本發(fā)明涉及一種重組人溶菌酶的反相高效液相色譜分析方法。

背景技術(shù)：

高效液相色譜法系采用高壓輸液泵將規(guī)定的流動(dòng)相泵入裝有填充劑的色譜柱，對(duì)供試品進(jìn)行分離測(cè)定的色譜方法。

注入的供試品，由流動(dòng)相帶入柱內(nèi)，當(dāng)流動(dòng)相中攜帶的混合物流經(jīng)固定相時(shí)，其與固定相發(fā)生相互作用。由于混合物中各組分在性質(zhì)和結(jié)構(gòu)上的差異，與固定相之間產(chǎn)生的作用力的大小、強(qiáng)弱不同，隨著流動(dòng)相的移動(dòng)，混合物在兩相間經(jīng)過(guò)反復(fù)多次的分配平衡，使得各組分被固定相保留的時(shí)間不同，從而按一定次序由流動(dòng)相帶出，實(shí)現(xiàn)混合物中各組分的分離并依次進(jìn)入檢測(cè)器，檢測(cè)由積分儀或數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)記錄和處理色譜信號(hào)。

反相高效液相色譜法：流動(dòng)相的極性大于固定相的極性，即以非極性鍵合相為固定相(常以十八硅烷C18、辛烷C8、甲基C1、苯基等作為固定相)；水或緩沖液，加入甲醇、乙腈、異丙醇、丙酮、四氫呋喃等與水互溶的有機(jī)溶劑為流動(dòng)相用以分離檢測(cè)相關(guān)物質(zhì)的高效液相色譜法。

在生物醫(yī)藥及蛋白質(zhì)檢測(cè)分析領(lǐng)域，反相高效液相色譜法被廣泛應(yīng)用于目標(biāo)物質(zhì)的分析及定量檢測(cè)。重組人溶菌酶這種蛋白質(zhì)具有其特殊的理化性質(zhì)，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)用反相高效液相色譜法分析檢測(cè)時(shí)存在以下問(wèn)題：(1)重組人溶菌酶分子量為14000Da，分子量相對(duì)較大，用常用的反相C18柱分析經(jīng)常出現(xiàn)蛋白與填料結(jié)合過(guò)強(qiáng)而導(dǎo)致無(wú)法洗脫，無(wú)法正常分析并且損毀色譜柱；(2)重組人溶菌酶為鹽溶性蛋白，在100mM以上的氯化鈉水溶液中溶解性良好，低于100mM的氯化鈉水溶液中重組人溶菌酶溶液會(huì)呈現(xiàn)懸濁狀態(tài)；常用的反相高效液相色譜的流動(dòng)相中不使用高濃度的氯化鈉，這將導(dǎo)致分析過(guò)程中重組人溶菌酶處于不完全溶解狀態(tài)，即使有色譜峰也無(wú)法準(zhǔn)確反映其量效關(guān)系，并且不完全溶解的蛋白也會(huì)損壞色譜系統(tǒng)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種重復(fù)性和定量分析的準(zhǔn)確度高的重組人溶菌酶的反相高效液相色譜分析方法。

解決上述技術(shù)問(wèn)題采用的技術(shù)方案由下述步驟組成：

1、將重組人溶菌酶標(biāo)準(zhǔn)品溶解于質(zhì)量濃度為0.9％的氯化鈉超純水溶液中，配制成重組人溶菌酶標(biāo)準(zhǔn)品溶液，采用反相高效液相色譜對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行分析，色譜分析條件：色譜柱為C18反相色譜柱，填料為孔徑20～50nm、粒徑2～10μm的十八烷基硅烷鍵合硅膠，流動(dòng)相A是氯化鈉質(zhì)量濃度為0.9％、三氟乙酸體積濃度為0.1％的超純水溶液，流動(dòng)相B是乙腈與超純水體積比為6:4的混合液且混合液中含有質(zhì)量濃度為0.9％的氯化鈉和體積濃度為0.1％的三氟乙酸，進(jìn)行梯度洗脫，流動(dòng)相梯度A:B由(90～0):(10～100)到(50～0):(50～100)，檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm，流速為1mL/分鐘；繪制色譜主峰面積隨重組人溶菌酶濃度變化的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2、將待測(cè)重組人溶菌酶樣品溶解于質(zhì)量濃度為0.9％的氯化鈉超純水溶液中，用濾膜過(guò)濾，收集濾液，采用反相高效液相色譜對(duì)濾液進(jìn)行分析，色譜分析條件與步驟1相同。

3、根據(jù)步驟2得到的色譜主峰面積，結(jié)合步驟1確定的標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性方程即可得到待測(cè)重組人溶菌酶樣品中重組人溶菌酶的濃度。

上述步驟1中，所述的流動(dòng)相梯度優(yōu)選0到30分鐘A:B由55:45到5:95。

上述步驟1中，所述的填料優(yōu)選孔徑30nm、粒徑5μm的十八烷基硅烷鍵合硅膠。

本發(fā)明的有益效果如下：

1、本發(fā)明采用孔徑20～50nm、粒徑2～10μm的十八烷基硅烷鍵合硅膠作為色譜柱的填料，既可以讓重組人溶菌酶這種大分子蛋白在柱上有一定的保留時(shí)間，又不會(huì)讓該蛋白與填料結(jié)合過(guò)強(qiáng)而導(dǎo)致無(wú)法洗脫。

2、本發(fā)明通過(guò)在流動(dòng)相中添加氯化鈉，從而保證在反相高效液相色譜分析過(guò)程中重組人溶菌酶的溶解性，使其能夠與流動(dòng)相完全混溶，保證了色譜峰的踏板數(shù)、對(duì)稱性、重復(fù)性、定量分析的準(zhǔn)確度。

3、本發(fā)明在配制流動(dòng)相B時(shí)先將氯化鈉完全溶于超純水中，然后與乙腈混溶，以避免氯化鈉在乙腈中不溶，所采用的配比保證了流動(dòng)相B良好的溶解性及在整體分析過(guò)程中A、B流動(dòng)相之間良好的混溶性。

4、本發(fā)明方法的重復(fù)性良好，準(zhǔn)確度高，檢出限低，重復(fù)性、系統(tǒng)適用性、填料的孔徑粒徑選擇，流動(dòng)相的配方均符合《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版三部附錄III B高效液相色譜法要求，可用于重組人溶菌酶的分析與定量檢測(cè)。

附圖說(shuō)明

圖1是線性與范圍試驗(yàn)中重組人溶菌酶濃度與色譜主峰面積的關(guān)系曲線。

圖2是準(zhǔn)確度試驗(yàn)中重組人溶菌酶濃度與色譜主峰面積的關(guān)系曲線。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不僅限于這些實(shí)施例。

實(shí)施例1

1、精確稱量重組人溶菌酶標(biāo)準(zhǔn)品2896.0mg，其中含重組人溶菌酶150.0mg，加入質(zhì)量濃度為0.9％的氯化鈉超純水定容至50.0mL容量瓶中，配制成重組人溶菌酶濃度為3.0mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液；然后用5.0mL容量瓶、質(zhì)量濃度為0.9％的氯化鈉超純水溶液精密稀釋8個(gè)樣品濃度，分別為：0.30mg/mL、0.60mg/mL、0.90mg/mL、1.20mg/mL、1.50mg/mL、1.80mg/mL、2.10mg/mL、2.40mg/mL，采用反相高效液相色譜對(duì)稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行分析，色譜分析條件：色譜柱為C18反相色譜柱，填料為孔徑30nm、粒徑5μm的十八烷基硅烷鍵合硅膠，流動(dòng)相A是氯化鈉質(zhì)量濃度為0.9％、三氟乙酸體積濃度為0.1％的超純水溶液，流動(dòng)相B是乙腈與超純水體積比為6:4的混合液且混合液中含有質(zhì)量濃度為0.9％的氯化鈉和體積濃度為0.1％的三氟乙酸，進(jìn)行梯度洗脫，流動(dòng)相梯度選擇0到30分鐘A:B由55:45到5:95，檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm，流速為1mL/分鐘，上樣量為20μL；根據(jù)檢測(cè)結(jié)果依次計(jì)算塔板數(shù)、拖尾因子、色譜峰主峰面積，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1重組人溶菌酶線性與范圍色譜檢測(cè)統(tǒng)計(jì)結(jié)果

根據(jù)表1的計(jì)算結(jié)果繪制色譜主峰面積隨重組人溶菌酶濃度變化的標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見(jiàn)圖1。標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性方程為：y＝2435x+29044，式中x代表重組人溶菌酶濃度，y代表色譜主峰面積，R²＝0.99964，線性良好，且踏板數(shù)、對(duì)稱性均符合《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版三部附錄III B高效液相色譜法的要求。

精確稱量重組人溶菌酶標(biāo)準(zhǔn)品96.53mg，其中含重組人溶菌酶5.0mg，加入質(zhì)量濃度為0.9％的氯化鈉超純水溶液定容至5.0mL容量瓶中，配制成重組人溶菌酶濃度為1.0mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液；用5.0mL容量瓶、質(zhì)量濃度為0.9％的氯化鈉超純水溶液精密稀釋至濃度分別為：1.0×10^-3mg/mL、1.0×10^-4mg/mL、1.0×10^-5mg/mL、1.0×10^-6mg/mL，采用反相高效液相色譜對(duì)稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行分析，色譜分析條件與上述相同，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2重組人溶菌酶檢測(cè)限與定量限色譜檢測(cè)統(tǒng)計(jì)結(jié)果

由表2可見(jiàn)，重組人溶菌酶濃度為1.0×10^-5mg/mL時(shí)，主峰保留時(shí)間為14.86min，高度為0.43mV，基線噪音高度約為0.04mV，信噪比約為11:1，重組人溶菌酶濃度為1.0×10^-6mg/mL時(shí)，主峰保留時(shí)間為14.86min，高度為0.26mV，基線噪音高度約為0.04mV，信噪比約為6:1，說(shuō)明該色譜條件下，重組人溶菌酶上樣量為6.0～48.0μg范圍內(nèi)，線性良好，重組人溶菌酶的定量限為1.0×10^-5mg/mL×20μL即0.2ng，檢測(cè)限為1.0×10^-6mg/mL×20μL即0.02ng。

2、將待測(cè)重組人溶菌酶樣品溶解于質(zhì)量濃度為0.9％的氯化鈉超純水溶液中，用濾膜過(guò)濾，收集濾液，采用反相高效液相色譜對(duì)濾液進(jìn)行分析，色譜分析條件與步驟1相同。

3、根據(jù)步驟2得到的色譜主峰面積，結(jié)合步驟1確定的標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性方程即可得到待測(cè)重組人溶菌酶樣品中重組人溶菌酶的濃度。

為了證明本發(fā)明分析方法的重復(fù)性和準(zhǔn)確性，發(fā)明人進(jìn)行了大量的實(shí)驗(yàn)室研究試驗(yàn)，具體試驗(yàn)情況如下：

1、重復(fù)性試驗(yàn)

精密配制重組人溶菌酶濃度為1.5mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，連續(xù)進(jìn)樣8次，每次上樣量20μL，按照實(shí)施例1步驟1的色譜條件進(jìn)行分析，根據(jù)相應(yīng)主峰面積數(shù)值，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD值STDEV)、算術(shù)平均值(Xbar AVERAGE)，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)＝標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)/算術(shù)平均值(Xbar)×100％，其峰面積測(cè)量值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)不大于1.0％。

表3重組人溶菌酶重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

表4重組人溶菌酶重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析

由表4的結(jié)果可見(jiàn)，連續(xù)8次進(jìn)樣，其主峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.52715％，小于1.0％，說(shuō)明本發(fā)明分析方法的重復(fù)性良好。

2、準(zhǔn)確度試驗(yàn)

精確稱量2559.7mg供試品(經(jīng)含量標(biāo)定的重組人溶菌酶樣品(20151125批)，其中重組人溶菌酶的質(zhì)量含量為5.86％)，其中含重組人溶菌酶150.0mg，質(zhì)量濃度為0.9％的氯化鈉超純水溶液定容至50.0mL容量瓶中，配制成重組人溶菌酶濃度為3.0mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液；用5.0mL容量瓶、質(zhì)量濃度為0.9％的氯化鈉超純水溶液稀釋5個(gè)樣品濃度，分別為：0.90mg/mL、1.20mg/mL、1.50mg/mL、1.80mg/mL、2.10mg/mL，按照實(shí)施例1步驟1的色譜條件進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5重組人溶菌酶標(biāo)準(zhǔn)曲線色譜檢測(cè)統(tǒng)計(jì)結(jié)果

根據(jù)表5的檢測(cè)結(jié)果，繪制色譜主峰面積隨重組人溶菌酶濃度變化的標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見(jiàn)圖2。標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性方程為：y＝2306.9x+222118.3，式中x代表重組人溶菌酶濃度，y代表色譜主峰面積，R²＝0.99924，線性良好。

精確稱量上述供試品170.65mg，其中含重組人溶菌酶10.0mg，加入質(zhì)量濃度為0.9％的氯化鈉超純水溶液定容至10.0mL容量瓶中，配制成重組人溶菌酶濃度為1.0mg/mL供試品溶液，用移液管分裝成1mL/支(每支含重組人溶菌酶1.0mg，A值)，每支樣品中再分別精確稱量加入17.15mg供試品(含重組人溶菌酶1.0mg，B值)，共7個(gè)樣品，按實(shí)施例1步驟1的色譜條件進(jìn)行分析。根據(jù)測(cè)得的色譜主峰面積和標(biāo)準(zhǔn)曲線y＝2306.9x+222118.3，求得實(shí)測(cè)濃度，獲得實(shí)測(cè)值C，根據(jù)下述公式計(jì)算加標(biāo)回收率：

回收率％＝(C-A)/B×100％

式中A為供試品所含重組人溶菌酶分量；B為加入對(duì)照品量；C為實(shí)測(cè)值。結(jié)果見(jiàn)表6。

表6重組人溶菌酶色譜檢測(cè)法準(zhǔn)確性驗(yàn)證統(tǒng)計(jì)結(jié)果

由表6可見(jiàn)，本發(fā)明方法的準(zhǔn)確度為95.8％～100.0％，符合中國(guó)藥典2015版準(zhǔn)確度在95％～102％的要求，可用于重組人溶菌酶含量的檢測(cè)。