本發(fā)明涉及一種適用于聚乙二醇化蛋白質(zhì)的純度檢測方法，尤其是適用于聚乙二醇化藥用蛋白酶的純度檢測，更具體的是一種聚乙二醇化門冬酰胺酶或激肽原酶的純度檢測方法。
背景技術(shù)：
：藥品的純度與藥物的理化及生物學(xué)性質(zhì)息息相關(guān)，不僅會對藥物的穩(wěn)定性有影響，甚至與藥品的藥效、藥代行為、安全性均有較大的關(guān)聯(lián)。由此可見，雜質(zhì)研究對于藥品研發(fā)來說意義重大?！痘瘜W(xué)藥物雜質(zhì)研究的技術(shù)指導(dǎo)原則》中規(guī)定：任何影響藥物純度的物質(zhì)統(tǒng)稱為雜質(zhì)。雜質(zhì)的研究是藥品開發(fā)的一項重要內(nèi)容，雜質(zhì)是否能被全面準確地加以控制，直接關(guān)系到藥品的質(zhì)量可控性和安全性，所以在藥物的研究、生產(chǎn)、供應(yīng)和臨床使用等方面必須保證藥物的純度。規(guī)范地進行雜質(zhì)的研究，并將其控制在一個安全、合理的限度范圍之內(nèi)，才能保證藥物的有效和安全。中國藥典中收載的一些常用的蛋白純度檢測方法缺乏普遍適用性，無法準確的對每種蛋白類藥物進行純度檢測，尤其無法用于聚乙二醇化蛋白質(zhì)的純度檢測。采用常規(guī)的SDS-PAGE方法來分析聚乙二醇化蛋白質(zhì)的純度(中國藥典2005年版二部附錄VF第五法SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法)存在諸多問題：1.操作繁瑣，耗時較長?？傮w說來，SDS-PAGE需要經(jīng)歷制板->制分離膠->制濃縮膠->電泳槽安裝->制樣->加樣->電泳->剝膠->染色->脫色->結(jié)果觀察等十一個步驟；盡管可以購買商品化的電泳膠節(jié)省制膠的步驟和時間，但是依舊耗時較長，第一，樣品的制備需要放入100℃加熱5-10min；第二，電泳需要45min～1hr；第三，考馬斯亮藍染色、脫色同樣需要1～2hr，并且需要多次更換脫色液。2.方法精密度較差，且具有一定的危險性。首先，若使用的是商品膠，方法的精密度取決于商品膠的生產(chǎn)質(zhì)量；若為自制膠，則凝膠聚合受各種因素的影響，丙烯酰胺有毒性，能致癌致突變；TEMED易燃易揮發(fā)，有強神經(jīng)毒性。3.方法靈敏度低，主成分與雜質(zhì)分離度無法達到要求。聚乙二醇化蛋白質(zhì)一般是蛋白質(zhì)與一個以上的聚乙二醇通過共價結(jié)合而制得的。每一個蛋白質(zhì)分子上都結(jié)合有一定數(shù)量的聚乙二醇。被聚乙二醇修飾后蛋白質(zhì)受長鏈PEG水力學(xué)臂的影響，在電泳膠上呈彌散狀態(tài)分別，根本無法準確考察聚乙二醇化蛋白質(zhì)所產(chǎn)生的微量降解或聚集雜質(zhì)。4.方法難以定量，目前除了灰度掃描外，并沒有有效的手段通過SDS-PAGE電泳膠對目的蛋白進行定量分析；而灰度掃描也是通過色階的差異進行分析，缺乏準確性及穩(wěn)定性。高效液相色譜或超高效液相色譜為近年來逐漸廣泛應(yīng)用的蛋白質(zhì)純度分析方法，但是由于蛋白質(zhì)經(jīng)聚乙二醇化后性質(zhì)發(fā)生改變，較難以通過常規(guī)色譜柱及色譜程序達到聚乙二醇化蛋白質(zhì)及其相關(guān)雜質(zhì)的分離。此外，申請人在研究中還發(fā)現(xiàn)，當以高效液相色譜或超高效液相色譜檢測聚乙二醇化蛋白質(zhì)的純度時，普遍會存在檢測結(jié)果中目的蛋白的色譜峰有嚴重拖尾的現(xiàn)象，無法有效并準確的檢測出目的蛋白的純度。如發(fā)明人用UPLC反相色譜法鑒定培門冬酶(聚乙二醇隨機修飾門冬酰胺酶(L-ASP))的純度時，培門冬酶的拖尾因子高達2.0；UPLC分子篩色譜法分析樣品時，培門冬酶的拖尾仍然很嚴重，且無法通過常規(guī)手段如改變了流動相中的緩沖鹽種類、鹽濃度或者流動相pH值等方法改善培門冬酶在分子篩色譜法中的色譜行為。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明解決的技術(shù)問題是：現(xiàn)有聚乙二醇化蛋白質(zhì)純度分析方法操作繁瑣、精密度差、靈敏度低并具有一定的安全隱患；以及色譜法檢測拖尾嚴重等的問題。本發(fā)明提供了一種分子篩色譜法檢測聚乙二醇化蛋白質(zhì)純度的方法，流動相中添加有：1)主鏈具有三個或三個以上碳原子、可溶于水相及有機相的短鏈脂肪醇；或2)與修飾用PEG具有相同分子量或者分子量更大的PEG修飾劑。上述醇類如正丁醇、異丙醇、3-甲基-1,3-丁二醇。上述PEG修飾劑優(yōu)選與修飾用PEG具有相同分子量或者分子量更大的PEG修飾劑。如PEG隨機修飾門冬酰胺酶所用PEG修飾劑為分子量5K的PEG修飾劑，流動相添加劑可選擇分子量5K或大于5K(如40K)的PEG修飾劑。作為優(yōu)選，流動相中含有2％～5％(V/V)異丙醇。作為優(yōu)選，流動相是含2％～5％(V/V)異丙醇的20mmol/L磷酸鹽緩沖液,pH6.0±0.5。作為優(yōu)選，流動相流速為0.3mL/min。作為優(yōu)選，色譜柱柱溫25℃±5℃。所述聚乙二醇化蛋白質(zhì)為聚乙二醇修飾的藥用蛋白酶。作為優(yōu)選，所述聚乙二醇化蛋白質(zhì)為聚乙二醇隨機或定點修飾的門冬酰胺酶、激肽原酶或精氨酸脫亞胺酶。作為優(yōu)選，其中色譜柱選用填料為亞乙基橋雜化顆粒BEH。本發(fā)明的另一目的是，主鏈具有三個或三個以上碳原子、可溶于水相及有機相的短鏈脂肪醇或與修飾用PEG具有相同分子量或者分子量更大的PEG修飾劑在分子篩色譜法檢測聚乙二醇修飾蛋白純度時作為流動相添加劑的用途。上述物質(zhì)可改善分子篩色譜法檢測聚乙二醇修飾蛋白純度時的色譜峰峰形，提高準確度。本發(fā)明開發(fā)的SEC-UPLC的分析方法，待檢樣品經(jīng)適當稀釋處理即可直接進樣檢測，操作簡單，解決了現(xiàn)有方法操作繁瑣的問題；本發(fā)明方法全程可以由儀器自動進樣檢測，通量較高，單針樣品檢測時間約為15min，解決了現(xiàn)有方法耗時長的問題；本發(fā)明方法僅受色譜方法條件中pH、溫度、流速的影響，而這些條件可以通過儀器及溶液配制等操作進行準確控制，重復(fù)性及中間精密度均良好，解決了現(xiàn)有方法精密度差，受多種因素影響的問題。另一方面在本方法發(fā)現(xiàn)之前，發(fā)明人也嘗試了多種色譜法對聚乙二醇化蛋白質(zhì)進行純度檢測，如HPLC配合使用SEC柱、HPLC配合使用C4柱、UPLC配合使用C4柱等等，但始終未能使培門冬酶及其相關(guān)雜質(zhì)達到分離，甚至未有任何分離的趨勢。偶然的機會，發(fā)明人在流動相中混入了一些特定的醇，意外發(fā)現(xiàn)培門冬酶拖尾現(xiàn)象有很大的好轉(zhuǎn)。同時，發(fā)明人也換用有機溶劑如甲醇、乙腈進行過相關(guān)的方法學(xué)考察，在含有此二種有機溶劑流動相條件下根本無法檢出雜B；培門冬酶的拖尾因子嚴重，在甲醇的條件下甚至連雜A都無法檢出，培門冬酶拖尾因子高達2.06。因此，本發(fā)明方法很好的解決了以色譜法檢測聚乙二醇化蛋白質(zhì)時拖尾嚴重的問題，能檢出現(xiàn)有方法無法檢出聚乙二醇化蛋白質(zhì)中的雜質(zhì)，更好地控制藥品質(zhì)量。附圖說明圖1：空白溶劑色譜圖圖2：系統(tǒng)適應(yīng)性色譜圖圖3a：本公司研發(fā)的培門冬酶溶液(a)、自研培門冬酶對照品(b)、門冬酰胺酶蛋白(c)、國內(nèi)首仿培門冬酶(d)、原研培門冬酶(e)用實施例1方法分析的色譜圖圖3b：圖3a的局部放大圖圖4：不同程度降解的培門冬酶(樣品1，樣品2，樣品3)用實施例1所述方法檢測的液相色譜圖圖5:不同程度降解的培門冬酶用SDS-PAGE法檢測圖圖6:方法驗證中線性考察圖譜(n＝3)。圖7:流動相組分是否加異丙醇對比色譜圖圖8：流動相組分是否加鹽對比色譜圖圖9:流動相加不同比例異丙醇對比色譜圖圖10:改變流動相pH值對比色譜圖圖11:改變柱溫對比色譜圖圖12:改變流速的對比色譜圖圖13:實施例4方法1的系統(tǒng)適應(yīng)性定位色譜圖圖14:實施例4方法1的培門冬酶與雜質(zhì)A分離色譜圖圖15：實施例4方法2的色譜圖圖16：實施例4方法3以甲醇代替異丙醇的色譜圖圖17：實施例4方法4以乙腈代替異丙醇的色譜圖圖18：實施例5PEG定點修飾門冬酰胺酶色譜圖，其中圖18a是不添加異丙醇的色譜圖，圖18b是添加異丙醇的色譜圖圖19：實施例5PEG定點修飾激肽原酶色譜圖，其中圖19a是不添加異丙醇的色譜圖，圖19b是添加異丙醇的色譜圖圖20：實施例5門冬酰胺酶不添加異丙醇的色譜圖圖21：實施例5激肽原酶不添加異丙醇的色譜圖具體實施方式實施例1本發(fā)明分析方法的色譜條件及方法儀器：品牌型號：WatersAcquityUPLCHclass；bioQuaternarysolventManager；BioSampleManager-FTN；PDADetector；Empower3.0數(shù)據(jù)處理軟件色譜柱：ACQUITYUPLCBEH450SEC2.5μm，4.6mm*300mm流動相：含2％異丙醇(V/V)的20mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.5±0.5，取0.2mol/L磷酸二氫鈉溶液87.7mL，0.2mol/L磷酸氫二鈉12.3mL，異丙醇20mL，加水充分混勻并定容至1000mL)流速：0.3mL/min，檢測波長280nm，進樣量10μL，樣品池溫度10℃，色譜柱溫25±5℃。方法：取待測樣品適量，加流動相稀釋并制成每1mL中約含250單位培門冬酶的溶液，作為供試品溶液。照分子排阻色譜法(中國藥典2010年版二部附錄ⅤH)測定，記錄色譜圖，按照峰面積歸一化法計算主峰相對百分含量，應(yīng)不低于95％，理論塔板數(shù)不低于2000。系統(tǒng)適應(yīng)性溶液：培門冬酶：雜質(zhì)A：門冬酰胺酶按質(zhì)量比8:1:1比例混合，照上述方法進樣，培門冬酶與雜質(zhì)A、雜質(zhì)B分離度均不低于1.5。雜質(zhì)A：取培門冬酶適量，經(jīng)高溫55℃處理24h所得；為培門冬酶主要的降解雜質(zhì)；雜質(zhì)B：為培門冬酶的聚集雜質(zhì)，為生產(chǎn)工藝中所引入的雜質(zhì)。實施例2實施例1分析方法性能驗證的過程及結(jié)果本純度分析方法驗證主要參考了《化學(xué)藥物質(zhì)量控制分析技術(shù)指導(dǎo)原則》、《生物制品質(zhì)量控制分析方法驗證技術(shù)審評一般原則》、《InternationalConferenceonHarmonization(ICH)ofTechnicalRequirementsforRegistrationofPharmaceuticalsforHumanUse,TopicQ2(R1):ValidationofAnalyticalProcedures:TextandMethodology，Geneva，2005，p.11》及USPMC《PegfilgrastimSummaryValidationReport，Sep17,2012》中有關(guān)于純度分析方法驗證的要求進行。為方便實驗，本公司按如下方法自主制備培門冬酶(PEG隨機修飾的門冬酰胺酶)：第一步：緩沖液置換把門冬酰胺酶的凍干粉(購自常州千紅生化制藥股份有限公司)溶于20mM的Tris-Hcl(pH8.0)緩沖液中，配制成蛋白濃度為5mg/mL的溶液。然后把樣品通過AKTA層析系統(tǒng)的上樣泵進行上樣，樣品吸入到Q離子交換柱(購自GE公司，HiTrapQHP5mL)上。上樣結(jié)束后用平衡緩沖液A液平衡色譜柱，平衡5個柱體積后用洗脫緩沖液B液進行一步洗脫，收集洗脫峰。(A液：20mM磷酸緩沖液(pH8.0)，B液：20mM磷酸緩沖液+0.2M氯化鈉(pH7.5))第二步：修飾反應(yīng)及修飾產(chǎn)物純化用M-SPA-5000(購自北京鍵凱科技有限公司)作為PEG修飾劑，將第一步所收集洗脫峰的門冬酰胺酶溶液按門冬酰胺酶:PEG修飾劑為1:50的摩爾比進行反應(yīng)，在4℃下反應(yīng)12h。其中PEG修飾反應(yīng)中門冬酰胺酶的蛋白濃度為5mg/mL。反應(yīng)結(jié)束后，檢測結(jié)果表明門冬酰胺酶的修飾率達到了100％。反應(yīng)結(jié)束后用離子交換色譜層析進行純化。純化的色譜法條件：Q離子交換柱(購自GE公司，HiTrapQHP5mL)，平衡緩沖液C液：20mM的Tris-HCl(pH9.0)，洗脫緩沖液D液：含0.1MNaCl的20mM的磷酸緩沖液(pH8.0)，流速2.5mL/min，檢測波長為280nm。上樣：上述修飾反應(yīng)產(chǎn)物用0.5M的NaOH溶液調(diào)節(jié)至pH9.0，結(jié)合至Q離子交換柱。平衡：C液沖洗5個柱體積。洗脫：流動相配比為0-50％D液，洗脫體積為10個柱體積，洗脫時間為20分鐘。按上述方法平行制備三批培門冬酶樣品，備用。2.1專屬性及系統(tǒng)適應(yīng)性分析2.1.1取空白溶劑適量，照實施例1所示的色譜條件進樣，采集色譜圖(圖1)。結(jié)果表明空白溶劑對于樣品檢測無干擾。2.1.2系統(tǒng)適應(yīng)性溶液(隨機取用上述自制培門冬酶，將培門冬酶、雜質(zhì)A、門冬酰胺酶照質(zhì)量比8:1:1混合，采集色譜圖(圖2)。表1系統(tǒng)適應(yīng)性以上結(jié)果表明，培門冬酶與雜質(zhì)A、B均能達到基線分離，且培門冬酶拖尾因子為1.03，對稱性良好。雜質(zhì)A：取培門冬酶適量，經(jīng)高溫55℃處理24h所得；為培門冬酶主要的降解雜質(zhì)；雜質(zhì)B：為培門冬酶的聚集雜質(zhì)，為生產(chǎn)工藝中所引入的雜質(zhì)。2.1.3本公司研發(fā)的培門冬酶溶液(a)、自研培門冬酶對照品(b)、門冬酰胺酶蛋白(c)(購自常州千紅生化制藥股份有限公司)、國內(nèi)首仿培門冬酶(d)(購買自恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，商品名：艾陽)、原研培門冬酶(e)(購買自Enzo公司，商品名oncaspar)用本法對比分析(圖3)。a、b、d、e在主成分前面均出現(xiàn)了面積百分比為0.1％～0.3％不等的蛋白聚集雜質(zhì)B。所述培門冬酶溶液(a)、自研培門冬酶對照品(b)為上述自制培門冬酶中隨機挑選的2批。不同程度降解的培門冬酶(a)(樣品1：取培門冬酶100μl，加0.1M的NaOH強制降解10min，加0.1M的HCl終止反應(yīng)；樣品2：同樣品1強制降解條件，反應(yīng)時間為0.5h；樣品3：同樣品1強制降解條件，反應(yīng)時間為1h。)用實施例1所述方法檢測，由圖4(其中圖4a-圖4c分別為樣品1-3的實驗結(jié)果)可知，對于7.9min和/或9.3min處雜質(zhì)均能準確檢出。2.1.4采用SDS-PAGE法(本發(fā)明
背景技術(shù)：
提及的方法)進行分析：取依據(jù)上述方法強制降解得到的不同程度降解的各樣品(樣品1、樣品2、樣品3)適量，加樣品緩沖液(磷酸鹽緩沖液，pH8.0)，充分溶解，混勻即得制成每1ml中約含100單位的溶液，作為供試品溶液；同法制備對照品溶液；選用10％分離膠，5％濃縮膠(膠尺寸8×8cm，1mm(長×寬及厚度)，分別取供試品溶液和對照品溶液各2ul，照電泳法(中國藥典2005年版二部附錄VF第五法SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法)試驗。結(jié)果如圖5所示，其中泳道A1-A3為樣品1，其中B1-B2為樣品2，其中C1-C2為樣品3。由圖5結(jié)果比較可知，由于隨機修飾蛋白本身具有一定程度的離散性，且培門冬酶表觀分子量受線性PEG空間結(jié)構(gòu)的影響，與其分子量接近的微量雜質(zhì)，在SDS-PAGE方法中根本無法檢出。2.2精密度2.2.1重復(fù)性隨機取用上述自制培門冬酶，平行配制供試品6份，分別進樣，采集色譜圖，以主成分保留時間、峰面積、％面積的RSD(相對標準偏差relativestandarddeviation)來考察方法重復(fù)性。表2培門冬酶分析方法驗證-重復(fù)性主成分保留時間RSD＝0.02％，面積RSD＝0.3％，％面積RSD＝0.2％，表明該方法重復(fù)性良好。2.2.2中間精密度另一人于另一日隨機取用上述2批自制培門冬酶，分別平行配制6份樣品，依照本法，分別進樣，采集色譜圖，結(jié)合重復(fù)性共12次檢測結(jié)果，以主成分保留時間、峰面積、％面積等RSD來考察方法重復(fù)性。表3培門冬酶分析方法驗證-中間精密度主成分保留時間RSD＝0.03％，面積RSD＝0.52％，％面積RSD＝0.29％，表明該方法中間精密度良好。2.3線性隨機取用上述自制培門冬酶，分別配制10％、25％、50％、75％、100％、150％共6個濃度水平的供試品(所述100％濃度即為每1mL中約含250單位培門冬酶的溶液)，每個濃度平行配制3份樣品，依照實施例1方法，分別進樣，采集色譜圖，考察10％-150％濃度水平范圍內(nèi)的線性關(guān)系。表4培門冬酶分析方法驗證-線性根據(jù)平行三次色譜采集峰面積對濃度水平進行線性關(guān)系擬合，見圖6a、6b、6c。三次線性曲線R2≥0.9990，表明本方法線性關(guān)系良好。2.4檢測限(LOD)LOD值通過如下公式進行計算：LOD＝3.3σ/S×100％，σ＝響應(yīng)值的標準方差，S＝線性方程的斜率；表5培門冬酶分析方法驗證-LOD計算曲線編號斜率Y軸截距R21865527138660.99962866393141340.99983862409141481平均值864776.314049.330.9998SD2095.40158.93-因此，LOD＝3.3×158.93/864776.3×100％＝0.06％，說明該方法靈敏度較高，可以用于培門冬酶的純度檢測。2.5溶液穩(wěn)定性隨機取用上述自制培門冬酶，加流動相稀釋并制成每1mL中約含250單位的溶液，作為供試品溶液放置于2-8℃(5℃±3℃)的進樣器中，分別考察1-12h內(nèi)溶液的穩(wěn)定性情況。表6培門冬酶分析方法驗證-溶液穩(wěn)定性a培門冬酶與降解雜質(zhì)A的分離度b培門冬酶與工藝雜質(zhì)B的分離度由以上結(jié)果可知，在0-12h內(nèi)主成分保留時間RSD＝0.05％，面積RSD＝1.25％，％面積RSD＝0.06％，表明該方法溶液穩(wěn)定性良好。實施例3改變實施例1中部分色譜條件(其他條件不變)前后的方法性能比較表7改變實施例1部分色譜條件的對比試驗參數(shù)及結(jié)果實施例4方法1、采用TSKgelG4000PWXL(7.8*300mm，10um)色譜柱，柱溫25℃，流動相為0.02mol/L磷酸緩沖液(0.02mol/L磷酸鹽緩沖液，加0.1mol/L硫酸鈉，pH6.0)；waterse2695色譜儀配PDA檢測器。使用該方法檢測上述系統(tǒng)適應(yīng)性溶液，培門冬酶、雜A及門冬酰胺酶均無法達到基線分離；通過調(diào)整流速，pH，流動相組成均未達到理想效果。將流速調(diào)至0.2ml/min時，主峰保留時間已經(jīng)延至40min，但仍未與雜A達到基線分離，更無法檢出雜B。(見圖13、圖14)方法2、采用ACQUITYUPLCBEH300C4(1.7μm，2.1×100mm)色譜柱，以0.1％TFA水為流動相A，0.1％TFA乙腈作為流動相B，以下表8所示的流動相梯度作為起始條件進行方法摸索；WatersAquaityHClass液相色譜儀。同樣，無論如何調(diào)整流動相比例或改性劑的種類，均無法使雜A與培門冬酶達到分離。(見圖15)表8T(min)流動相A流動相B090％10％590％10％1040％60％200％100％20.0190％10％2590％10％方法3、2％甲醇代替2％異丙醇，其他條件同實施例1，實驗結(jié)果見圖16、表9表9方法4、2％乙腈代替2％異丙醇，其他條件同實施例1，見圖17、表10表10發(fā)明人在偶然發(fā)現(xiàn)異丙醇對于以色譜法檢測聚乙二醇化蛋白純度的過程中能解決譜峰嚴重拖尾的技術(shù)問題后，進行了進一步的分析，初步推測聚乙二醇化蛋白由于表面覆蓋了許多的聚乙二醇分子，其中的醇羥基能與填料表面的硅羥基選擇性吸附，從而造成譜峰嚴重拖尾；而異丙醇的加入可以競爭性地抑制硅醇基的吸附從而有效地改善峰形，同時申請人也以具有相同性質(zhì)的甲醇、乙腈進行了替代實驗，卻無法解決上述技術(shù)問題。申請人同時推測，本技術(shù)問題的解決應(yīng)該還同時與異丙醇本身粘度較大的物理特性，以及其他一些無法確定的性質(zhì)共同作用解決了該技術(shù)問題。實施例5變更待檢測樣品，根據(jù)樣品的分子量選擇相應(yīng)的色譜柱填料規(guī)格，其余條件與實施例1保持一致，具體結(jié)果如下：表11實施例1的方法對于其他PEG修飾類產(chǎn)品的峰形改善效果所述PEG定點修飾門冬酰胺酶，具體由以下方法制備得到：1.PEG偶聯(lián)物樣品制備用40mMpH5.0的乙酸-乙酸鈉緩沖液溶解將L-門冬酰胺酶(來源于常州千紅生化制藥股份有限公司)以配制成為20mg/mL的溶液，分別用Y-PALD-40K(購自北京鍵凱科技有限公司)，按門冬酰胺酶:PEG:氰基硼氫化鈉為1:4:200的摩爾比進行反應(yīng)，在4℃下反應(yīng)12h后，加入1M甘氨酸終止反應(yīng)。制備得到單修飾產(chǎn)物Y-PALD-40K-ASP(Mono)及二修飾產(chǎn)物Y-PALD-40K-ASP(Di)。2.PEG偶聯(lián)物樣品純化色譜法條件：Q離子交換柱(購自GE公司，HiTrapQHP5mL)，A液：20mM的Tris-HCl(pH9.0)，B液：含1MNaCl的20mM的Tris-HCl(pH9.0)，流速2.5mL/min，檢測波長為280nm。上樣：上述修飾反應(yīng)產(chǎn)物用0.5M的NaOH溶液調(diào)節(jié)至pH9.0，結(jié)合至Q離子交換柱。平衡：A液沖洗5個柱體積。洗脫：0-50％B液，洗脫體積為10個柱體積，時間20分鐘，分步進行收樣得到二修飾產(chǎn)物Y-PALD-40K-ASP(Di)。所述PEG定點修飾激肽原酶，具體由以下方法制備得到：1.PEG偶聯(lián)物樣品制備用50mMpH5.0的乙酸-乙酸鈉緩沖液溶解將激肽原酶(來源于常州千紅生化制藥股份有限公司)以配制成為8mg/mL的溶液，用Y-PALD40K(購自北京鍵凱科技有限公司)，按激肽原酶:PEG:氰基硼氫化鈉為1:10:100的摩爾比進行反應(yīng)，在4℃下反應(yīng)12h后，加入1M甘氨酸終止反應(yīng)。制備得到Y(jié)-PALD-40K-KLK1。2.PEG偶聯(lián)物樣品純化2.1色譜法去除未反應(yīng)PEG色譜法條件：Q離子交換柱(購自GE公司，HiTrapQHP5mL)，A液：20mM的Tris-HCl(pH8.0)，B液：含1MNaCl的20mM的Tris-HCl(pH8.0)，流速2.5mL/min，檢測波長為280nm。上樣：上述修飾反應(yīng)產(chǎn)物用0.5M的NaOH溶液調(diào)節(jié)至pH8.0，結(jié)合至Q離子交換柱。平衡：A液沖洗5個柱體積。收集：50％(v/v)的B液洗脫，并收集洗脫峰樣品。2.2色譜法純化單修飾PEG偶聯(lián)物色譜法條件：Hiload16/60Superdex200pg(購自GE公司)半制備型凝膠過濾柱，洗脫液為PBS，流速1.5mL/min，檢測波長為280nm。由圖20中可以看出PEG修飾前的門冬酰胺酶在SEC-HPLC上峰形對稱性較好，譜峰較窄；由圖18a中可以看出，經(jīng)PEG定點修飾之后的門冬酰胺酶峰展約為3min，拖尾嚴重，容易造成定量不準確的情況；而圖18b中可以看出，經(jīng)過流動相中添加異丙醇，可以有效地改善色譜峰形，且能同時檢測到相應(yīng)的蛋白聚集雜質(zhì)，可以將定點修飾門冬酰胺酶及其相關(guān)雜質(zhì)得到較好的分離。表12定點修飾門冬酰胺酶采用實施例1的方法分析色譜分離相關(guān)結(jié)果參數(shù)保留時間(min)峰面積％面積USP分離度USP拖尾因子USP理論塔板數(shù)17.90529290.42349028.99969899299.261.741.124369310.19522820.322.611.141519同樣地，對于PEG定點修飾激肽原酶產(chǎn)品也同樣具有改善峰形的效果。由圖21可以看出，修飾前的激肽原酶色譜峰對稱性良好，譜峰較窄；由圖19a中可以看出，經(jīng)PEG定點修飾的激肽原酶在進行SEC-HPLC分析時，流動相中若不添加異丙醇，則峰展較寬，接近2.5min；而在流動相中添加5％的異丙醇后，色譜峰不僅對稱性得到較好的改善，且峰展寬縮短至1.5min。對于PEG定點修飾精氨酸脫亞胺酶產(chǎn)品也同樣具有改善峰形的效果。經(jīng)PEG定點修飾的蛋白在不添加任何改性劑的流動相中不出峰，或者出峰效果不佳(拖尾嚴重，峰展極寬)，而在流動相中添加10％的異丙醇后，色譜峰得到明顯的改善，且能看到明顯雜質(zhì)分離。實施例6將實施例1中異丙醇替換為其他添加劑，并改變部分色譜條件，其他條件同實施例1，檢測PEG隨機修飾門冬酰胺酶、PEG定點修飾門冬酰胺酶、PEG定點修飾激肽原酶、PEG定點修飾精氨酸脫亞胺酶純度：1.改性劑：5％正丁醇色譜柱：ACQUITYUPLCBEH450SEC3.5μm，7.8mm*300mm，上樣量10-40μL，流速為0.8ml/min，檢測波長280nm，柱溫30℃。結(jié)果分析：正丁醇作為改性劑，四種樣品出峰效果均較理想，峰形對稱性好，拖尾小，在1.07-1.45之間。2.改性劑：10％異丙醇色譜柱：ACQUITYUPLCBEH450SEC3.5μm，7.8mm*300mm，上樣量10-40μL，流速為0.8ml/min，檢測波長280nm，柱溫30℃。結(jié)果分析：異丙醇作為改性劑，四種樣品出峰效果均較理想，峰形對稱性好，拖尾小，在1.07-1.26之間。3.改性劑：5％3-甲基-1,3-丁二醇色譜柱：ACQUITYUPLCBEH450SEC3.5μm，7.8mm*300mm，上樣量10-40μL，流速為0.8ml/min，檢測波長280nm，柱溫30℃。結(jié)果分析：3-甲基-1,3-丁二醇作為改性劑時也能使這四種修飾蛋白出峰效果理想。4.改性劑：5％戊二醇色譜柱：ACQUITYUPLCBEH450SEC3.5μm，7.8mm*300mm，上樣量10-40μL，流速為0.8ml/min，檢測波長280nm，柱溫30℃。結(jié)果分析：PEG隨機修飾門冬酰胺酶、PEG定點修飾激肽原酶、PEG定點修飾精氨酸脫亞胺酶的峰形具有一定的改善。在該改性劑條件下，峰形均具有一定的改善。但仍需加大其用量才能獲得理想的效果，限制了其應(yīng)用。5.改性劑：1％異戊醇色譜柱：ACQUITYUPLCBEH450SEC3.5μm，7.8mm*300mm，上樣量10-40μL，流速為0.8ml/min，檢測波長280nm，柱溫30℃。結(jié)果分析：異戊醇作為改性劑對這四種樣品均沒有良好的分離效果，由于異戊醇本身的碳鏈較前二者長，其與水的溶解度不佳，因此限制其作為SEC流動性改性劑的應(yīng)用。6.改性劑：5％1,2丙二醇色譜柱：ACQUITYUPLCBEH450SEC3.5μm，7.8mm*300mm，上樣量10-40μL，流速為0.8ml/min，檢測波長280nm，柱溫30℃。結(jié)果分析：1,2丙二醇作為改性劑對PEG隨機修飾門冬酰胺酶、PEG定點修飾門冬酰胺酶、PEG定點修飾激肽原酶都沒有良好的分離效果，而對PEG定點修飾精氨酸脫亞胺酶而言，有明顯出峰，但對稱性較差，拖尾嚴重。7.改性劑：0.25％PEG5K(M-SPA-5000)色譜柱：ACQUITYUPLCBEH450SEC2.5μm，4.6mm*300mm，上樣量10-40μL，流速為0.3ml/min，檢測波長280nm，柱溫30℃。結(jié)果分析：PEG隨機修飾門冬酰胺酶的出峰最好，PEG定點修飾門冬酰胺酶、PEG定點修飾精氨酸脫亞胺酶無明顯出峰，PEG定點修飾激肽原酶雖然有出峰但響應(yīng)值較低。8.改性劑：0.5％PEG40K(Y-PALD-40KD)色譜柱：ACQUITYUPLCBEH450SEC2.5μm，4.6mm*300mm，上樣量10-40μL，流速為0.3ml/min，檢測波長280nm，柱溫30℃。結(jié)果分析：PEG隨機修飾門冬酰胺酶、PEG定點修飾門冬酰胺酶、PEG定點修飾激肽原酶、PEG定點修飾精氨酸脫亞胺酶出峰效果均較好，對稱性好，拖尾小?？偨Y(jié)：本專利中發(fā)明人一共考察了8種改性劑，其中正丁醇、異丙醇、3-甲基-1,3-丁二醇和PEG40K、PEG5K均有一定的改善效果，戊二醇、異戊醇因其與水的溶解度有限影響其作為改性劑的應(yīng)用、1,2丙二醇極性較大，使用效果也不理想，綜上所述，針對PEG修飾藥物(蛋白、多肽、小分子等，不限于此)，良好的SEC的改性劑具有以下特征：1)主鏈具有三個或以上碳原子、可溶于水相及有機相的短鏈脂肪醇；2)或與修飾用PEG具有相同分子量或分子量更大的PEG，且用分子量比修飾用PEG更大的PEG作為SEC改性劑時效果更佳。當前第1頁1 2 3