本發(fā)明屬于分析化學(xué)領(lǐng)域，具體地，涉及一種測(cè)定三氮脒含量的方法，更具體地，涉及一種乳制品(特別是牛奶)中三氮脒含量的測(cè)定方法。
背景技術(shù)：
：三氮脒是目前比較常用的新型抗血液原蟲藥，主要使用對(duì)象為泌乳期的奶牛，不合理的使用會(huì)造成生鮮乳中獸藥殘留，存在一定的安全風(fēng)險(xiǎn)。目前國(guó)內(nèi)沒有該獸藥對(duì)應(yīng)的檢測(cè)方法，國(guó)內(nèi)外的文獻(xiàn)中鮮有報(bào)道。但是國(guó)內(nèi)外知名乳品企業(yè)已經(jīng)開始在生鮮乳中檢測(cè)該參數(shù)，以作為生鮮乳中風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)的常規(guī)指標(biāo)，故建立該參數(shù)的檢測(cè)方法就非常迫切。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：針對(duì)上述缺陷，本發(fā)明提供的方法解決了測(cè)定待測(cè)物(特別是，乳制品)中三氮脒的問題。實(shí)現(xiàn)了分析待測(cè)物(特別是針對(duì)乳制品這類物質(zhì))中，是否存在有三氮脒的檢測(cè)。本發(fā)明提供的酸化乙腈振蕩萃取的方法快速，回收率高，對(duì)儀器不造成污染，并有效的降低了檢出限。本發(fā)明提供了一種測(cè)定三氮脒含量的方法，其特征在于：采用酸化乙腈振蕩萃取待測(cè)物中的三氮脒，采用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定其含量。進(jìn)一步地，本發(fā)明提供的一種測(cè)定三氮脒含量的方法，還具有如下特點(diǎn)：即、具體檢測(cè)步驟如下所示：步驟一、于待測(cè)物中加入酸化乙腈溶液，均質(zhì)，提取0.5-5分鐘后，離心2-20分鐘；酸化乙腈可以為甲酸乙腈、乙酸乙腈、丙酸乙腈等各類酸化乙腈溶液。優(yōu)選提取0.5-1.5分鐘，離心3-6分鐘。在步驟一中，該均質(zhì)、和/或提取、和/或離心的過程可以為一次或多次，優(yōu)選為2-3次。在本發(fā)明的具體操作過程中，采用酸化的乙腈可以很好地沉淀乳制品的蛋白質(zhì)，其分離效果極好。步驟二、取上清液加載到固相萃取柱中，依次采用至少一次的堿液、至少一次的醇溶液、至少一次的酸化醇溶液洗脫，收集全部洗脫液；固相萃取柱可以選自弱陽離子交換柱，當(dāng)采用弱陽離子交換柱時(shí)，需用酸性溶液洗脫待測(cè)物品。在本發(fā)明的具體操作過程中發(fā)現(xiàn)，選用酸性溶液洗脫待測(cè)物較其他溶劑洗脫效果好。該上清液的取用量為總量的50-90％。該堿液、醇溶液和酸化醇溶液的用量為上清液的0.5-5倍。該堿液、醇溶液和酸化醇溶液的體積比為1:0.8-1.5:0.8-1.5。步驟三、洗脫液在30-60℃的溫度下，經(jīng)由保護(hù)氣干燥濃縮(如：氮?dú)獾缺Ｗo(hù)氣吹干等方式)，用酸和乙腈的混合水溶液定容；酸和乙腈的混合水溶液用量，按檢測(cè)的需要進(jìn)行配置，或按濃度比例進(jìn)行配置。步驟四、過濾后，采用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法對(duì)其進(jìn)行定量分析；該過濾方式可以為膜過濾、以石英砂、硅膠、海藻砂、濾紙等為介質(zhì)的過濾。其中，上述步驟一的過程為至少一次。進(jìn)一步地，本發(fā)明提供的一種測(cè)定三氮脒含量的方法，還具有如下特點(diǎn)：即、上述酸化乙腈為0.8-1.5％的甲酸乙腈溶液。即、由Xml的甲酸，溶解于(100-X)ml的乙腈中后，定容到100，即獲得X％的甲酸乙腈溶液。進(jìn)一步地，本發(fā)明提供的一種測(cè)定三氮脒含量的方法，還具有如下特點(diǎn)：即、在步驟一中，上述提取的方式優(yōu)選為渦旋震蕩提取法；每10g待測(cè)物中加入15-30ml的酸化乙腈溶液；上述離心的轉(zhuǎn)速>8000r/min。進(jìn)一步地，本發(fā)明提供的一種測(cè)定三氮脒含量的方法，還具有如下特點(diǎn)：即、在步驟二中，上述固相萃取柱為經(jīng)醇溶液和水，活化平衡后的WCX固相萃取柱；其中，醇溶液和水的體積比例為1:0.5-2；優(yōu)選為1:0.8-1.2。上述堿液選自質(zhì)量百分比濃度為0.1-1.5％的氨水；上述醇溶液選自甲醇、乙醇、丙醇中的一種或幾種；上述酸化的醇溶液選自0.5-2％的甲酸甲醇、乙酸甲醇、甲酸乙醇、乙酸乙醇、乙酸丙醇中的一種或幾種；即為將Yml的酸加入到(100-Y)ml的醇溶液中，即得到Y(jié)％的酸化醇溶液。進(jìn)一步地，本發(fā)明提供的一種測(cè)定三氮脒含量的方法，還具有如下特點(diǎn)：即、步驟三中，上述酸選自甲酸、乙酸和丙酸中的一種或幾種；上述酸的質(zhì)量百分比濃度為0.01-1％；上述乙腈的質(zhì)量百分比濃度為1-25％。進(jìn)一步地，本發(fā)明提供的一種測(cè)定三氮脒含量的方法，還具有如下特點(diǎn)：即、上述步驟四中的過濾為膜過濾。進(jìn)一步地，本發(fā)明提供的一種測(cè)定三氮脒含量的方法，還具有如下特點(diǎn)：即、在液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法的條件為：色譜柱為WatersACQUITYUPLCBEHC18色譜柱；流動(dòng)相A為0.1％甲酸水溶液，流動(dòng)相B為乙腈；流速0.3ml/min；梯度洗脫程序：0-0.1min，10％B；0.1-0.4min，95％B；0.4-0.5min,10％B；質(zhì)譜采集采用選擇選擇離子掃描方式。進(jìn)一步地，本發(fā)明提供的一種測(cè)定三氮脒含量的方法，還具有如下特點(diǎn)：即、上述離子掃描方式的掃描時(shí)間為5分鐘；定性離子對(duì)：282.3/119.1，254.2；錐孔電壓：12；碰撞能量：34,20。進(jìn)一步地，本發(fā)明提供的一種測(cè)定三氮脒含量的方法，還具有如下特點(diǎn)：即、上述待測(cè)物為乳制品。更優(yōu)選為牛奶。本發(fā)明的作用和效果本發(fā)明首次采用了液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用的方法來實(shí)現(xiàn)待測(cè)物質(zhì)(特別是乳制品)中的三氮脒含量的測(cè)定。此外，本發(fā)明提供的方法具有快速，回收率高，選擇性強(qiáng)，污染小，檢測(cè)限低的特點(diǎn)。附圖說明附圖1、三氮脒總離子流圖。具體實(shí)施方式實(shí)施例一、測(cè)定一、試樣制備稱取約100g生牛乳，-4℃下保存。二、提取稱取試樣10g，加入1％甲酸乙腈(或替換為0.8％的甲酸乙腈、1.2％的乙酸乙腈、1.5％的甲酸乙腈)溶液20ml(或?yàn)?5ml、25ml、30ml)，均質(zhì)，渦旋震蕩提取1min(根據(jù)濃度的不同，當(dāng)濃度高時(shí)提取的時(shí)間略長(zhǎng)，可達(dá)5min，當(dāng)濃度低時(shí)提取的時(shí)間略短，可達(dá)0.5min，此外，在此提取過程中，可采用少量溶劑多次提取的方式來實(shí)現(xiàn))，10000r/min高速離心5min(根據(jù)濃度的不同，當(dāng)濃度高時(shí)提取的時(shí)間略長(zhǎng)，可達(dá)20min，當(dāng)濃度低時(shí)提取的時(shí)間略短，可達(dá)2min)。三、凈化離心后呈固液分離裝，取10ml(根據(jù)需要可采集5-30ml的上清液)的上清液直接加載到活化平衡(3mL甲醇，3mL水)好的WCX固相萃取柱中，用3ml0.75％氨水(或0.1％、0.5％、1％、1.5％)，3ml甲醇(或乙醇)淋洗，3ml1％甲酸甲醇(或0.5％甲酸甲醇、0.8％乙酸甲醇、1.5％甲酸乙醇、1.8％乙酸乙醇、2％乙酸丙醇)洗脫，收集全部洗脫液。四、濃縮洗脫液在40℃下氮?dú)獯蹈?，?.1％甲酸10％乙腈水溶液(或0.01％乙酸25％乙腈、0.05％甲酸20％乙腈、1％乙酸1％乙腈)定容至1ml(或0.5-5ml)。過濾膜，GC-MS測(cè)定。五、測(cè)定色譜參考條件色譜柱為WatersACQUITYUPLCBEHC18色譜柱(2.1×100mm，1.7μm)；流動(dòng)相A為0.1％甲酸水溶液，流動(dòng)相B為乙腈；流速0.3mL/min；梯度洗脫程序：0-0.1min，10％B；0.1-0.4min，95％B；0.4-0.5min,10％B；六、色譜分析由自動(dòng)進(jìn)樣器分別吸取5.0μL標(biāo)準(zhǔn)混合溶液和凈化后的樣品溶液注入色譜儀中，以保留時(shí)間、離子豐度比定性，以樣品溶液峰面積與標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積比較定量。實(shí)施例二、結(jié)果和分析一、定性分析每種被測(cè)組分選擇1個(gè)母離子，2個(gè)以上子離子，在相同試驗(yàn)條件下，樣品中待測(cè)物質(zhì)的保留時(shí)間與混合對(duì)照品基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液中對(duì)應(yīng)的保留時(shí)間偏差在2.5％以內(nèi)，且樣品譜圖中各組分定性離子的相對(duì)豐度與濃度接近的對(duì)照品基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液中對(duì)應(yīng)的定性離子的相對(duì)豐度進(jìn)行比較，若偏差不超過規(guī)定的范圍，則可判定為樣品中存在對(duì)應(yīng)的待測(cè)物。二、定量分析色譜峰的測(cè)量在儀器最佳工作條件下，混合對(duì)照品基質(zhì)液配制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，外標(biāo)法定量計(jì)算式中：X——樣品中被測(cè)藥物的殘留量，μg/kg；C——被測(cè)樣品的濃度，ng/ml；f——稀釋因子；V——樣品定容體積，ml；m——樣品稱取質(zhì)量，g；三、精密度：本方法批內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)偏差<20％，批間標(biāo)準(zhǔn)偏差<20％。四、準(zhǔn)確度和靈敏度：準(zhǔn)確度：回收率80％～120％之間，具體請(qǐng)參看相應(yīng)記錄。靈敏度：檢出限為1.0μg/kg。五、質(zhì)控(1)檢測(cè)樣品每做20個(gè)平行需要帶1個(gè)質(zhì)控樣。(2)實(shí)驗(yàn)之前確認(rèn)加標(biāo)水平是否能達(dá)到檢出限要求。在陰性樣品中加入檢出限水平的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，按標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定，計(jì)算信噪比，信噪比應(yīng)該≥3。(3)如篩選出陽性樣品，必須進(jìn)行復(fù)測(cè)。定量時(shí)必須注意樣品提取液中濃度與標(biāo)樣濃度相近。如條件許可，可以針對(duì)農(nóng)藥性質(zhì)采用其他定量準(zhǔn)確的檢測(cè)手段來進(jìn)一步定量測(cè)定。實(shí)施例三、驗(yàn)證試驗(yàn)：三氮脒標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)名稱：三氮脒含量：87.5％有效期：2016-07-12來源：Dr.E定性離子對(duì)：282.3/119.1,254.2錐孔電壓：12碰撞能量：34,201.標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度C(μg/L)1、2、3、5、10、20線性方程y＝105.004X+22.3277相關(guān)系數(shù)r0.9922.檢出限空白樣品中添加1μg/ml標(biāo)準(zhǔn)溶液10μl于10.0g(即加標(biāo)濃度為：1.0μg/kg)，經(jīng)樣品前處理，儀器測(cè)定后，被測(cè)物的信噪比S/N>3，表明方法的檢出限可至1.0μg/kg。3.回收率及變異系數(shù)樣品基質(zhì)：牛奶當(dāng)前第1頁1 2 3