃度分別為：0.5ng/ml、1.0ng/ml、2.5ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、12.5ng/ml、25ng/ml，此標準系列溶液使用前配制。(4)進行維生素b12的hplc-icp/ms檢測液相條件色譜柱：thermofisherhypersilgold(100mm×2.1mm，3μm)；流動相：a水(含8mm乙酸銨)：b甲醇＝81:19(v:v)，等度洗脫，0.4ml/min；柱溫24℃；進樣量20μl。電感耦合等離子體質(zhì)譜儀的參數(shù)設(shè)置冷卻氣流速：14.0l/min、輔助氣流速：0.8l/min、霧化器流速：1.05l/min、碰撞氣流速：4.8ml/min、采樣錐孔徑：1.1mm、截取錐孔徑：0.5mm、霧室溫度：2℃、功率：1550w。建立分析方法，按順序依次測定空白溶液、標準溶液和待測液，以時間為橫坐標，強度值為縱坐標擬合線性曲線，計算實際樣品中維生素b12的含量，多次測定之后取平均值。樣品一至四的檢測結(jié)果見表1。表1不同樣品中測定的維生素b12含量結(jié)果結(jié)果顯示維生素b12在0.1～500μg/l范圍內(nèi)呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，回歸方程為y＝14431x-416，相關(guān)系數(shù)r＝0.9999。以信噪比s/n＝3計算方法檢出限為0.02μg/kg，以s/n＝10計算定量限為0.06μg/kg。標準溶液色譜圖見圖1，標準曲線見圖2。實施例2維生素b12的液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜聯(lián)用檢測方法，步驟如下：(1)樣品處理：采用實施例1中的樣品一(果汁樣品)，處理所得的待凈化液1；(2)準確移取10ml上述待凈化液1，通過已活化的固相萃取柱，用6ml5％v/v乙腈溶液將干擾物質(zhì)從固相萃取柱上淋洗下來，最后用4ml20％v/v乙腈溶液將維生素b12洗脫，收集全部洗脫液，根據(jù)含量稀釋洗脫液，過0.22μm微孔濾膜后，得到待測液，待檢測分析。(3)分別準確移取維生素b12的標準工作液5μl、10μl、25μl、50μl、100μl、125μl、250μl，用ph5.0的水溶液定容至10ml。其濃度分別為：0.5ng/ml、1.0ng/ml、2.5ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、12.5ng/ml、25ng/ml，此標準系列溶液使用前配制。(4)進行維生素b12的hplc-icp/ms檢測液相條件色譜柱：thermofisherhypersilgold(100mm×2.1mm，3μm)；流動相：a水(含10mm乙酸銨)：b甲醇＝81:19(v:v)，等度洗脫，0.4ml/min；柱溫24℃；進樣量20μl。電感耦合等離子體質(zhì)譜儀的參數(shù)設(shè)置冷卻氣流速：14.0l/min、輔助氣流速：0.8l/min、霧化器流速：1.05l/min、碰撞氣流速：4.8ml/min、采樣錐孔徑：1.1mm、截取錐孔徑：0.5mm、霧室溫度：2℃、功率：1550w。建立分析方法，按順序依次測定空白溶液、標準溶液和待測液，以時間為橫坐標，強度值為縱坐標擬合線性曲線，計算實際樣品中維生素b12的含量，多次測定之后取平均值，結(jié)果見表2。實施例3維生素b12的液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜聯(lián)用檢測方法，步驟如下：(1)樣品處理：采用實施例1中的樣品一(果汁樣品)，處理所得的待凈化液1；(2)準確移取10ml上述待凈化液1，通過已活化的固相萃取柱，用5ml10％v/v乙腈溶液將干擾物質(zhì)從固相萃取柱上淋洗下來，最后用3.0ml40％v/v乙腈溶液將維生素b12洗脫，收集全部洗脫液，根據(jù)含量稀釋洗脫液，過0.22μm微孔濾膜后，待檢測分析。(3)分別準確移取維生素b12的標準工作液5μl、10μl、25μl、50μl、100μl、125μl、250μl，用ph5.0的水溶液定容至10ml。其濃度分別為：0.5ng/ml、1.0ng/ml、2.5ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、12.5ng/ml、25ng/ml，此標準系列溶液使用前配制。(4)進行維生素b12的hplc-icp/ms檢測液相條件色譜柱：thermofisherhypersilgold(100mm×2.1mm，3μm)；流動相：a水(含5mm乙酸銨)：b甲醇＝81:19(v:v)，等度洗脫，0.4ml/min；柱溫24℃；進樣量20μl。電感耦合等離子體質(zhì)譜儀的參數(shù)設(shè)置冷卻氣流速：14.0l/min、輔助氣流速：0.8l/min、霧化器流速：1.05l/min、碰撞氣流速：4.8ml/min、采樣錐孔徑：1.1mm、截取錐孔徑：0.5mm、霧室溫度：2℃、功率：1550w。建立分析方法，按順序依次測定空白溶液、標準溶液和待測液，以時間為橫坐標，強度值為縱坐標擬合線性曲線，計算實際樣品中維生素b12的含量，多次測定之后取平均值，結(jié)果見表2。上述實施例2、3及與實施例1的結(jié)果比較表如下。表2不同洗脫條件及液相情況下測定結(jié)果從結(jié)果上看實施例1、2、3均能準確的測定樣品一中維生素b12的值，只不過，相對于實施例2、3，實施例1的方法能夠用時較少或試劑用量少或出峰的峰型更佳，綜合效果較好。試驗例1精密度、重復性和穩(wěn)定性：同一標準品溶液由同一操作者在同一實驗室中的同一設(shè)備上應(yīng)用本發(fā)明方法單獨測試，連續(xù)進樣6次，結(jié)果見表3，相對標準偏差rsd<0.10％。平行制備同一濃度混合標準品6份，由同一操作者在同一實驗室中的同一設(shè)備上應(yīng)用同一方法單獨測試，結(jié)果見表4，相對標準偏差rsd<1.5％。同一標準品溶液由同一操作者在同一實驗室中的同一設(shè)備上應(yīng)用同一方法單獨測試，分別在0、1、2、4、8、12、24、36、48h進樣，結(jié)果見表5，相對標準偏差rsd<1.0％。表3精密度實驗精密度峰面積/cps保留時間/s1354,727.68274.32354,047.99273.93354,090.94272.84354,596.03272.75354,630.12272.76354,158.45272.9rsd0.090.26表4重復性實驗重復性峰面積/cps保留時間/s1364,727.68273.12354,047.99272.93354,090.94272.84354,796.03274.15354,630.12272.96358,158.45273.9rsd1.180.20表5穩(wěn)定性實驗試驗例2：回收率以實施例1～4做加標回收試驗，結(jié)果見表6。表6回收率實驗(n＝6)試驗結(jié)果：維生素b12在0.1～500μg/l范圍內(nèi)線性良好，回歸系數(shù)r＞0.999，回收率為81.3％～103.6％，rsd為0.4％～4.6％(n＝6)，精密度、重復性和穩(wěn)定性rsd均小于3％。方法檢出限為0.02μg/kg，使得該方法能應(yīng)用于某些食品或強化食品中維生素b12的檢測。試驗例3：流動相的影響1)甲醇在流動相中不同占比對結(jié)果的影響本實驗選用c18色譜柱進行樣品分離，樣品為前述實施例1中的樣品一，采用本發(fā)明方法測定，其中允許選擇甲醇、乙腈等有機溶劑作為流動相，但icp-ms的聯(lián)用約束了含大量碳元素溶劑的使用。如乙腈溶劑，雖然有相關(guān)實驗表明，外加氧氣可以帶走碳，但同時會導致靈敏度下降。因此，本試驗采用甲醇作為流動相。通過比較不同比例的甲醇：8mmol/l乙酸銨水溶液(19:81、15:85、23：77)(v:v)，結(jié)果圖見圖3。甲醇比例為19％時，維生素b12在300s內(nèi)完全基線分離，峰型對稱且尖銳。當甲醇比例調(diào)整為15％時，維生素b12在色譜柱里有較強保留。增加甲醇比例至23％時，維生素b12在150s完全基線分離，峰型保持對稱尖銳，且儀器的靈敏性沒有降低，碳滯留問題沒有出現(xiàn)。但是高甲醇含量可能會引起碳滯留，以及提高成本，因此綜合考慮，本實驗選擇19％的甲醇作為流動相。2)流動相中乙酸銨的引入對結(jié)果的影響本實驗選用c18色譜柱進行樣品分離，樣品為前述實施例1中的樣品一，采用本發(fā)明方法測定，通過比較甲醇流動相及引入8mmol/l乙酸銨(甲醇：8mmol/l乙酸銨水溶液＝19:81)的效果如圖4所示。一方面，添加乙酸銨后維生素b12的峰型稍有改善；另一方面，乙酸銨的一個重要功能是保持流動相ph值為6.2。有研究報導，維生素b12在ph值4.5～5.0弱酸條件下最穩(wěn)定，流動相ph值變維生素b12的色譜行為。但本實驗發(fā)現(xiàn)，將流動相ph值調(diào)至5.0時，維生素b12的響應(yīng)和峰型幾乎沒有變化，通過48h實驗，穩(wěn)定性也幾乎相同，而添加8mmol/l的乙酸銨是一個比較合適的濃度。當前第1頁12