本發(fā)明涉及一種甘露聚糖含量的測定方法，具體涉及一種酵母培養(yǎng)物中甘露聚糖含量的測定方法。

背景技術：

酵母培養(yǎng)物是一種微生態(tài)制劑，是指在特定工藝條件控制下，在特定培養(yǎng)基上經(jīng)充分厭氧發(fā)酵后所形成的微生態(tài)制品。其主要作用成分是酵母利用固體基質(zhì)發(fā)酵所產(chǎn)生的細胞外代謝產(chǎn)物、發(fā)酵后變性的固體基質(zhì)、酵母細胞內(nèi)容物以及酵母細胞壁等。該產(chǎn)品成分復雜，主要包括小肽、有機酸、維生素、增味物質(zhì)、甘露寡糖、β-葡聚糖和氨基酸以及“未知促生長因子”等，這些物質(zhì)是動物胃腸道內(nèi)微生物的絕好營養(yǎng)底物，可以有效刺激有益菌的生長，激發(fā)它們的代謝活性，穩(wěn)定體內(nèi)微生態(tài)環(huán)境，進而提高動物的生產(chǎn)性能。酵母培養(yǎng)物能夠發(fā)揮功效，其中酵母細胞壁是一個不可忽視的部分，酵母細胞壁結構(圖1)堅韌，主要構成為葡聚糖、甘露聚糖、蛋白質(zhì)、幾丁質(zhì)、脂類等，像三明治，外層為甘露聚糖，內(nèi)層為葡聚糖，中間夾有一層蛋白質(zhì)分子，細胞壁的少量組分幾丁質(zhì)并不是所有的酵母菌中都有，其含量也因種而已。而甘露聚糖是酵母細胞壁重要的多糖成分之一，占細胞壁干重的40％左右，賦予細胞生物學活性和控制細胞壁孔徑。甘露聚糖以共價鍵形式與蛋白質(zhì)連在一起，由5％～20％蛋白質(zhì)，80％～90％甘露糖組成，因此又稱之為甘露聚糖蛋白，其相對分子量為20000～200000，主鏈為單鏈，糖苷鍵形式為α-1,6連接，主鏈上連有豐富的支鏈，是由甘露糖、甘露二糖、甘露三糖和甘露四糖組成，糖苷鍵形式為α-1,2或α-1,3連接。甘露聚糖是免疫功能最強的酵母細胞壁多糖，它能增加動物體液免疫和細胞免疫能力，調(diào)節(jié)腸道菌群平衡，結合吸附外源性病原菌，并具有抗輻射、抗氧化、抗腫瘤等活性功能，是酵母培養(yǎng)物中的重要的功效成分之一。因此，酵母甘露聚糖的含量被認為是評價酵母培養(yǎng)物品質(zhì)的一項重要指標。

目前，對甘露糖含量的測定一般采用苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法，但采用上述方法用于測定酵母培養(yǎng)物中的甘露聚糖含量時，得到的結果是總的還原糖，不能排除其他糖類的干擾，專一性差，測定結果不能準確反映樣品中甘露聚糖的實際含量。另外，單糖類物質(zhì)也可使用糖分析柱結合利用示差檢測器檢測，但糖柱不耐用，對應的示差檢測器靈敏度較低，不適合檢測酵母培養(yǎng)物中的甘露聚糖。而同時由于在測定酵母培養(yǎng)物中甘露聚糖含量時，甘露聚糖所在酵母細胞壁較厚，不能直接利用上述方法。

鑒于此，本發(fā)明的目的在于提出一種適用于酵母培養(yǎng)物中甘露聚糖含量的綜合分析檢測方法，為酵母培養(yǎng)物的開發(fā)和應用提供技術保障。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是通過以下技術方案實現(xiàn)的，一種酵母培養(yǎng)物中甘露聚糖含量的測定方法，包括以下步驟：

(1)將酵母培養(yǎng)物進行預處理使其中的酵母細胞壁破壁；

(2)將步驟(1)中所述預處理后的樣品在酸性條件下進行水解反應，使酵母細胞壁多糖水解為單糖，其中的甘露聚糖水解成甘露糖；

(3)將步驟(2)中所述水解反應后溶液的酸堿度調(diào)成中性后，與相應的衍生化試劑在一定條件下進行衍生化反應，使其中的單糖衍生化；然后以甘露糖為標準品，將其標準品溶液在相同條件下進行衍生化反應；

(4)將步驟(3)中所述衍生化后的樣品溶液和標準品溶液經(jīng)反相高效液相色譜進行分析檢測；

(5)根據(jù)步驟(4)中所得到的色譜數(shù)據(jù)計算出樣品中甘露糖的質(zhì)量，再換算成甘露聚糖的含量。

進一步，步驟(1)中，所述酵母細胞壁破壁是采用均質(zhì)處理、超聲處理或酶解處理。

進一步，均質(zhì)處理是將酵母培養(yǎng)物和超純水以1:3～1:7的比例混勻后，用均質(zhì)機經(jīng)轉(zhuǎn)速3000～12000r/min條件下均質(zhì)處理5～12min；所述超聲處理是將酵母培養(yǎng)物和超純水以1:10～1:20的比例混勻后，在超聲功率100～150w條件下超聲30～50min；所述酶解處理是是將酵母培養(yǎng)物和超純水以1:4～1:10的比例混勻后，β-葡聚糖酶和蝸牛酶按比例3:1添加，添加量在5～13mg/ml，酶解ph4.0～6.0，酶解溫度40～60℃，酶解時間2～8h。

進一步，步驟(2)中，在硫酸或鹽酸條件進行水解反應。

進一步，所述硫酸水解是按照樣品和72％硫酸的使用比例為每20mg酵母培養(yǎng)物用70～100ul的72％硫酸，在耐壓玻璃密封管樣品和硫酸混合后靜置1～3h，之后加入5～8倍體積的超純水，密封耐壓玻璃密封管后在100℃下水解3～8h，水解完成用冰水冷卻之后用6m氫氧化鈉溶液調(diào)為中性；所述鹽酸水解是按照樣品和2mol/l鹽酸的使用比例為每20mg酵母培養(yǎng)物用的2～5ml的2mol/l鹽酸，將樣品和鹽酸混合均勻后在密封管中100℃下水解1～10h，水解完成后用冰水冷卻之后用2m氫氧化鈉溶液調(diào)為中性。

進一步，步驟(3)中，所述衍生化試劑為1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮。

進一步，將等體積的甘露糖標準溶液或試樣溶液、0.5mol/l現(xiàn)配現(xiàn)用的pmp甲醇溶液、0.3mol/lnaoh溶液，置于具塞離心管中，充分混勻后于60～90℃水浴衍生化反應30～90min，放冷后加入過量的0.3mol/l鹽酸溶液，混勻，用三氯甲烷萃取出過量的pmp，最后將水層液離心后，取上清液待測。

進一步，步驟(4)中，所述反相高效液相色譜的色譜條件是以0.1mol/lph5.5乙酸銨緩沖液與乙腈按照體積比80/20～60/40組成流動相洗脫，流速為0.5～1.5ml/min，反相色譜柱選用c18柱分離，紫外檢測器在紫外波長250nm下檢測。每份樣品平行檢測3次。

進一步，步驟(5)中，所述樣品中甘露聚糖的含量按式ⅰ計算：

式ⅰ中：

x：甘露聚糖含量％；

a1：衍生化反應后的標樣溶液中，甘露糖峰面積的平均值；

a2：衍生化反應后的樣品溶液中，甘露糖峰面積的平均值；

m1：甘露糖標樣的質(zhì)量，g；

m2：樣品溶液中酵母培養(yǎng)物的質(zhì)量，g；

p：甘露糖標樣中甘露糖的質(zhì)量百分含量；

0.9：甘露糖和甘露聚糖的換算系數(shù)；

計算結果精確至0.1％。

本發(fā)明通過預處理使酵母細胞充分破壁，無需外在成分的影響，干擾小，使得甘露聚糖能在酸性條件下充分水解，然后單糖衍生化后利用反相色譜柱進行分離，并選用紫外檢測器能更加靈敏的檢測出單糖衍生物。

本發(fā)明的優(yōu)點在于以外標法計算能夠準確地測定酵母培養(yǎng)物中甘露聚糖的含量，干擾小，專一性高且測定方法簡便，適用于酵母培養(yǎng)物及類似樣品中甘露聚糖的含量測定。實驗表明，本發(fā)明測定方法中甘露糖濃度在1.0～100mg/l范圍內(nèi)與對應峰面積呈線性關系(r²＝0.99)，甘露聚糖添加回收率可達96.3％～102.6％，相對標準偏差2.5％，甘露聚糖最低檢出限可達0.11mg/l。

附圖說明

通過閱讀下文優(yōu)選實施方式的詳細描述，各種其他的優(yōu)點和益處對于本領域普通技術人員將變得清楚明了。附圖僅用于示出優(yōu)選實施方式的目的，而并不認為是對本發(fā)明的限制。而且在整個附圖中，用相同的參考符號表示相同的部件。在附圖中：

圖1為酵母細胞壁結構圖。

圖2為酵母培養(yǎng)物中甘露聚糖測定流程。

圖3為甘露糖標準溶液的hplc色譜圖。

圖4為樣品甘露糖pmp衍生物的hplc色譜圖。

圖5為甘露糖標準曲線。

具體實施方式

下面將參照附圖更詳細地描述本公開的示例性實施方式。雖然附圖中顯示了本公開的示例性實施方式，然而應當理解，可以以各種形式實現(xiàn)本公開而不應被這里闡述的實施方式所限制。相反，提供這些實施方式是為了能夠更透徹地理解本公開，并且能夠?qū)⒈竟_的范圍完整的傳達給本領域的技術人員。

1、儀器

島津lc-20a高效液相色譜儀；高速均質(zhì)機(昂尼ad200l-p)；pb-10型ph計(賽多利斯)；臺式離心機(上海安亭科學儀器廠)；超聲波破碎儀(新芝jy92-iin)。

2、實驗試劑

甲醇(色譜純)、乙腈(色譜純)、氯仿(分析純)、鹽酸(分析純)、乙酸(分析純)、氫氧化鈉(分析純)、乙酸銨(分析純)、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(分析純)、超純水、甘露糖標準品(含量98％，上海源葉生物)、甘露聚糖標準品(含量98％，上海源葉生物)、β-葡聚糖酶和蝸牛酶(合肥博美生物科技有限責任公司)。

3、標準溶液配制

準確稱取甘露糖標準品0.05g(精確到0.0001g)于100ml容量瓶中，加水溶解后定容到100ml容量瓶中，作為標準儲備溶液。用前取10ml儲備溶液定容到100ml容量瓶中作為標準溶液。

實施例1

1、酵母培養(yǎng)物樣品均質(zhì)預處理、硫酸水解

準確稱取酵母培養(yǎng)物樣品4.5g于燒杯中，加水至30g(準確至0.0001g)，然后采用高速均質(zhì)機10000r/min條件下處理10min；接著準確稱取所得均質(zhì)液中的0.5g作為試樣，放入25ml耐壓反應管中，加入72％硫酸2.5ml，搖勻靜置1～3h，加超純水15ml后，密封耐壓反應管在100℃下攪拌水解4h，水解完成后將反應管用冰水冷卻，然后將水解液移入容量瓶中，定容到100ml；接著取其中10ml試樣溶液用6m的naoh溶液調(diào)為中性，再定容到100ml，作為待測樣品溶液。

2、衍生化

取甘露糖標準溶液或待測樣品溶液、0.5mol/lpmp甲醇溶液(須現(xiàn)配現(xiàn)用)、0.3mol/lnaoh溶液各400μl，置于10ml具塞離心管中，充分混勻后于70℃水浴衍生化反應30min，放冷后加入0.3mol/l鹽酸溶液500μl，混勻，用三氯甲烷萃取出過量的pmp，每次用2.5ml三氯甲烷洗滌4次，最后將水層液離心后，取上清液待測。

3、樣品的測定

(1)色譜條件

色譜柱c18bondapak300mm×4.9mm；流動相：0.1mol/l乙酸銨緩沖液ph5.5-乙腈(v/v,70:30)；流速：1.0ml/min；柱溫：35℃；檢測波長：250nm；進樣量：20μl。

(2)樣品測定

在同樣的色譜條件下，將樣品和標準品分別注入色譜儀中，記錄各色譜峰的峰面積，每份樣品重復三次結果取平均值。

試樣中甘露聚糖的含量按式(ⅰ)計算：

式ⅰ中：

x：甘露聚糖含量％；

a1：衍生化反應后的標樣溶液中，甘露糖峰面積的平均值；

a2：衍生化反應后的樣品溶液中，甘露糖峰面積的平均值；

m1：甘露糖標樣的質(zhì)量，g；

m2：樣品溶液中酵母培養(yǎng)物的質(zhì)量，g；

p：甘露糖標樣中甘露糖的質(zhì)量百分含量；

以上酵母培養(yǎng)物中甘露聚糖測定流程見圖2。

4、實驗結果分析

(1)色譜分離

以實施例1方法及色譜條件下所得甘露糖和酵母培養(yǎng)物hplc色譜圖，如圖3、4所示，圖3中峰1表示甘露糖標準溶液對應的色譜峰，圖4中峰1表示樣品甘露糖對應的色譜峰。由圖4可知，甘露糖pmp衍生物的分離度大于1.5(當分離度r＝1.5時，兩組分分離程度可以達到99.7％，通常r＝1.5作為相鄰兩組分完全分離的指標)，分離效果良好，基線呈水平狀，峰形對稱。

(2)線性相關度和標準曲線

按照實施例1方法及色譜條件下，測定一系列濃度梯度的甘露糖標準品色譜圖。以甘露糖標準溶液濃度(mg/l)為橫坐標x，以對應的色譜峰面積(v·s)為縱坐標y，繪制標準曲線，見圖5。

通過標準曲線可知(圖5)，甘露糖濃度在1.0～100mg/l范圍內(nèi)與對應峰面積呈線性關系，線性回歸方程y＝0.014x+0.006及相關系數(shù)(r²＝0.99)。

(3)方法精密度、添加回收率和最低檢測限

取酵母培養(yǎng)物樣品，按上述處理方法和色譜條件進行5次平行測定，測得結果,并通過統(tǒng)計求出相對標準偏差。結果表明，通過實施例1方法測定的所選取的酵母培養(yǎng)物樣品的甘露聚糖的含量為0.80％，相對標準偏差2.5％。

取已知準確含量的酵母培養(yǎng)物樣品，加入一定量的甘露聚糖標準品，然后按照實施例1處理方法和色譜條件進行測定，重復處理5次，測得結果以(測定值－本底值)/添加值＝回收率，計算得到其添加回收率為96.3～102.6％。按照3倍信噪比通過換算得到甘露聚糖最低檢測限(s/n＝3)為0.11mg/l。

實施例2

1、酵母培養(yǎng)物樣品超聲預處理、硫酸水解

準確稱取酵母培養(yǎng)物樣品4.5g于燒杯中，加水至30g(準確至0.0001g)，然后在超聲功率100w條件下超聲35min；接著準確稱取所得超聲液中的0.5g作為試樣，放入25ml耐壓反應管中，加入72％硫酸2.5ml，搖勻靜置1～3h，加超純水18ml后，密封耐壓反應管在100℃下攪拌水解5h，水解完成后將反應管用冰水冷卻，然后將水解液移入容量瓶中，定容到100ml；接著取其中10ml試樣溶液用6m的naoh溶液調(diào)為中性，再定容到100ml，作為待測樣品溶液。

2、衍生化

取甘露糖標準溶液或待測樣品溶液、0.5mol/lpmp甲醇溶液(須現(xiàn)配現(xiàn)用)、0.3mol/lnaoh溶液各400μl，置于10ml具塞離心管中，充分混勻后于75℃水浴衍生化反應35min，放冷后加入0.3mol/l鹽酸溶液500μl，混勻，用三氯甲烷萃取出過量的pmp，每次用2.5ml三氯甲烷洗滌4次，最后將水層液離心后，取上清液待測。

3、樣品的測定

(1)色譜條件

色譜柱c18bondapak300mm×4.9mm；流動相：0.1mol/l乙酸銨緩沖液ph5.5-乙腈(v/v,80:20)；流速：1.1ml/min；柱溫：35℃；檢測波長：250nm；進樣量：20μl。

(2)樣品測定

在同樣的色譜條件下，將樣品和標準品分別注入色譜儀中，記錄各色譜峰的峰面積，每份樣品重復兩次結果取平均值。

試樣中甘露聚糖的含量按式(ⅰ)計算：

式ⅰ中：

x：甘露聚糖含量％；

a1：衍生化反應后的標樣溶液中，甘露糖峰面積的平均值；

a2：衍生化反應后的樣品溶液中，甘露糖峰面積的平均值；

m1：甘露糖標樣的質(zhì)量，g；

m2：樣品溶液中酵母培養(yǎng)物的質(zhì)量，g；

p：甘露糖標樣中甘露糖的質(zhì)量百分含量；

計算得到酵母培養(yǎng)物樣品的甘露聚糖的含量為0.86％，相對標準偏差2.0％，添加回收率為96.6～101.9％。按照3倍信噪比通過換算得到甘露聚糖最低檢測限(s/n＝3)為0.12mg/l。

實施例3

1、酵母培養(yǎng)物樣品酶解預處理、鹽酸水解

準確稱取酵母培養(yǎng)物樣品4.5g于燒杯中，加水至30g(準確至0.0001g)，然后將β-葡聚糖和木瓜蛋白酶復合酶按比例3:1添加量，酶解ph6.0，酶解溫度60℃，酶解時間3h；接著準確稱取所得酶解液中的0.5g作為試樣，放入100ml耐壓反應管中，加入2mol/l鹽酸50ml,混合均勻后，密封耐壓反應管在100℃下攪拌水解4h，水解完成后將反應管用冰水冷卻，然后將水解液移入容量瓶中，定容到100ml；接著取其中10ml試樣溶液用6m的naoh溶液調(diào)為中性，再定容到100ml，作為待測樣品溶液。

2、衍生化

取甘露糖標準溶液或待測樣品溶液、0.5mol/lpmp甲醇溶液(須現(xiàn)配現(xiàn)用)、0.3mol/lnaoh溶液各400μl，置于10ml具塞離心管中，充分混勻后于60℃水浴衍生化反應40min，放冷后加入0.3mol/l鹽酸溶液500μl，混勻，用三氯甲烷萃取出過量的pmp，每次用2.5ml三氯甲烷洗滌4次，最后將水層液離心后，取上清液待測。

3、樣品的測定

(1)色譜條件

色譜柱c18bondapak300mm×4.9mm；流動相：0.1mol/l乙酸銨緩沖液ph5.5-乙腈(v/v,78:22)；流速：0.9ml/min；柱溫：35℃；檢測波長：250nm；進樣量：20μl。

(2)樣品測定

在同樣的色譜條件下，將樣品和標準品分別注入色譜儀中，記錄各色譜峰的峰面積，每份樣品重復兩次結果取平均值。

試樣中甘露聚糖的含量按式(ⅰ)計算：

式ⅰ中：

x：甘露聚糖含量％；

a1：衍生化反應后的標樣溶液中，甘露糖峰面積的平均值；

a2：衍生化反應后的樣品溶液中，甘露糖峰面積的平均值；

m1：甘露糖標樣的質(zhì)量，g；

m2：樣品溶液中酵母培養(yǎng)物的質(zhì)量，g；

p：甘露糖標樣中甘露糖的質(zhì)量百分含量；

計算得到酵母培養(yǎng)物樣品的甘露聚糖的含量為0.85％，相對標準偏差3.0％，添加回收率為95.6～102.1％。按照3倍信噪比通過換算得到甘露聚糖最低檢測限(s/n＝3)為0.10mg/l。

以上所述，僅為本發(fā)明較佳的具體實施方式，但本發(fā)明的保護范圍并不局限于此，任何熟悉本技術領域的技術人員在本發(fā)明揭露的技術范圍內(nèi)，可輕易想到的變化或替換，都應涵蓋在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。因此，本發(fā)明的保護范圍應以所述權利要求的保護范圍為準。