本發(fā)明涉及黃曲霉毒素的測定方法，屬于食品安全檢驗技術領域。

背景技術：

黃曲霉毒素(Aflatoxins，簡寫AF)主要是黃曲霉菌和寄生曲霉菌的代謝產物。黃曲霉毒素主要存在于土壤，動植物，各種堅果，特別是花生和核桃中。在大豆，稻谷，玉米，通心粉，調味品，牛奶，奶制品，食用油等制品中也經常發(fā)現(xiàn)黃曲霉毒素。目前已分離鑒定出12種，包括B₁、B₂、G₁、G2、M1、M2、P1、Q、H1、GM、B2a和毒醇。

黃曲霉毒素的分析方法主要有以薄層層析法、高效液相色譜法和酶聯(lián)免疫吸附法三種。薄層層析法由于設備簡單,易于普及,所以國內外仍在使用,但由于該法樣品前處理繁瑣,且提取和凈化效果不夠理想,提取液中雜質較多,因而在展開時影響斑點的熒光強度,雙向展開法雖避免了雜質干擾,但增加了操作步驟和時間。目前最能被大家認可的分析方法還是液相色譜分析法，它具有自動化程度高，定量定性準確，檢測種類多元的特點，一直是世界各國官方檢測方法。但是，目前針對黃曲霉毒素的高效液相色譜分析法均采用免疫親和柱來富集毒素，酶聯(lián)免疫分析法提及的抗體的缺點仍然無法避免，因此研究一種新的黃曲霉毒素富集方法以擺脫抗體的缺點。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術問題是提供一種操作簡單，結果可靠的黃曲霉毒素的測定方法。

為解決上述技術問題，本發(fā)明采用的技術方案為：

黃曲霉毒素的測定方法，包括樣品提取、標準溶液測定和樣品測定步驟，其創(chuàng)新點在于：所述樣品提取步驟采用乙腈-水的提取液提取，其中乙腈和水的體積比為20:12；所述標準溶液測定步驟中取黃曲霉毒素B₁、G₁標準儲備液用乙腈定容，制備標準系列溶液，處理后利用液相色譜儀進行測定；所述樣品檢測采用高效液相色譜法檢測樣品中的黃曲霉毒素，具體檢測步驟為：

(1)樣品提?。悍Q取樣品10g(精確至0.0001g)，加入乙腈-水的提取液攪拌45分鐘，其中乙腈和水的體積比為20:12，然后用定性濾紙過濾；

(2)標準溶液測定：取黃曲霉毒素B₁、G₁標準儲備液10μg/mL，用乙腈定容至5mL，混勻，2～8℃保存三個月；使用時乙腈配成0.025μg/mL、0.05μg/mL、0.1μg/mL、0.15μg/mL、0.2μg/mL、0.25μg/mL系列標準溶液，吸取標準系列溶液各500μL，在60℃水浴下氮氣吹干，加500mL正己烷和100mL三氯乙酸混勻，45s后于56℃烘箱衍生15min，室溫下放入干燥器中1min后以500uL水-乙腈溶解，混勻后全部進自動進樣瓶中，利用液相色譜儀進行測定；

(3)樣品測定：用高效液相色譜法檢測樣品中的黃曲霉毒素

色譜條件：色譜柱：AgilentSB C-18(25cm×4.6mm)；流動相：體積百分比為85％的乙腈和15％的水；柱溫：45℃，進樣量：25mL；流速：1.0mL/min。

取8mL提取過濾液至多功能凈化柱，凈化柱的收集池內轉移2mL凈化液到衍生瓶中，60℃下氮吹后，加500mL正己烷和100mL三氯乙酸混勻，45s后于56℃烘箱衍生15min，室溫下干燥1min后以500uL水-乙腈溶解，混勻后全部進自動進樣瓶中，上液相色譜儀測定。

(4)黃曲霉毒素的含量計算：黃曲霉毒素按照G₁、B₁的順序出峰，以標準系列的峰面積對濃度分別繪制每種黃曲霉毒素的標準曲線，標準曲線的相關系數(shù)r大于0.995，試樣通過與標準色譜圖保留時間的比較確定每一種黃曲霉毒素的峰，根據(jù)每種黃曲霉毒素的標準曲線及試樣中的峰面積計算試樣中各種黃曲霉毒素含量：

X＝(A×V×1000)/(m×f)

其中：X——試樣中每種黃曲霉毒素含量，單位為μg/kg；

A——試樣按外標法在標準曲線中對應的濃度，單位為μg/mL；

V——試樣提取過程中提取液的體積，單位為mL；

m——試樣的取樣量，單位為g；

f——濃縮倍數(shù)。

進一步的，所述步驟(1)中多功能凈化柱為Mycosep^TM228多功能凈化柱。

本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明的檢測方法操作簡單，快速，結果精確可靠；污染少，安全性高，減少對操作人員和環(huán)境的污染；檢測成本較低，易于推廣。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實施例1的樣品色譜圖；

圖2為本發(fā)明實施例1的黃曲霉毒素B1曲線圖；

圖3為本發(fā)明實施例1的黃曲霉毒素G1曲線圖；

圖4為本發(fā)明實施例2的樣品色譜圖。

具體實施方式

下面結合具體實施例對本發(fā)明的技術方案作詳細說明。

實施例1

(1)樣品提?。悍Q取10.0346g食用植物油，加入乙腈-水的提取液攪拌45分鐘，其中乙腈和水的體積比為20:12，然后用定性濾紙過濾。

(2)標準溶液測定：取黃曲霉毒素B₁、G₁標準儲備液10μg/mL，用乙腈定容至5mL，混勻，2～8℃保存三個月；使用時乙腈配成0.025μg/mL、0.05μg/mL、0.1μg/mL、0.15μg/mL、0.2μg/mL、0.25μg/mL系列標準溶液，吸取標準系列溶液各500μL，在60℃水浴下氮氣吹干，加500mL正己烷和100mL三氯乙酸混勻，45s后于56℃烘箱衍生15min，室溫下放入干燥器中1min后以500uL水-乙腈溶解，混勻后全部進自動進樣瓶中，利用液相色譜儀進行測定，黃曲霉毒素B1曲線圖如圖2，黃曲霉毒素G1曲線圖如圖3。

(3)樣品測定：用高效液相色譜法檢測樣品中的黃曲霉毒素

色譜條件：色譜柱：Agilent SB C-18(25cm×4.6mm)；流動相：體積百分比為85％的乙腈和15％的水；柱溫：45℃，進樣量：25mL；流速：1.0mL/min。

取8mL提取過濾液至Mycosep^TM228多功能凈化柱，凈化柱的收集池內轉移2mL凈化液到衍生瓶中，60℃下氮吹后，加500mL正己烷和100mL三氯乙酸混勻，45s后于56℃烘箱衍生15min，室溫下干燥1min后以500uL水-乙腈溶解，混勻后全部進自動進樣瓶中，液相色譜儀測定，測定的食用油樣品色譜如圖1所示。

根據(jù)標準曲線得出試樣濃度為：2.22(μg/mL)

根據(jù)公式X＝(A×V×1000)/(m×f)

黃曲霉毒素B₁(μg/kg)＝(試樣中對應濃度×提取液體積×1000)/(試樣質量×濃縮倍數(shù))

＝2.22×8×1000/10.0346×10

＝176.98

實施例2

(1)樣品提?。悍Q取10.1679g玉米粉，加入乙腈-水的提取液攪拌45分鐘，其中乙腈和水的體積比為20:12，然后用定性濾紙過濾。

(2)樣品測定：用高效液相色譜法檢測樣品中的黃曲霉毒素

色譜條件：色譜柱：Agilent SB C-18(25cm×4.6mm)；流動相：體積百分比為85％的乙腈和15％的水；柱溫：45℃，進樣量：25mL；流速：1.0mL/min。

取8mL提取過濾液至Mycosep^TM228多功能凈化柱，凈化柱的收集池內轉移2mL凈化液到衍生瓶中，60℃下氮吹后，加500mL正己烷和100mL三氯乙酸混勻，45s后于56℃烘箱衍生15min，室溫下干燥1min后以500uL水-乙腈溶解，混勻后全部進自動進樣瓶中，液相色譜儀測定，測定結果如圖4所示。

根據(jù)標準曲線得出試樣濃度為：50.95(μg/mL)

根據(jù)公式X＝(A×V×1000)/(m×f)

黃曲霉毒素G₁(μg/kg)＝(試樣中對應濃度×提取液體積×1000)/(試樣質量×濃縮倍數(shù))

＝50.95×8×1000/10.1679×10

＝5608.7