本發(fā)明屬于藥品檢測(cè)領(lǐng)域，涉及一種測(cè)定曲司氯銨含量的方法。
背景技術(shù)：
：曲司氯銨是一種毒蕈堿受體拮抗劑，通過(guò)阻斷乙酰膽堿對(duì)毒蕈堿受體的作用，進(jìn)而影響由乙酰膽堿介導(dǎo)神經(jīng)沖動(dòng)的器官，包括膀胱。曲司氯銨的副交感神經(jīng)組織作用降低膀胱中的肌肉緊張。曲司氯銨是治療伴有急迫性尿失禁、尿急、尿頻的膀胱過(guò)度活動(dòng)癥(overactivebladder，OAB)的一線用藥，與其他抗毒蕈堿受體藥物相比具有神經(jīng)系統(tǒng)副作用小的優(yōu)勢(shì)，其結(jié)構(gòu)式如下：目前關(guān)于曲司氯銨原料及相關(guān)制劑的分析方法的報(bào)道不多，其中關(guān)于曲司氯銨原料含量的測(cè)定方法采用是滴定法分析。滴定法測(cè)定含量耗時(shí)較長(zhǎng)，需要10-20分鐘，另外當(dāng)用于制劑中藥物含量測(cè)定時(shí)，無(wú)法排除輔料的干擾，并且當(dāng)溶液濃度較低時(shí)，靈敏度受低濃度時(shí)電極電位測(cè)量準(zhǔn)確度的限制。目前，液相色譜是現(xiàn)代色譜技術(shù)中最活躍的分析方法之一。近年來(lái)，隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步和工業(yè)發(fā)展，各領(lǐng)域?qū)σ合嗌V技術(shù)的要求日益提高。首先是隨著生產(chǎn)力的不斷發(fā)展，大批量樣品的分析需要在很短的時(shí)間內(nèi)完成，其次是在生化樣品及天然產(chǎn)物樣品的分析中，樣品的復(fù)雜性對(duì)分離能力提出了更高的要求等。因此，研發(fā)出一種基于小顆粒填料的液相色譜技術(shù)—超高效液相色譜(UltraPerformanceLiquidChromatography，UPLC)并成功地應(yīng)用于各分析行業(yè)?，F(xiàn)今還未見使用UPLC來(lái)分析曲司氯銨原料以及制劑的含量的相關(guān)報(bào)道。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種測(cè)定曲司氯銨含量的方法。本發(fā)明提供一種測(cè)定曲司氯銨含量的方法，所述方法為使用超高效液相色譜法測(cè)定曲司氯銨的含量，包括以下步驟：1)分別配制曲司氯銨對(duì)照樣品溶液和待測(cè)樣品溶液；2)將步驟1)制備得到的所述對(duì)照樣品溶液和所述待測(cè)樣品溶液進(jìn)行超高效液相色譜檢測(cè)，得到超高效液相色譜圖；3)將所得色譜圖利用外標(biāo)法以峰面積計(jì)算，以步驟2)所得到的對(duì)照樣品溶液的超高效液相色譜圖作為對(duì)照，計(jì)算所述待測(cè)樣品中曲司氯銨的含量，其中，所述待測(cè)樣品為含有曲司氯銨的物質(zhì)。步驟2)中所述檢測(cè)的條件為：所用色譜柱為反相色譜柱，進(jìn)一步優(yōu)選為反相C18或C8色譜柱；流動(dòng)相為pH值2.0～7.0的由磷酸水溶液和乙腈組成的混合液；其中，所述磷酸水溶液的濃度為0.01mol/L～0.06mol/L，所述磷酸水溶液與乙腈的體積比為(65～85)：(15～35)；所用流動(dòng)相的流速為0.4ml/min～0.8ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為210nm～220nm。在本發(fā)明的實(shí)施例中，所述pH值為2.0、3.0、5.0、7.0，所述pH值優(yōu)選為3.0～5.0。優(yōu)選地，所述磷酸水溶液和乙腈的體積比為(65～70)：(30～35)或(70～85)：(15～30)，進(jìn)一步優(yōu)選地，所述磷酸水溶液與乙腈的體積份數(shù)比為65：35或70：30或85：15。在本發(fā)明的實(shí)施例中，所述流動(dòng)相的流速為0.4ml/min、0.5ml/min、0.6ml/min或0.8ml/min。在本發(fā)明的實(shí)施例中，所述檢測(cè)波長(zhǎng)具體可為210nm、215nm、220nm；優(yōu)選地，所述色譜柱的柱溫為30～50℃，進(jìn)一步優(yōu)選地，所述色譜柱的柱溫為30℃、40℃、35℃、50℃。在本發(fā)明的實(shí)施例中，所述反相色譜柱為WatersUPLCBEHShieldRP18、WatersUPLCBEHC18、WatersXBridgeBEHShieldRP18、AgilentZORBAXRRHDSB-C18或WatersUPLCBEHC8；優(yōu)選地，所述反相色譜柱中填料的粒徑為1.7μm～2.5μm，色譜柱的柱長(zhǎng)為50mm～100mm，孔徑為2.1mm～4.6mm。在本發(fā)明的實(shí)施例中，所述方法進(jìn)樣量均為1μl。在本發(fā)明的實(shí)施例中，所述對(duì)照樣品溶液的濃度范圍為10.10μg/ml～100.98μg/ml。所述曲司氯銨對(duì)照樣品溶液的出峰位置為0.627min、0.628min或0.627min-0.628min。本發(fā)明利用外標(biāo)法以峰面積計(jì)算得到待測(cè)樣品中曲司氯銨含量的方法，其原理是基于曲司氯銨對(duì)照樣品溶液的濃度與超高效液相色譜圖檢測(cè)所得譜圖中曲司氯銨對(duì)應(yīng)峰的峰面積成線性關(guān)系，故在已知曲司氯銨對(duì)照樣品溶液的濃度、曲司氯銨對(duì)應(yīng)峰的峰面積以及待測(cè)樣品中相同位置對(duì)應(yīng)峰的峰面積的前提下，即可通過(guò)該線性關(guān)系計(jì)算得到待測(cè)樣品中曲司氯銨的含量。在本發(fā)明的實(shí)施例中，所述含曲司氯銨的物質(zhì)為曲司氯銨原料藥及各種曲司氯銨制劑；優(yōu)選地，所述曲司氯銨制劑為曲司氯銨雙釋放膠囊、曲司氯銨緩釋膠囊、曲司 氯銨片或曲司氯銨緩釋片。在本發(fā)明的實(shí)施例中，所用檢測(cè)儀為WatersACQUITYUPLCH-ClassBio超高效液相色譜儀。本發(fā)明提供的一種測(cè)定曲司氯銨含量的方法各個(gè)測(cè)定條件均得到了優(yōu)化，具有以下技術(shù)效果：1、延長(zhǎng)色譜柱使用壽命、準(zhǔn)確性高：在液相技術(shù)中，色譜柱的使用壽命與使用流動(dòng)相的pH直接相關(guān)，pH越低，對(duì)色譜柱的損壞越大，同時(shí)由于曲司氯銨對(duì)堿敏感，pH較高時(shí)容易發(fā)生降解，影響其含量測(cè)定。因此在本發(fā)明方法中，申請(qǐng)人對(duì)流動(dòng)相pH進(jìn)行了摸索,最后將流動(dòng)相pH確定為2～7，優(yōu)選為3.0～5.0，不僅可延長(zhǎng)色譜柱的使用壽命，還可避免高pH對(duì)曲司氯銨的破壞，并且該方法回收率在98％～102％之間，方法準(zhǔn)確性較高。2、成本大大降低：本發(fā)明的溶劑使用量?jī)H為0.4～0.8ml流動(dòng)相，溶劑使用量很少；同時(shí)，由色譜圖中可以看出本發(fā)明方法在1min即可測(cè)定一個(gè)樣品，節(jié)約了檢測(cè)時(shí)間。3、分離度高且靈敏度得到大大提高：本發(fā)明提供的方法，能將雜質(zhì)峰與曲司氯銨很好的分離，尤其是主成分與相鄰最近的雜質(zhì)峰的分離度達(dá)到4.1以上，避免了由于主峰與雜質(zhì)峰重合造成面積重視性差而帶來(lái)的系統(tǒng)誤差，系統(tǒng)適用性良好；同時(shí)本發(fā)明方法的定量限達(dá)0.15ng，靈敏度得到大大提高。4、線性達(dá)到0.99以上：本發(fā)明方法測(cè)定曲司氯銨濃度的范圍在10.10μg/ml-100.98μg/ml時(shí)，濃度與峰面積呈現(xiàn)良好線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r可達(dá)到0.99以上。5、重復(fù)性和中間精密度較好：本發(fā)明方法的重復(fù)性和中間精密度較好，RSD值均小于2％，測(cè)得的試驗(yàn)結(jié)果偏差小。6、使用范圍廣：由于曲司氯銨緩釋制劑的釋放時(shí)間長(zhǎng)，使用常規(guī)方法測(cè)定釋放度的耗時(shí)較長(zhǎng)，因釋放度測(cè)定方法與含量測(cè)定方法相同，因此本發(fā)明不僅可以準(zhǔn)確測(cè)定曲司氯銨原料及曲司氯銨各種制劑中的曲司氯銨含量，也可以快速、準(zhǔn)確的測(cè)定曲司氯銨的釋放度，為緩釋藥物處方工藝的開發(fā)及藥物釋放度監(jiān)測(cè)大大節(jié)約了時(shí)間。附圖說(shuō)明圖1為實(shí)施例1中空白溶劑的反相色譜檢測(cè)譜圖。圖2為實(shí)施例1中空白輔料的反相色譜檢測(cè)譜圖。圖3為實(shí)施例1中曲司氯銨對(duì)照品的反相色譜檢測(cè)譜圖。圖4為實(shí)施例1中A0.5μg/ml、雜質(zhì)B2.5μg/ml、曲司氯銨1.5μg/ml的系統(tǒng)適應(yīng)性溶液的反相色譜檢測(cè)譜圖。圖5為曲司氯銨定量限的反相色譜檢測(cè)譜圖。圖6為實(shí)施例1中三個(gè)批號(hào)的曲司氯銨雙釋放膠囊供試品的反相色譜檢測(cè)譜圖。圖7為實(shí)施例2中曲司氯銨緩釋膠囊供試品的反相色譜檢測(cè)譜圖。圖8為實(shí)施例3中曲司氯銨片供試品的反相色譜檢測(cè)譜圖。圖9為實(shí)施例4中曲司氯銨原料供試品的反相色譜檢測(cè)譜圖。圖10為實(shí)施例5中空白溶劑的反相色譜檢測(cè)譜圖。圖11為實(shí)施例5中空白輔料的反相色譜檢測(cè)譜圖。圖12為實(shí)施例5中曲司氯銨對(duì)照品的反相色譜檢測(cè)譜圖。圖13為實(shí)施例5中曲司氯銨緩釋片供試品的反相色譜檢測(cè)譜圖。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步闡述，但本發(fā)明并不限于以下實(shí)施例。所述方法如無(wú)特別說(shuō)明均為常規(guī)方法。所述原材料如無(wú)特別說(shuō)明均能從公開商業(yè)途徑獲得。以下實(shí)施例中的試劑，除非特別說(shuō)明，均為色譜純，且可從正規(guī)渠道商購(gòu)獲得：其中曲司氯銨對(duì)照品，購(gòu)自百靈威；雜質(zhì)A(二苯乙醇酸)購(gòu)自百靈威；雜質(zhì)B(二苯乙醇酸莨菪烷)購(gòu)自百靈威。實(shí)施例1：外標(biāo)法測(cè)定曲司氯銨雙釋放膠囊中曲司氯銨含量方法學(xué)驗(yàn)證一、色譜條件：儀器：WatersACQUITYUPLCH-ClassBio超高效液相色譜儀；色譜柱：WatersUPLCBEHShieldRP18，1.7μm，2.1×50mm；流動(dòng)相：pH值為3.0的由0.03mol/L磷酸水溶液(用三乙胺調(diào)節(jié)pH值為3.0)和乙腈以體積比為65：35混合而得的混合液；流動(dòng)相的流速：0.6ml/min；柱溫：35℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：215nm；進(jìn)樣量為1μl。二、實(shí)驗(yàn)步驟：1、專屬性分別取曲司氯銨雙釋放膠囊的空白溶劑(水)、空白輔料溶液(見CN104739808A，實(shí)施例1)、曲司氯銨對(duì)照品溶液(50μg/ml)各1μl依次以上述色譜條件檢測(cè)，以確定空白溶劑與空白輔料的出峰位置。所得結(jié)果如圖1所示，空白溶劑在0.2～0.4min之間有溶劑峰產(chǎn)生，圖2所示，空白輔料未出峰，圖3所示，曲司氯銨在0.627min處有吸收峰，空白溶劑和空白輔料在該處均無(wú)吸收，不干擾本品的含量測(cè)定。2、系統(tǒng)適用性試驗(yàn)精密稱取雜質(zhì)A、雜質(zhì)B和曲司氯銨對(duì)照品，以水為溶劑，分別配制成雜質(zhì)A0.5μg/ml、雜質(zhì)B2.5μg/ml、曲司氯銨1.5μg/ml的系統(tǒng)適應(yīng)性溶液。所得結(jié)果如圖4所示，雜質(zhì)B在0.562min出峰，與曲司氯銨分離度達(dá)到4.10，雜質(zhì)A在0.871min出峰，與曲司氯銨分離度達(dá)到5.49，雜質(zhì)均不影響曲司氯銨的含量測(cè)定，系統(tǒng)適用性良好。3、進(jìn)樣精密度取50μg/ml的曲司氯銨對(duì)照品溶液，精密量取1μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖，重復(fù)進(jìn)樣6次，計(jì)算峰面積的RSD值。結(jié)果見表1。表1、進(jìn)樣精密度結(jié)果結(jié)論：RSD為0.26％，進(jìn)樣精密度良好。4、線性關(guān)系與范圍配制濃度為10.10、30.29、50.49、70.69和100.98μg/ml的曲司氯銨對(duì)照品溶液，分別進(jìn)行色譜測(cè)定。以對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸處理，計(jì)算回歸方程及相關(guān)系數(shù)。結(jié)果見表2。表2、線性試驗(yàn)結(jié)果結(jié)論：表明進(jìn)樣量為1μl時(shí)，曲司氯銨在10.10μg/ml～100.98μg/ml的濃度范圍內(nèi)，其濃度與峰面積呈良好線性關(guān)系。5、回收率試驗(yàn)制備曲司氯銨對(duì)照品儲(chǔ)備液，加入曲司氯銨雙釋放膠囊處方比例(CN2015100790283，實(shí)施例1)的空白輔料，制備濃度為40、50、60μg/ml的溶液，每個(gè)濃度平行配制三份，搖勻，濾過(guò)，分別精密量取續(xù)濾液1μl，注入液相色譜儀。另取曲司氯銨對(duì)照品適量，精密稱定，用水溶解并稀釋制成每1ml中約含曲司氯銨50μg的溶液，作為對(duì)照溶液。按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算回收率。結(jié)果見表3。表3、回收率試驗(yàn)結(jié)果結(jié)論：各濃度下的平均回收率均在98.0％～102.0％之間，平均回收率為100.8％，RSD為0.74％，回收率良好。6、重復(fù)性試驗(yàn)對(duì)照品溶液的制備：取曲司氯銨對(duì)照品12.5mg，精密稱定，制備成濃度為50μg/ml的對(duì)照品溶液。供試品溶液的制備：取曲司氯銨雙釋放膠囊20粒，將內(nèi)容物研細(xì)，精密稱取適量(約相當(dāng)于曲司氯銨12.5mg)，制備成濃度為50μg/ml的供試品溶液，平行配制6份。精密量取對(duì)照品溶液和供試品溶液各1μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算各份樣品的含量。結(jié)果見表4。表4、重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果結(jié)論：RSD為0.81％，重復(fù)性良好。7、中間精密度試驗(yàn)在不同的檢查日期，采用不同的分析儀器，不同的試驗(yàn)人員，按照步驟6“重復(fù)性試驗(yàn)”方法，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算各份樣品的含量，并計(jì)算含量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，。結(jié)果見表5。表5、中間精密度試驗(yàn)結(jié)果結(jié)論：RSD為0.81％，結(jié)果表明本品測(cè)定方法中間精密度良好。8、定量限取曲司氯銨對(duì)照品適量，精密稱定，加水溶解并逐級(jí)稀釋，精密量取溶液1μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。色譜圖中主峰峰高約為基線噪音的10倍時(shí)即為定量限濃度。經(jīng)計(jì)算，本品的定量限為0.15ng。見圖5。另配制6份定量限濃度的溶液，所測(cè)6份溶液主峰的峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差小于2.0％。結(jié)果見表6。表6、定量限試驗(yàn)結(jié)果(n＝6)樣品123456均值RSD(％)峰面積4594504654724754624641.95保留時(shí)間(min)0.6770.6780.6780.6770.6780.6770.6780.08以上含量測(cè)定方法驗(yàn)證結(jié)果表明：本方法專屬性強(qiáng)、重復(fù)性好、準(zhǔn)確度高，定量限低。采用該方法對(duì)生產(chǎn)的3批中試樣品進(jìn)行含量測(cè)定，規(guī)格為60mg，批號(hào)為：201407002、201407003、201408004。取曲司氯銨雙釋放膠囊20粒，精密稱定，計(jì)算平均裝量。取內(nèi)容物，混合均勻，研細(xì)，精密稱取適量(約相當(dāng)于曲司氯銨12.5mg)，制備濃度為50μg/ml的溶液，精密量取1μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖；另取曲司氯銨對(duì)照品適量，精密稱定，加水制成每1ml中含50μg的溶液，同法測(cè)定。按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算，即得。測(cè)定結(jié)果見表7及圖6。表7、中試樣品含量測(cè)定結(jié)果樣品批號(hào)201407002201407003201408004含量(％)98.399.999.2結(jié)論：三批樣品含量合格。實(shí)施例2：外標(biāo)法測(cè)定曲司氯銨緩釋膠囊中曲司氯銨含量一、色譜條件：儀器：WatersACQUITYH-ClassBio超高效液相色譜儀；色譜柱：WatersUPLCBEHC18，1.7μm，2.1×100mm；流動(dòng)相：pH值為7.0的由0.03mol/L磷酸水溶液(用三乙胺調(diào)節(jié)pH值為7.0)和乙腈以體積比為85：15混合而得的混合液；流動(dòng)相的流速：0.8ml/min；柱溫：30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：220nm；進(jìn)樣量為1μl。二、實(shí)驗(yàn)步驟：1、回收率制備曲司氯銨對(duì)照品儲(chǔ)備液，加入曲司氯銨緩釋膠囊處方比例(CN103690506B，實(shí)施例3)的空白輔料，制備濃度為40、50、60μg/ml的溶液，每個(gè)濃度平行配制三份，搖勻，濾過(guò)，分別精密量取續(xù)濾液1μl，注入液相色譜儀。另取曲司氯銨對(duì)照品適量，精密稱定，用水溶解并稀釋制成每1ml中約含曲司氯銨50μg的溶液，作為對(duì)照溶液。按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算回收率。結(jié)果見表8。表8回收率試驗(yàn)結(jié)果結(jié)論：各濃度下的平均回收率均在98.0％～102.0％之間，平均回收率為99.7％，RSD為0.94％，回收率良好。2、重復(fù)性試驗(yàn)對(duì)照品溶液的制備：取曲司氯銨對(duì)照品12.5mg，精密稱定，制備成濃度為50μg/ml的對(duì)照品溶液。供試品溶液的制備：取曲司氯銨緩釋膠囊20粒，將內(nèi)容物研細(xì)，精密稱取適量(約相當(dāng)于曲司氯銨12.5mg)，制備成濃度為50μg/ml的供試品溶液，平行配制6份。精密量取對(duì)照品溶液和供試品溶液各1μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算各份樣品的含量。結(jié)果見表9。表9重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果結(jié)論：RSD為0.48％，重復(fù)性良好。3、含量測(cè)定對(duì)照品溶液的制備：取曲司氯銨對(duì)照品12.5mg，制備濃度為50μg/ml的對(duì)照品溶液。供試品溶液的制備：取曲司氯銨緩釋膠囊20粒，將內(nèi)容物研細(xì)，精密稱取適量(約相當(dāng)于曲司氯銨12.5mg)，制備濃度為50μg/ml的供試品溶液。精密量取對(duì)照品溶液和供試品溶液各1μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算各份樣品的含量，即得。表10中對(duì)照與樣品均為雙樣雙針，同一樣品配制兩份，保證平行性，重復(fù)檢測(cè)2次，結(jié)果見表10和圖7。表10、實(shí)施例2曲司氯銨緩釋膠囊中曲司氯銨含量結(jié)果由表可知，采用該色譜條件測(cè)得的曲司氯銨緩釋膠囊中曲司氯銨的含量合格。實(shí)施例3：外標(biāo)法測(cè)定曲司氯銨片中曲司氯銨含量一、色譜條件：儀器：WatersACQUITYH-ClassBio超高效液相色譜儀；色譜柱：WatersXBridgeBEHShieldRP18，2.5μm，4.6×75mm；流動(dòng)相：pH值為2.0的由0.01mol/L磷酸水溶液(用三乙胺調(diào)節(jié)pH值為2.0)和乙腈以體積比為65：35混合而得的混合液；流動(dòng)相的流速：0.4ml/min；柱溫：35℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：210nm；進(jìn)樣量為1μl。二、實(shí)驗(yàn)步驟：1、回收率制備曲司氯銨對(duì)照品儲(chǔ)備液，加入曲司氯銨片處方比例(CN201510363089.2，實(shí)施例2)的空白輔料，制備濃度為40、50、60μg/ml的溶液，每個(gè)濃度平行配制三份，搖勻，濾過(guò)，分別精密量取續(xù)濾液1μl，注入液相色譜儀。另取曲司氯銨對(duì)照品適量，精密稱定，用水溶解并稀釋制成每1ml中約含曲司氯銨50μg的溶液，作為對(duì)照溶液。按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算回收率。結(jié)果見表11。表11回收率試驗(yàn)結(jié)果結(jié)論：各濃度下的平均回收率均在98.0％～102.0％之間，平均回收率為100.2％，RSD為0.83％，回收率良好。2、重復(fù)性試驗(yàn)對(duì)照品溶液的制備：取曲司氯銨對(duì)照品12.5mg，精密稱定，制備成濃度為50μg/ml的對(duì)照品溶液。供試品溶液的制備：取曲司氯銨片20片，研細(xì)，精密稱取適量(約相當(dāng)于曲司氯銨12.5mg)，制備成濃度為50μg/ml的供試品溶液，平行配制6份。精密量取對(duì)照品溶液和供試品溶液各1μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算各份樣品的含量。結(jié)果見表12。表12重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果結(jié)論：RSD為0.53％，重復(fù)性良好。3、線性關(guān)系與范圍參照實(shí)施例1方法配制曲司氯銨對(duì)照品溶液分別進(jìn)行色譜測(cè)定，并按照上述方法計(jì)算回歸方程及相關(guān)系數(shù)，回歸方程為y＝3350x-1139，相關(guān)系數(shù)r為0.9998。結(jié)果表明進(jìn)樣量為1μl時(shí)，曲司氯銨在10.00μg/ml～100.88μg/ml的濃度范圍內(nèi)，其濃度與峰面積呈良好線性關(guān)系。4、含量測(cè)定同實(shí)施例2，結(jié)果見表13和圖8。表13、實(shí)施例3曲司氯銨片中曲司氯銨含量結(jié)果由表可知，采用該色譜條件測(cè)得的曲司氯銨片中曲司氯銨的含量合格。實(shí)施例4：外標(biāo)法測(cè)定曲司氯銨原料中曲司氯銨含量一、色譜條件：儀器：WatersACQUITYH-ClassBio超高效液相色譜儀；色譜柱：AgilentZORBAXRRHDSB-C18，1.8μm，2.1×50mm流動(dòng)相：pH值為3.0的由0.03mol/L磷酸水溶液(用三乙胺調(diào)節(jié)pH值為3.0)和乙腈以體積比為70：30混合而得的混合液；流動(dòng)相的流速：0.5ml/min；柱溫：50℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：215nm；進(jìn)樣量為1μl。二、實(shí)驗(yàn)步驟：1、重復(fù)性試驗(yàn)對(duì)照品溶液的制備：取曲司氯銨對(duì)照品12.5mg，制備濃度為50μg/ml的對(duì)照品溶液。供試品溶液的制備：取曲司氯銨原料12.5mg(購(gòu)自揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)有限公司)，制備濃度為50μg/ml的供試品溶液，平行配制6份。精密量取對(duì)照品溶液和供試品溶液各1μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算各份樣品的含量，結(jié)果見表14。表14、重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果結(jié)論：RSD為0.05％，重復(fù)性良好。2、中間精密度試驗(yàn)在不同的檢查日期，采用不同的分析儀器，不同的試驗(yàn)人員，按照步驟1的“重復(fù)性試驗(yàn)”方法，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算各份樣品的含量，并計(jì)算含量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。結(jié)果見表15。表15、中間精密度試驗(yàn)結(jié)果結(jié)論：RSD為0.06％，結(jié)果表明本品測(cè)定方法中間精密度良好。3、定量限參照實(shí)施例1定量限的檢測(cè)方法，得出本實(shí)施例色譜條件下曲司氯銨對(duì)照品的定量限為0.149ng。4、含量測(cè)定精密量取對(duì)照品溶液和供試品溶液各1μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算各份樣品的含量，即得。表16中對(duì)照與樣品均為雙樣雙針，同一樣品配制兩份，保證平行性，重復(fù)檢測(cè)2次，結(jié)果見表16及圖9。表16、實(shí)施例4曲司氯銨原料含量測(cè)定結(jié)果由表可知，采用該色譜條件測(cè)得的曲司氯銨原料中曲司氯銨的含量合格。實(shí)施例5：外標(biāo)法測(cè)定曲司氯銨緩釋片中曲司氯銨含量一、色譜條件：儀器：WatersACQUITYH-ClassBio超高效液相色譜儀；色譜柱：WatersUPLCBEHC8，1.7μm，2.1×50mm；流動(dòng)相：pH值為5.0的由0.06mol/L磷酸水溶液(用三乙胺調(diào)節(jié)pH值為5.0)和 乙腈以體積比為70：30混合而得的混合液；流動(dòng)相的流速：0.5ml/min；柱溫：40℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：215nm；進(jìn)樣量為1μl。二、實(shí)驗(yàn)步驟：1、專屬性按照專利CN101596170A的實(shí)施例1分別制備曲司氯銨緩釋片、空白輔料()，取空白溶劑、空白輔料溶液、曲司氯銨對(duì)照品溶液(50μg/ml)各1μl依次以上述色譜條件檢測(cè)，以確定空白溶劑與空白輔料的出峰位置。圖10所示，空白溶劑在0.2～0.4min之間有溶劑峰產(chǎn)生，圖11所示，空白輔料在0.2～0.5min之間有輔料峰產(chǎn)生，圖12所示，曲司氯銨在0.628min處有吸收峰，空白溶劑和空白輔料在該處均無(wú)吸收，不干擾本品的含量測(cè)定。2、重復(fù)性試驗(yàn)取曲司氯銨對(duì)照品適量，精密稱定，加水制成每1ml中含50μg的對(duì)照溶液；取曲司氯銨緩釋片20片，精密稱定，研細(xì)，精密稱取適量(約相當(dāng)于曲司氯銨12.5mg)，制備濃度為50μg/ml的溶液，平行配制6份。精密量取對(duì)照品溶液和供試品溶液各1μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算各份樣品的含量，即得。結(jié)果見表17。表17、重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果結(jié)論：RSD為0.71％，重復(fù)性良好。3、中間精密度試驗(yàn)在不同的檢查日期，采用不同的分析儀器，不同的試驗(yàn)人員，按照上文步驟2“重復(fù)性試驗(yàn)”方法，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算各份樣品的含量，并計(jì)算含量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。結(jié)果見表18。表18、中間精密度試驗(yàn)結(jié)果結(jié)論：RSD為0.98％，結(jié)果表明本品測(cè)定方法中間精密度良好。4、回收率試驗(yàn)制備曲司氯銨對(duì)照品儲(chǔ)備液，加入曲司氯銨緩釋片處方比例(CN101596170A，實(shí)施例1)的空白輔料，制備濃度為40、50、60μg/ml的溶液，每個(gè)濃度平行配制三份，搖勻，濾過(guò)，分別精密量取續(xù)濾液1μl，注入液相色譜儀。另取曲司氯銨對(duì)照品適量，精密稱定，用水溶解并稀釋制成每1ml中約含曲司氯銨50μg的溶液，作為對(duì)照溶液。按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算，結(jié)果見表19。表19、回收率試驗(yàn)結(jié)果結(jié)論：各濃度下的平均回收率均在98.0％～102.0％之間，平均回收率為100.0％，RSD為0.46％，回收率良好。5、含量測(cè)定取曲司氯銨緩釋片20片，精密稱定，研細(xì)，精密稱取適量(約相當(dāng)于曲司氯銨12.5mg)，制備濃度為50μg/ml的溶液，精密量取1μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖；另取曲司氯銨對(duì)照品適量，精密稱定，加水制成每1ml中含50μg的溶液，同法測(cè)定。按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算，即得。表20中對(duì)照與樣品均為雙樣雙針，同一樣品配制兩份，保證平行性，重復(fù)檢測(cè)2次，測(cè)定結(jié)果見表20及圖13。表20、實(shí)施例5曲司氯銨緩釋片中曲司氯銨的含量測(cè)定結(jié)果由表可知，采用該色譜條件測(cè)得的曲司氯銨緩釋片中曲司氯銨的含量合格。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3