本發(fā)明涉及一種液態(tài)樣品中擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留的萃取方法，尤其是高鹽或/和高蛋白樣品中擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留的萃取方法，屬于農(nóng)藥殘留檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

擬除蟲菊酯類農(nóng)藥是一種廣譜殺蟲劑，對(duì)農(nóng)林、園藝、倉(cāng)庫(kù)、畜牧、衛(wèi)生等多種害蟲有良好的防治效果。由于其價(jià)格低廉、藥效高和毒性低等優(yōu)點(diǎn)，擬除蟲菊酯類農(nóng)藥被廣泛用于水果和蔬菜等生長(zhǎng)過程中，并且用于室內(nèi)和室外的除蟲過程中。擬除蟲菊酯類農(nóng)藥很容易隨地表水的滲透和水土流失擴(kuò)散。但是，此類農(nóng)藥具有神經(jīng)毒性，可以對(duì)昆蟲和哺乳動(dòng)物產(chǎn)生神經(jīng)毒害作用，而且它們是脂溶性的化合物，對(duì)光和溫度不敏感。研究表明，長(zhǎng)期處于擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的環(huán)境中，會(huì)引起頭痛、頭昏、惡心、嘔吐、上腹部灼痛感、乏力、食欲不振、胸悶、流涎等癥狀。因此，關(guān)于擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的殘留檢測(cè)一直是人們關(guān)注的焦點(diǎn)問題。

世界衛(wèi)生組織(WHO)規(guī)定飲用水中每一種農(nóng)藥最大殘留限量(MRL)是0.10μg/L，而且規(guī)定飲用水中不能有氯菊酯檢出。歐盟也對(duì)食物和植物種子中的農(nóng)藥最大殘留量進(jìn)行了限定。因此，這就要求要有高靈敏度的檢測(cè)方法來測(cè)定此類農(nóng)藥。然而，樣品前處理又是整個(gè)檢測(cè)方法的核心問題。

目前，關(guān)于除蟲菊酯類農(nóng)藥的樣品前處理方法主要有液液萃取、固相萃取、分散液液微萃取、基質(zhì)固相分散、液相微萃取和頂空固相微萃取等方法。這些前處理方法存在消耗有機(jī)溶劑多、樣品通量小、應(yīng)用范圍有限、操作繁瑣、耗費(fèi)時(shí)間、成本高等不足之處，對(duì)于除蟲菊酯類農(nóng)藥的萃取凈化不是簡(jiǎn)單或有效的方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明提供了一種液態(tài)樣品中擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留的萃取方法，尤其是高鹽或/和高蛋白樣品中擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留的萃取方法，可用于擬除蟲菊酯類農(nóng)藥——聯(lián)苯菊酯(bifenthrin)，氯菊酯(permethrin)，β-氟氯氰菊酯(β-cyfluthrin)和氰戊菊酯(fenvalerate)的萃取、凈化。本發(fā)明的萃取方法——鹽析輔助液液萃取無需對(duì)樣品基質(zhì)進(jìn)行除鹽及除蛋白的處理，可直接對(duì)樣品進(jìn)行萃取，在萃取的同時(shí)實(shí)現(xiàn)樣品的除鹽及除蛋白過程，即在快速萃取樣品的同時(shí)實(shí)現(xiàn)了樣品的凈化。向樣品溶液中加入乙腈，利用擬除蟲菊酯類農(nóng)藥在乙腈相中的溶解度大于水相中的溶解度的特點(diǎn)，擬除蟲菊酯類農(nóng)藥會(huì)溶解到乙腈相中，不必采用超聲等方法加速溶解；再向此均一溶液中加入鹽析液，由于無機(jī)鹽在水中的溶解度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于乙腈在水中的溶解度，溶解有擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的乙腈相就從均一溶液中鹽析出來，實(shí)現(xiàn)相分離，省去了離心的步驟。本發(fā)明的萃取方法簡(jiǎn)單、快速、低耗，最重要的是不需要進(jìn)行離心、超聲等復(fù)雜的過程，僅通過鹽析就能實(shí)現(xiàn)兩相分離。萃取后的樣品經(jīng)過濾后可直接進(jìn)行氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)測(cè)定。

本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

一種液態(tài)樣品中擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留的萃取方法，包括以下步驟：

(1)取待檢測(cè)的液態(tài)樣品，調(diào)節(jié)pH值至3(用5％磷酸溶液或0.5mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié))，加入乙腈，乙腈與樣品的體積比為1:1，混勻，得均一溶液；

進(jìn)一步地，所述液態(tài)樣品，為高鹽或/和高蛋白樣品，包括尿液、廢水、海水等；

(2)向上述均一溶液中加入鹽析液，鹽析液與均一溶液的體積比為1:1；靜置至分層；

(3)分層后，取上層乙腈相，0.45μm微孔濾膜過濾，然后即可直接進(jìn)行氣相色譜-質(zhì)譜測(cè)定；

所述鹽析液是通過以下方法制備得到的：配制100mmol/L的磷酸鹽緩沖液，加入氯化鈉，加入后氯化鈉的濃度為5mol/L，調(diào)節(jié)鹽析液的pH值為4(用5％磷酸溶液或0.5mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié))。

所述擬除蟲菊酯類農(nóng)藥，選自聯(lián)苯菊酯，氯菊酯，β-氟氯氰菊酯或/和氰戊菊酯。

所述氣相色譜-質(zhì)譜測(cè)定為常規(guī)方法，具體測(cè)定時(shí)，可采用下述方法：

(1)用甲醇作溶劑配制擬除蟲菊酯農(nóng)藥的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，聯(lián)苯菊酯，氯菊酯，β-氟氯氰菊酯和氰戊菊酯的濃度范圍依次為：5～5000ng/mL、25～5000ng/mL、200～5000ng/mL和25～5000ng/mL；

(2)用GC-MS測(cè)定所述擬除蟲菊酯農(nóng)藥的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中各農(nóng)藥組分的色譜峰保留時(shí)間和色譜峰面積，以色譜峰保留時(shí)間定性，以濃度為橫坐標(biāo)，以色譜峰面積為縱坐標(biāo)繪制出擬除蟲菊酯農(nóng)藥的標(biāo)準(zhǔn)曲線；

(3)測(cè)定擬除蟲菊酯農(nóng)藥的GC-MS條件為：

色譜柱：型號(hào)為ZebronTMZB-5MS的毛細(xì)管色譜柱，規(guī)格為30m×0.25mm×0.25μm；進(jìn)樣量：1.0μL，不分流進(jìn)樣；進(jìn)樣口溫度：270℃；柱溫：初始溫度220℃，25℃/min升至270℃，保持4min，5℃/min升至280℃，保持2min；載氣：高純氮?dú)?，純度?9.999％；恒流模式，流速1mL/min；檢測(cè)器：質(zhì)譜檢測(cè)器；離子源溫度：260℃；接口溫度：290℃；溶劑延遲時(shí)間：2.5min。

(4)采用外標(biāo)法對(duì)樣品中擬除蟲菊酯類農(nóng)藥進(jìn)行定量分析。

本發(fā)明的擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留的萃取方法，減少了有機(jī)試劑的用量，且不需用到離心、超聲和震蕩等設(shè)備；縮減了常規(guī)方法對(duì)擬除蟲菊酯農(nóng)藥的檢測(cè)步驟及人力，提升了檢測(cè)效率。傳統(tǒng)的液液萃取要用到大量的有機(jī)試劑，而且操作比較繁瑣；而固相萃取雖然是一種經(jīng)典的萃取方法，但是要用到固相萃取裝置、固相萃取小柱，固相萃取小柱的重現(xiàn)性問題會(huì)影響后續(xù)測(cè)定的準(zhǔn)確度；另外，固相萃取后續(xù)還需要用氮吹儀進(jìn)行濃縮；整個(gè)萃取過程耗時(shí)久，而且也要用到大量的有機(jī)試劑進(jìn)行小柱沖洗及樣品洗脫。新型的微萃取方法如分散液液微萃取一般要用到氯苯和溴苯等有毒有機(jī)試劑，而固相微萃取方法雖然有機(jī)試劑用量少，但是微萃取材料的制備及重現(xiàn)性也是目前被廣泛關(guān)注的問題。本發(fā)明不需要特殊的設(shè)備，只需進(jìn)行簡(jiǎn)單的加試劑就可以實(shí)現(xiàn)樣品中擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的萃取，本發(fā)明簡(jiǎn)單、快速、回收率高；同時(shí)還明顯降低了氣相色譜相關(guān)耗材的消耗程度，延長(zhǎng)了毛細(xì)管柱的使用時(shí)間及氣相色譜-質(zhì)譜儀的使用壽命?？梢灶A(yù)計(jì)，本發(fā)明的方法在農(nóng)藥殘留測(cè)定技術(shù)領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景。

附圖說明

圖1：本發(fā)明的鹽析液液萃取萃取過程示意圖。

圖2：尿液空白及加標(biāo)回收色譜圖，其中，4種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的加標(biāo)濃度分別為：聯(lián)苯菊酯50ng/mL，氯菊酯250ng/mL，β-氟氯氰菊酯500ng/mL，氰戊菊酯250ng/mL；a為空白樣品，b為加標(biāo)樣品。

圖3：廢水空白及加標(biāo)回收色譜圖，其中，4種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的加標(biāo)濃度分別為：聯(lián)苯菊酯50ng/mL，氯菊酯250ng/mL，β-氟氯氰菊酯500ng/mL，氰戊菊酯250ng/mL。

圖4：海水空白及加標(biāo)回收色譜圖，其中，4種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的加標(biāo)濃度分別為：聯(lián)苯菊酯50ng/mL，氯菊酯250ng/mL，β-氟氯氰菊酯500ng/mL，氰戊菊酯250ng/mL。

具體實(shí)施方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。

下述實(shí)施例中所涉及的儀器、試劑、材料等，若無特別說明，均為現(xiàn)有技術(shù)中已有的常規(guī)儀器、試劑、材料等，可通過正規(guī)商業(yè)途徑獲得。下述實(shí)施例中所涉及的實(shí)驗(yàn)方法，檢測(cè)方法等，若無特別說明，均為現(xiàn)有技術(shù)中已有的常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法，檢測(cè)方法等。

實(shí)驗(yàn) 最佳萃取條件的篩選

萃取方法如下：取2mL樣品(4種擬除蟲菊酯農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液)，置于10mL玻璃離心管中，調(diào)節(jié)pH值至設(shè)計(jì)值(用5％磷酸溶液或0.5mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)；見表1)，加入2mL乙腈，混勻，得均一溶液。向均一溶液中加入鹽析液(鹽析液的用量及pH見表1)，溶液即分為兩層，上層為乙腈相，下層為水相。取上層乙腈相，經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾后進(jìn)行氣相色譜-質(zhì)譜檢測(cè)。

所述鹽析液是通過以下方法制備得到的：配制100mmol/L的磷酸鹽緩沖液，加入氯化鈉，加入后氯化鈉的濃度為5mol/L，調(diào)節(jié)鹽析液的pH值。

本實(shí)驗(yàn)采用三因素三水平正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)獲得最佳萃取條件，正交設(shè)計(jì)表見表1。其中pH1為待檢測(cè)液態(tài)樣品pH值，pH2為鹽析液pH值，V為鹽析液體積。以各擬除蟲菊酯類農(nóng)藥峰面積作為衡量指標(biāo)，峰面積最大時(shí)的實(shí)驗(yàn)組合為最佳實(shí)驗(yàn)組合。

從表1可以看出，7號(hào)組合得到的各擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的峰面積最大，所以選定樣品pH為3，鹽析液pH為4，鹽析液體積為4mL。

表1正交設(shè)計(jì)表及相應(yīng)的峰面積數(shù)值

實(shí)施例1：尿液、廢水和海水樣品中擬除蟲菊酯農(nóng)藥殘留的萃取及檢測(cè)

1.萃取及檢測(cè)方法

萃取方法步驟如下：各取2mL尿樣、廢水和海水樣品，分別置于10mL玻璃離心管中，調(diào)節(jié)pH值至3(用5％磷酸溶液或0.5mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié))，各加入2mL乙腈，混勻，得均一溶液。向均一溶液中加入4mL鹽析液(pH＝4)，溶液即分為兩層，上層為乙腈相，下層為水相。取上層乙腈相，經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾后進(jìn)行氣相色譜-質(zhì)譜檢測(cè)(流程如圖1所示)。

所述鹽析液是通過以下方法制備得到的：配制100mmol/L的磷酸鹽緩沖液，加入氯化鈉，加入后氯化鈉的濃度為5mol/L，調(diào)節(jié)鹽析液的pH值為4。

氣相色譜-質(zhì)譜檢測(cè)步驟如下：

(1)用甲醇作溶劑配制擬除蟲菊酯農(nóng)藥的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，聯(lián)苯菊酯，氯菊酯，β-氟氯氰菊酯和氰戊菊酯的濃度范圍依次為：5～5000ng/mL、25～5000ng/mL、200～5000ng/mL和25～5000ng/mL；

(2)用GC-MS測(cè)定所述擬除蟲菊酯農(nóng)藥的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中各農(nóng)藥組分的色譜峰保留時(shí)間和色譜峰面積，以色譜峰保留時(shí)間定性，以濃度為橫坐標(biāo)，以色譜峰面積為縱坐標(biāo)繪制出擬除蟲菊酯農(nóng)藥的標(biāo)準(zhǔn)曲線；

(3)測(cè)定擬除蟲菊酯農(nóng)藥的GC-MS條件為：

色譜柱：型號(hào)為ZebronTMZB-5MS的毛細(xì)管色譜柱，規(guī)格為30m×0.25mm×0.25μm；進(jìn)樣量：1.0μL，不分流進(jìn)樣；進(jìn)樣口溫度：270℃；柱溫：初始溫度220℃，25℃/min升至270℃，保持4min，5℃/min升至280℃，保持2min；載氣：高純氮?dú)?，純度?9.999％；恒流模式，流速1mL/min；檢測(cè)器：質(zhì)譜檢測(cè)器；離子源溫度：260℃；接口溫度：290℃；溶劑延遲時(shí)間：2.5min。

(4)采用外標(biāo)法對(duì)樣品中擬除蟲菊酯類農(nóng)藥進(jìn)行定量分析。

2.結(jié)果

(1)采用上述GC-MS條件測(cè)定4種擬除蟲菊酯農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，標(biāo)樣分離效果較好，峰形對(duì)稱，基線穩(wěn)定，說明儀器條件適合。在此色譜條件下擬除蟲菊酯類農(nóng)藥保留時(shí)間分別為：聯(lián)苯菊酯4.50min，氯菊酯6.52min和6.70min，β-氟氯氰菊酯7.60min和7.69min，氰戊菊酯10.05min和10.62min(如圖2、圖3、圖4所示)。

(2)方法的線性范圍、回歸方程與檢出限

以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，4種農(nóng)藥在其濃度范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)(r)均大于0.990，如表2所示。以3倍信噪比計(jì)算各農(nóng)藥的檢出限(LOD)，4種擬除蟲菊酯農(nóng)藥的LOD在1.5～60.6ng/mL之間。

表2擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限

(3)尿樣、廢水和海水樣品的測(cè)定結(jié)果

結(jié)果如表3所示，尿液和海水樣品中均未有4種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥檢出，在廢水樣品中有聯(lián)苯菊酯、氯菊酯和氰戊菊酯檢出，其濃度分別為4.2ng/mL，30.0ng/mL和35.5ng/mL。

(4)本發(fā)明方法的回收率與精密度

取2.0mL樣品(即上述的尿樣、廢水和海水樣品)，分別加入3種不同濃度水平的農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，擬除蟲菊酯農(nóng)藥的添加水平為20～100ng/mL，每個(gè)濃度水平平行3份樣品，按照上述方法進(jìn)行樣品前處理和色譜條件測(cè)定。采用外標(biāo)法定量，計(jì)算各農(nóng)藥的平均回收率及其標(biāo)準(zhǔn)偏差(即SD)，結(jié)果如表3所示，樣品空白及加標(biāo)色譜圖如圖2、圖3、圖4所示。

由表3可知，4種擬除蟲菊酯農(nóng)藥聯(lián)苯菊酯、氯菊酯、β-氟氯氰菊酯和氰戊菊酯的平均回收率分別為74～110％、75～109％、75～89％和78～103％，相應(yīng)的SD分別為2.1～9.8％、1.8～8.9％、4.6～9.6％和3.5～9.2％，說明本發(fā)明的方法具有良好的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。

以上實(shí)施例表明，鹽析液液萃取-氣相色譜-質(zhì)譜方法可用于尿液、廢水和海水樣品中擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的檢測(cè)，鹽析液液萃取方法簡(jiǎn)單、快速、低耗，在萃取樣品的同時(shí)去除了樣品基質(zhì)(除鹽和除蛋白)。氣相色譜-質(zhì)譜方法為此類農(nóng)藥的檢測(cè)提供了高的靈敏度。結(jié)果證明此方法靈敏、快速，可作為一種農(nóng)藥殘留測(cè)定的方法進(jìn)行推廣。

表3 4種農(nóng)藥在尿液、廢水和海水樣品中的添加回收結(jié)果(n＝3)