專利名稱：一種黃曲霉毒素b1的發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵方法
技術領域：
本發(fā)明屬于發(fā)酵工程技術領域，特別涉及一種產(chǎn)生黃曲霉毒素BI的發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵方法。
背景技術：
黃曲霉毒素(Aflatoxins)是黃曲霉或寄生曲霉產(chǎn)生的一類真菌毒素，為劇毒和強致癌物，于1993年被世界衛(wèi)生組織(WHO)的癌癥研究機構劃定為I類致癌物。目前已確定的黃曲霉毒素有20多種，而污染糧食的黃曲霉毒素主要有黃曲霉毒素BI、B2、Gl、G2和Ml等。黃曲霉毒素的危害性在于對人及動物肝臟組織有破壞作用，嚴重時可導致肝癌甚至急性中毒死亡。在天然污染的糧食中，黃曲霉毒素BI毒性最大，量也最多，致癌性也最強。黃曲霉毒素BI可在玉米，花生，花生油、大米、棉籽、禽蛋、肉、奶(奶制品)和一些干果中檢測至IJ，尤其是高溫高濕地區(qū)的糧油及制品中檢出率和含量更高。如果含有黃曲霉毒素BI的食 品被人食用，會引起急性黃曲霉毒素中毒或誘發(fā)肝癌。含有黃曲霉毒素BI的飼料被動物食用，常引起動物急性中毒或帶來抗病力低等亞臨床癥狀。此外，乳用動物(如奶牛)還可將飼料中的黃曲霉毒素BI轉化為乳品中的黃曲霉毒素M1，進而帶來乳品和乳制品的食品安全問題。為了探索食品或飼料中黃曲霉毒素BI的含量控制方法，需要開發(fā)出適合黃曲霉生長(復蘇)快、活力高的培養(yǎng)基，研究黃曲霉的生長特性和產(chǎn)毒規(guī)律。在進行食品或飼料中黃曲霉毒素BI含量檢測時，實驗需要的黃曲霉毒素BI標準品，均來自國外純品，原因之一在于國內黃曲霉發(fā)酵培養(yǎng)基中黃曲霉毒素BI含量偏低，提取所需培養(yǎng)基量大，成本高。另夕卜，要深入研究黃曲霉毒素BI的致病機理，也必須選用黃曲霉毒素BI含量高的培養(yǎng)物或黃曲霉毒素BI的提取物，進行動物實驗，建立各種動物模型，對其致毒和解毒進行研究。目前，國內部分研究者進行動物毒理研究所使用的黃曲霉毒素BI，常來自國外的純品，價格昂貴(如Sigma公司生產(chǎn)黃曲霉毒素BI價格為569RMB/mg)，試驗成本高。而目前國內報道的黃曲霉培養(yǎng)物中黃曲霉毒素BI最高含量為3312ppb (莊振宏，2010)，毒素含量較低，單次實驗所需培養(yǎng)物多，對實驗的干擾也大。綜上所述，有必要開發(fā)出黃曲霉毒素BI的發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵方法，研究黃曲霉的生長特性，探索出飼料和食品中黃曲霉毒素BI含量的最佳控制方法和開展黃曲霉素BI對動物的致毒解毒實驗研究。

發(fā)明內容
本發(fā)明提供了一種產(chǎn)生黃曲霉毒素BI的發(fā)酵培養(yǎng)基,用于解決目前傳統(tǒng)培養(yǎng)基的孢子活力低、生長(復蘇)周期長、以及產(chǎn)毒量低的問題。本發(fā)明還提供了一種生產(chǎn)黃曲霉毒素BI的發(fā)酵方法。本發(fā)明解決其技術問題所采用的技術方案是
一種黃曲霉毒素BI的發(fā)酵培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基的組份中含有占培養(yǎng)基總重量I 5%的酵母提取物，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基為復蘇培養(yǎng)基、固體發(fā)酵培養(yǎng)基或生長促進營養(yǎng)液。作為優(yōu)選，所述的復蘇培養(yǎng)基各組分按重量百分比計包括5 20%蔗糖，I 5%酵母提取物，I 5%麩皮浸提液，I. 5%瓊脂，I 4g/L硝酸鈉，O. 2 O. 8g/L硫酸鎂，O. 2
0.8 g/L氯化鉀，O. 6 1.2 g/L磷酸氫二鉀，0.01g/L五水硫酸亞鐵，余量為水，培養(yǎng)基的初始pH為5. 5 7. O。為了實現(xiàn)黃曲霉孢子的快速復蘇，發(fā)明人設計了由蔗糖、酵母提取物、麩皮浸提液、瓊脂、NaNO3和微量元素配制成新的黃曲霉復蘇培養(yǎng)基，試驗顯示利用本發(fā)明復蘇培養(yǎng)基，黃曲霉孢子復蘇所需的時間僅需二天，比傳統(tǒng)Czapek’ s培養(yǎng)基的復蘇時間縮短四天。作為優(yōu)選，所述的固體發(fā)酵培養(yǎng)基各組分按重量百分比計包括60 80%秈米，8 30%蔗糖，4 10%豆柏，I 5%酵母提取物，I 5%麩皮，按比例配制完后，調節(jié)固體發(fā)酵培養(yǎng)基含水量為5 10%。作為優(yōu)選，所述的秈米、豆柏和麩皮經(jīng)粉碎，過20 40目標準分樣篩。該固體發(fā)酵培養(yǎng)基可實現(xiàn)黃曲霉高效產(chǎn)黃曲霉毒素BI。
作為優(yōu)選，所述的生長促進營養(yǎng)液各組分按重量百分比計包括5 20%蔗糖，I 5%酵母提取物，I 5%麩皮浸提液，I 4g/L硝酸鈉，O. 2 O. 8g/L硫酸鎂，O. 2 O. 8 g/L氯化鉀，O. 6 1.2 g/L磷酸氫二鉀，O. 01g/L五水硫酸亞鐵，余量為水，培養(yǎng)基的初始pH為5. 5 7. O。該生長促進營養(yǎng)液用于補充發(fā)酵培養(yǎng)過程中營養(yǎng)物質和水分的損失,可確保黃曲霉菌在固體發(fā)酵培養(yǎng)基上高活力生長。作為優(yōu)選，所述麩皮浸提液的制備方法如下取I單位重量麩皮置于干凈燒杯中，然后加注4單位重量蒸餾水，將麩皮和水充分混合均勻后，放置在37°C恒溫水浴鍋中，浸泡10 12h，取上清液放置于離心管中，2000 3000rpm，離心5 10分鐘，再將離心管中的上清液吸入到干凈的燒杯中，麩皮浸出物制備完畢。制備的麩皮浸出物要求現(xiàn)配現(xiàn)用。培養(yǎng)基的滅菌要求所述的復蘇培養(yǎng)基、固體發(fā)酵培養(yǎng)基及生長促進營養(yǎng)液，分別按比例配制好后(其中復蘇培養(yǎng)基還需經(jīng)過電爐加熱溶解瓊脂)，置于錐形瓶中在121 123 0C，O. 12MPa，滅菌20min，各培養(yǎng)基配制工作結束。復蘇培養(yǎng)基的倒置在生物安全柜中，將滅菌好的復蘇培養(yǎng)基倒置在經(jīng)過滅菌的直徑IOcm培養(yǎng)皿中，自然冷卻。一種黃曲霉毒素BI的發(fā)酵方法，包括菌種復蘇和固體發(fā)酵培養(yǎng)兩個步驟，采用黃曲霉菌種進行發(fā)酵，采用本發(fā)明提供的發(fā)酵培養(yǎng)基進行菌種復蘇和固體發(fā)酵培養(yǎng)。該方法采用了上述改進后的培養(yǎng)基，發(fā)酵選用的菌種為黃曲霉菌(來自中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，編號3. 4409)，發(fā)酵工藝采用常規(guī)的工藝。按照本發(fā)明提供的培養(yǎng)基和培養(yǎng)程序，黃曲霉毒素BI發(fā)酵培養(yǎng)基固體風干物中濃度可達7349ppb，相比現(xiàn)有技術的發(fā)酵效價，具有顯著的進步。本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明研制的黃曲霉復蘇培養(yǎng)基，霉菌生長速度快，孢子活力高，復蘇或傳代的時間極大縮短，提高了工作效率。本發(fā)明研制的固體發(fā)酵培養(yǎng)基，營養(yǎng)豐富，菌體生長旺盛，培養(yǎng)周期短，僅需12 14天，相對普通大米培養(yǎng)基，培養(yǎng)時間縮短3 4天，且黃曲霉毒素BI濃度顯著提高。本發(fā)明提供的固體發(fā)酵培養(yǎng)基，主要采用秈米、麩皮、豆柏、蔗糖和酵母，原料易得、廉價。相對從國外進口的黃曲霉毒素BI，本發(fā)明提供的培養(yǎng)基生產(chǎn)出的黃曲霉素BI價格可降低80%以上。本發(fā)明提供的發(fā)酵方法，簡單易行，可操作性強。
具體實施例方式下面通過具體實施例，對本發(fā)明的技術方案作進一步的具體說明。應當理解，本發(fā)明的實施并不局限于下面的實施例，對本發(fā)明所做的任何形式上的變通和/或改變都將落入本發(fā)明保護范圍。在本發(fā)明中，若非特指，所有的份、百分比均為重量單位，所有的設備和原料等均可從市場購得或是本行業(yè)常用的。本發(fā)明的各實施例，以中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心提供的黃曲霉(Aspergillus f lavus) 3. 4409,進行闡述。實施例1-4黃曲霉生長促進營養(yǎng)液的配制將表I所示的各組份混合后，用鹽酸溶液調節(jié)混合溶液的PH值為5. 5 7. O。表I
權利要求
1.一種黃曲霉毒素BI的發(fā)酵培養(yǎng)基，其特征在于該培養(yǎng)基的組份中含有占培養(yǎng)基總重量I 5%的酵母提取物，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基為復蘇培養(yǎng)基、固體發(fā)酵培養(yǎng)基或生長促進營養(yǎng)液。
2.根據(jù)權利要求I所述的一種黃曲霉毒素BI的發(fā)酵培養(yǎng)基，其特征在于所述的復蘇培養(yǎng)基各組分按重量百分比計包括5 20%蔗糖，I 5%酵母提取物，I 5%麩皮浸提液，I.5%瓊脂，I 4g/L硝酸鈉，O. 2 O. 8g/L硫酸鎂，O. 2 O. 8 g/L氯化鉀，O. 6 I. 2 g/L磷酸氫二鉀，O. OI g/L五水硫酸亞鐵，余量為水，培養(yǎng)基的初始pH為5. 5 7. O。
3.根據(jù)權利要求I所述的一種黃曲霉毒素BI的發(fā)酵培養(yǎng)基，其特征在于所述的固體發(fā)酵培養(yǎng)基各組分按重量百分比計包括60 80%秈米，8 30%蔗糖，4 10%豆柏，I 5%酵母提取物，I 5%麩皮，按比例配制完后，調節(jié)固體發(fā)酵培養(yǎng)基含水量為5 10%。
4.根據(jù)權利要求3所述的一種黃曲霉毒素BI的發(fā)酵培養(yǎng)基，其特征在于所述的秈米、豆柏和麩皮經(jīng)粉碎，過20 40目標準分樣篩。·
5.根據(jù)權利要求I所述的一種黃曲霉毒素BI的發(fā)酵培養(yǎng)基,其特征在于所述的生長促進營養(yǎng)液各組分按重量百分比計包括5 20%蔗糖，I 5%酵母提取物，I 5%麩皮浸提液，I 4g/L硝酸鈉，O. 2 O. 8g/L硫酸鎂，O. 2 O. 8 g/L氯化鉀，O. 6 I. 2 g/L磷酸氫二鉀，O. OI g/L五水硫酸亞鐵，余量為水，培養(yǎng)基的初始pH為5. 5 7. O。
6.根據(jù)權利要求2或5所述的一種黃曲霉毒素BI的發(fā)酵培養(yǎng)基,其特征在于所述麩皮浸提液的制備方法如下取I單位重量麩皮置于干凈燒杯中，然后加注4單位重量蒸餾水，將麩皮和水充分混合均勻后，放置在37°C恒溫水浴鍋中，浸泡10 12h，取上清液放置于離心管中，2000 3000rpm，離心5 10分鐘，再將離心管中的上清液吸入到干凈的燒杯中，麩皮浸出物制備完畢。
7.一種黃曲霉毒素BI的發(fā)酵方法，包括菌種復蘇和固體發(fā)酵培養(yǎng)兩個步驟，采用黃曲霉菌種進行發(fā)酵，其特征在于采用如權利要求I所述的發(fā)酵培養(yǎng)基進行菌種復蘇和固體發(fā)酵培養(yǎng)。
全文摘要
本發(fā)明屬于發(fā)酵工程技術領域，特別涉及一種產(chǎn)生黃曲霉毒素B1的發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵方法。一種黃曲霉毒素B1的發(fā)酵培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基的組份中含有占培養(yǎng)基總重量1～5%的酵母提取物，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基為復蘇培養(yǎng)基、固體發(fā)酵培養(yǎng)基或生長促進營養(yǎng)液。一種黃曲霉毒素B1的發(fā)酵方法，包括菌種復蘇和固體發(fā)酵培養(yǎng)兩個步驟，采用黃曲霉菌種進行發(fā)酵，采用本發(fā)明提供的發(fā)酵培養(yǎng)基進行菌種復蘇和固體發(fā)酵培養(yǎng)。按照本發(fā)明提供的培養(yǎng)基和培養(yǎng)程序，黃曲霉毒素B1發(fā)酵培養(yǎng)基固體風干物中濃度可達7349ppb，相比現(xiàn)有技術的發(fā)酵效價，具有顯著的進步。
文檔編號C12P17/18GK102851334SQ201210225758
公開日2013年1月2日 申請日期2012年7月3日 優(yōu)先權日2012年7月3日
發(fā)明者劉建新, 熊江林, 葉均安 申請人:浙江大學