本發(fā)明涉及一種蛋白質(zhì)檢測(cè)方法及其應(yīng)用，具體地，本發(fā)明涉及一種利用質(zhì)譜技術(shù)通過檢測(cè)特征多肽檢測(cè)脫細(xì)胞基質(zhì)材料中纖維連接蛋白含量的方法。

技術(shù)背景

小腸粘膜下層基質(zhì)(smallintestinalsubmucosa，sis)材料是指小腸粘膜下層經(jīng)脫細(xì)胞等方法處理后去除免疫原性物質(zhì)后的所得到的生物材料，廣泛用于各種軟組織缺損的修復(fù)，具有誘導(dǎo)細(xì)胞粘附生長(zhǎng)、促進(jìn)組織再生和重建等功能。sis材料作為外科植入物已成功用于神經(jīng)、腹壁、硬腦膜、肌腱、泌尿道、鼓膜等組織缺損的修復(fù)，具有安全有效、術(shù)后并發(fā)癥少、感染率低、患者滿意度高等優(yōu)點(diǎn)，證實(shí)了sis材料是一種理想的用于組織缺損修復(fù)和重建的無免疫排斥的動(dòng)物源性植入材料。

sis基質(zhì)材料作為一種脫細(xì)胞基質(zhì)主要成分為膠原蛋白，并包含非膠原類的結(jié)構(gòu)蛋白和生物粘多糖。其中膠原蛋白主要由i型和iii型組成，非膠原類蛋白主要包括纖維連接蛋白(fibronectin，fn)、層粘連蛋白和生長(zhǎng)因子等。fn是一種糖蛋白，由兩個(gè)分子量為220kda的亞基以二硫鍵連接的二聚體形式存在，主要由成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和肌細(xì)胞等合成分泌，分為血漿型和組織型。通過比較不同物種的fn基因核苷酸序列，結(jié)果顯示fn基因是高度保守的。不同物種不同組織來源的fn，其分子量、基本空間結(jié)構(gòu)及生物學(xué)性質(zhì)均基本一致。fn作為主要的細(xì)胞粘附分子其主要功能是介導(dǎo)細(xì)胞粘著、促進(jìn)細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的黏合和增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的內(nèi)吞作用，在胚胎生成、傷口愈合和止血等許多重要的生理過程中起著關(guān)鍵性作用，fn的異常表達(dá)和降解過程與許多疾病的發(fā)生密切相關(guān)。sis中所含有的fn對(duì)細(xì)胞在sis表面的粘附與遷移有很大的影響。但是，目前還沒有高效、穩(wěn)定、精確的生物材料中組織型fn的檢測(cè)方法。

目前已有的fn測(cè)定方法包括酶聯(lián)免疫法(elisa)、放射免疫法、免疫透射比濁法、單向火箭電泳法、化學(xué)發(fā)光法、免疫組化法、速率散射比濁法、microbca方法等。其中應(yīng)用最為普遍的是elisa法，在elisa法中首先將fn作為抗原與抗體結(jié)合，再經(jīng)化學(xué)顯色反應(yīng)，通過檢測(cè)顯色底物的吸光度值確定fn的含量，但該方法主要用于血漿型fn的檢測(cè)。sis中的fn屬于組織型并結(jié)合形式存在，直接采用elisa方法則抗體難以直接與fn結(jié)合，非特異性吸附也會(huì)影響結(jié)果的準(zhǔn)確度，導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果與實(shí)際含量存在較大偏差。

此外，雖然基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)檢測(cè)方法用于低豐度蛋白的定量分析具有靈敏度高、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，可根據(jù)蛋白質(zhì)降解產(chǎn)物中的多肽豐度進(jìn)行無標(biāo)記定量檢測(cè)。但是，作為脫細(xì)胞基質(zhì)成分fn的在脫細(xì)胞基質(zhì)中含量很少，此外由于脫細(xì)胞基質(zhì)的結(jié)構(gòu)使得序列特異性酶難以直接降解這些fn。因此，無法完全酶解脫細(xì)胞基質(zhì)中的fn?？梢娂词公@得一些肽段，也無法作為準(zhǔn)確檢測(cè)fn含量的基礎(chǔ)，也就無法使用質(zhì)譜法定量測(cè)量fn在脫細(xì)胞基質(zhì)中的準(zhǔn)確含量。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)脫細(xì)胞基質(zhì)中fn檢測(cè)存在的問題，本發(fā)明提供一種基于酶解和質(zhì)譜分析的纖維連接蛋白的定量檢測(cè)方法，從而克服上述問題以準(zhǔn)確地檢測(cè)纖維連接蛋白在脫細(xì)胞基質(zhì)中的含量。

一種檢測(cè)脫細(xì)胞基質(zhì)中纖維連接蛋白含量的方法，其特征在于，該檢測(cè)方法包括以下步驟：(1)預(yù)處理：稱取一定重量的脫細(xì)胞基質(zhì)，將其剪成尺寸小于1cm×1cm的小片，在液氮保護(hù)條件下粉碎成粉末，粉末尺寸控制在50-300μm；(2)酶解1：取一定量粉碎后脫細(xì)胞基質(zhì)粉末，加入到脫細(xì)胞基質(zhì)粉末重量500-10000倍的緩沖液，在100℃熱處理5-10min，冷卻后加入脫細(xì)胞基質(zhì)重量1/200～1/50的膠原酶，于37℃振蕩處理2-24h；(3)酶解2：將步驟(2)獲得的溶液ph調(diào)節(jié)至7.5-8.5，加入非膠原類蛋白酶，非膠原類蛋白酶的加入量為脫細(xì)胞基質(zhì)重量的1/200～1/50，于37℃反應(yīng)8-24h；(4)質(zhì)譜檢測(cè)：將步驟(3)獲得的酶解溶液進(jìn)行濃縮，濃縮液直接進(jìn)行質(zhì)譜分析，以已知濃度的纖維連接蛋白標(biāo)準(zhǔn)品溶液的酶解產(chǎn)物為對(duì)照，檢測(cè)特征多肽，通過測(cè)定脫細(xì)胞基質(zhì)降解產(chǎn)物中纖維連接蛋白特征多肽計(jì)算脫細(xì)胞基質(zhì)中纖維連接蛋白的含量。

所述步驟(2)酶解過程中使用的膠原酶可以是i型、ii型、iii型、v型或不同類型膠原酶的混合物，加入量是脫細(xì)胞基質(zhì)重量的1/200～1/50。

所述步驟(3)酶解過程中使用的蛋白酶可以是胰蛋白酶、化學(xué)修飾后的胰蛋白酶或固定化的胰蛋白酶，加入量是脫細(xì)胞基質(zhì)重量的1/200～1/50。

所述步驟(4)中用于檢測(cè)脫細(xì)胞基質(zhì)中纖維連接蛋白的特征多肽包括：ftqvtptsltaqwtapnvqltgyr、einlapdsssvvvsglmvatk、dtltsr、paqgvvttlenvsppr、vtdatettitiswr、sytitglqpgtdyk、sspvvidastaidapsnlr、flattpnsllvswqppr、pgsppr、evvpr、nnqk或sepligr中的一種或多種。

本發(fā)明還提供一種纖維連接蛋白的特征多肽，其特征在于，所述纖維連接蛋白經(jīng)過如前述的步驟(1)、(2)和(3)能夠得到所述特征多肽，所述特征多肽能夠用于檢測(cè)所述纖維連接蛋白的含量；所述特征多肽為前述的特征多肽：ftqvtptsltaqwtapnvqltgyr、einlapdsssvvvsglmvatk、dtltsr、paqgvvttlenvsppr、vtdatettitiswr、sytitglqpgtdyk、sspvvidastaidapsnlr、flattpnsllvswqppr、pgsppr、evvpr、nnqk或sepligr。

提供一種纖維連接蛋白的檢測(cè)方法，其特征在于，所述檢測(cè)方法使用如所述的特征多肽。

提供一種用于檢測(cè)纖維連接蛋白的試劑盒，其特征在于，包括一種或多種酶；所述一種或多種酶能夠酶解纖維連接蛋白，并產(chǎn)生如前述的特征多肽。

試劑盒還包括纖維連接蛋白標(biāo)準(zhǔn)品或前述的所述特征多肽的標(biāo)準(zhǔn)品。

所述一種或多種酶包括：膠原酶和蛋白酶；所述膠原酶優(yōu)選i型、ii型、iii型或v型膠原酶；所述蛋白酶優(yōu)選胰蛋白酶、化學(xué)修飾后的胰蛋白酶或固定化的胰蛋白酶。

還提供一種所述的特征多肽的在檢測(cè)纖維連接蛋白中的應(yīng)用。

附圖說明

圖1靜態(tài)酶解和分批次酶解過程中sis殘留量的動(dòng)態(tài)變化

圖2為纖維連接蛋白酶解多肽的總離子流圖；

圖3為特征多肽sspvvidastaidapsnlr的提取離子流圖和一級(jí)質(zhì)譜圖；

圖4為特征多肽sspvvidastaidapsnlr的二級(jí)質(zhì)譜圖；

圖5不同濃度的纖維連接蛋白特征多肽sspvvidastaidapsnlr的提取離子流圖；

圖6纖維連接蛋白標(biāo)準(zhǔn)品濃度與信號(hào)強(qiáng)度關(guān)系曲線；

圖7和圖8分別為特征多肽einlapdsssvvvsglmvatk的提取離子流圖和一級(jí)質(zhì)譜圖；

圖9和圖10分別為特征多肽ftqvtptsltaqwtapnvqltgyr的提取離子流圖和一級(jí)質(zhì)譜圖；

圖11和圖12分別為特征多肽flattpnsllvswqppr的提取離子流圖和一級(jí)質(zhì)譜圖；

圖13和圖14分別為特征多肽paqgvvttlenvsppr的提取離子流圖和一級(jí)質(zhì)譜圖；

圖15和圖16分別為特征多肽dtltsr的提取離子流圖和一級(jí)質(zhì)譜圖。

上述附圖用于說明本發(fā)明的技術(shù)方案，有助于本領(lǐng)域技術(shù)人員理解本發(fā)明，而并非用于限定本發(fā)明的技術(shù)方案。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明首先根據(jù)質(zhì)譜分析確定的纖維連接蛋白的特征多肽并使用纖維連接蛋白標(biāo)準(zhǔn)物建立濃度與質(zhì)譜峰面積之間的線性關(guān)系，然后采用質(zhì)譜法檢測(cè)待測(cè)樣品中特征多肽的峰值并根據(jù)濃度與質(zhì)譜峰面積之間的關(guān)系確定小腸粘膜下層基質(zhì)中纖維連接蛋白的含量。下文將通過具體的實(shí)施方式加以說明。

待測(cè)物分別為經(jīng)免疫原去除處理的豬的小腸粘膜下層基質(zhì)；所述使用的ⅰ型膠原酶(分析純)購(gòu)自北京欣經(jīng)科生物技術(shù)有限公司；胰蛋白酶(序列純)購(gòu)自美國(guó)promega公司；fibronectin購(gòu)自美國(guó)calbiochem公司。高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)(hplc-ms)由美國(guó)agilent公司1100液相色譜和美國(guó)thermofisher公司lcqdeca^xp電噴霧質(zhì)譜組成，數(shù)據(jù)采集與處理軟件為xcalibur1.3；液相色譜-三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)由美國(guó)thermofisher公司u3000液相和tsqquantumaccessmax質(zhì)譜組成，數(shù)據(jù)采集與處理軟件為xcalibur1.3。

1、小腸粘膜下層基質(zhì)降解實(shí)驗(yàn)

靜態(tài)酶解：稱取100mg小腸粘膜下層基質(zhì)，加入100ml緩沖液(50mmtris-hcl，0.36mmcacl2，ph7.4)，在100℃熱變性處理10min，降至常溫后加入1ml的膠原酶溶液(1mg/mlhank's平衡鹽溶液(hbss)緩沖液)，37℃水浴震蕩至無可見固形物，離心后收集上清液。

分批次酶解：稱取100mg小腸粘膜下層基質(zhì)，加入8ml緩沖液(50mmtris-hcl，0.36mmcacl2，ph7.4)，100℃熱變性處理10min，降至常溫后加入200μl的膠原酶溶液(1mg/mlhbss緩沖液)，37℃酶解1h，10000rpm離心3min，取出上清液，沉淀加入200μl膠原酶溶液和8ml緩沖液，繼續(xù)37℃酶解1小時(shí)，重復(fù)上述過程5次，合并上清液。

2、胰蛋白酶酶解實(shí)驗(yàn)

將小腸粘膜下層基質(zhì)的膠原酶降解產(chǎn)物冷凍干燥，使用50mmnh4hco3溶液(ph8.0)配置成1mg/ml的溶液，加入20μl的胰蛋白酶溶液(1mg/ml，50mmnh4hco3，ph8.0)，37℃酶解12h，酶解產(chǎn)物直接進(jìn)行hplc-ms檢測(cè)。

3、氨基酸組成分析

小腸粘膜下層基質(zhì)及其酶解產(chǎn)物的水解方法參照文獻(xiàn)“海參體壁酸溶性膠原提取及氨基酸組成分析”(高楊，董秀萍，肖桂華，江慧敏，朱蓓薇，《食品與發(fā)酵工業(yè)》,2008,34(11):171-174)中記載的方法。

氨基酸組成分析：色譜柱為zorbaxc18[150mm×3.0mm(i.d.)，5μm]；流動(dòng)相a為0.05m乙酸鈉溶液，b為50％乙腈；梯度0～15min30～55％b，15～25min55～100％b，25～35min100～30％b，進(jìn)樣量5μl；uv為360nm；流速1ml/min。

4、hplc-ms分析

色譜柱為zorbaxsbc18[150mm×2.1mm(i.d.)，5μm]；流動(dòng)相a為水(含0.1％甲酸)，b為乙腈(含0.1％甲酸)；梯度0～80min，5％～50％乙腈；80～90min，50％～90％乙腈，進(jìn)樣量50μl；uv為214nm和254nm；流速0.2ml/min。質(zhì)譜條件：離子源噴霧電壓4.5kv，毛細(xì)管溫度300℃，掃描范圍m/z957-958.精確質(zhì)量數(shù)掃描和二級(jí)質(zhì)譜掃描(ms/ms)均為數(shù)據(jù)依賴型掃描，ms/ms碰撞能量為35％。

三重四極桿質(zhì)譜條件：離子源噴霧電壓3.5kv，毛細(xì)管溫度300℃，蒸發(fā)溫度：200℃，殼氣：35arb，輔助氣：8psi，掃描方式：選擇離子監(jiān)測(cè)：m/z957.5，掃描寬度：1.0。

采用靜態(tài)酶解法加入膠原酶后溶液中脫細(xì)胞基質(zhì)殘留量逐漸降低，酶解6h降解率達(dá)到40％，24h后降解率為60％，降解3天后仍有10％的脫細(xì)胞基質(zhì)未被降解，4天后殘留量趨于穩(wěn)定，溶液中殘留不能被降解的絮狀物，約5％(圖1)。氨基酸分析結(jié)果表明，殘留物主要成為天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、亮氨酸等氨基酸和一些非氨基酸成分，殘留物中幾乎未檢測(cè)出羥脯氨酸，表明脫細(xì)胞基質(zhì)中的膠原成分被有效降解。但是采用該方法降解脫細(xì)胞基質(zhì)的過程耗時(shí)長(zhǎng)，且存在易染菌、酶失活以及隨機(jī)降解率高等不足。為了提高酶解效率，使用了分批次降解的方式，即降解一定時(shí)間后進(jìn)行固液分離，沉淀物重新酶解。脫細(xì)胞基質(zhì)殘留量在前三次降解過程中變化較明顯，第一次換液時(shí)殘留量為70％，第二次換液時(shí)殘留量為50％，第三次換液時(shí)殘留量約為30％(圖1)，該過程重復(fù)五次后脫細(xì)胞基質(zhì)酶解較為完全。為了最大程度減少樣品中蛋白損失，實(shí)驗(yàn)在分批次降解過程中降解次數(shù)延長(zhǎng)至6次。

由于在fn上有與膠原蛋白高親和的結(jié)合點(diǎn)，因此采用膠原酶先將膠原蛋白酶解之后，再采用胰蛋白酶將fn酶解為多肽，用于確定纖維連接蛋白的特征多肽。

纖維連接蛋白經(jīng)序列純胰蛋白酶處理后產(chǎn)生大量低分子量多肽。符合定量檢測(cè)的多肽應(yīng)滿足一定條件：實(shí)驗(yàn)首先對(duì)多肽進(jìn)行blast多序列比對(duì)，只在纖維連接蛋白被檢出的肽段為纖維連接蛋白的特征多肽；酶解后的多肽質(zhì)譜信息用sequest軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)搜索，當(dāng)多肽帶1個(gè)電荷時(shí)實(shí)驗(yàn)質(zhì)譜與理論質(zhì)譜的相關(guān)系數(shù)xcorr>1.5，帶2個(gè)電荷時(shí)xcorr>2.0，帶3個(gè)電荷時(shí)xcorr>2.5，同時(shí)deltacn>0.1，則所產(chǎn)生的肽段被認(rèn)為是陽性結(jié)果；在hplc-ms分析的質(zhì)譜圖中提取特征多肽的離子流圖，可提取到低濃度樣品且其豐度較高，同時(shí)信噪比s/n>10，即適合作為特征多肽。

將胰蛋白酶酶解后的纖維連接蛋白用離子阱質(zhì)譜(lcq)進(jìn)行全掃描分析，圖2為纖維連接蛋白酶解多肽的總離子流圖。將酶解后的多肽段進(jìn)行blast多序列比對(duì)，結(jié)果表明纖維連接蛋白存在一定數(shù)量的特征多肽。以全部纖維連接蛋白為數(shù)據(jù)庫(kù)，將纖維連接蛋白降解后的多肽質(zhì)譜信息用bioworks軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)搜索，篩選具有陽性結(jié)果的多肽段，根據(jù)blast多序列比對(duì)和bioworks軟件搜庫(kù)，確定纖維連接蛋白的特征多肽為ftqvtptsltaqwtapnvqltgyr、einlapdsssvvvsglmvatk、dtltsr、paqgvvttlenvsppr、vtdatettitiswr、sytitglqpgtdyk、sspvvidastaidapsnlr、flattpnsllvswqppr、pgsppr、evvpr、nnqk或sepligr

圖3為多肽sspvvidastaidapsnlr的提取離子流圖和一級(jí)質(zhì)譜圖，圖4為特征多肽sspvvidastaidapsnlr的二級(jí)質(zhì)譜圖。因此，可選擇多肽sspvvidastaidapsnlr作為特征多肽，用于纖維連接蛋白類型識(shí)別及定量檢測(cè)。取不同濃度經(jīng)變性酶解處理的纖維連接蛋白標(biāo)準(zhǔn)品溶液，從低濃度到高濃度依次進(jìn)樣50μl，按hplc-ms定量檢測(cè)條件分析，監(jiān)測(cè)目標(biāo)離子m/z＝957.5，得不同濃度纖維連接蛋白特征多肽sspvvidastaidapsnlr的提取離子流，參見圖5，其中a、b、c、d、e中纖維連接蛋白的濃度分別為0.0024、0.0048、0.0096、0.0192、0.048mg/ml。以所選特征多肽提取離子流圖峰面積為縱坐標(biāo)、纖維連接蛋白標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見圖6。回歸方程為y＝4109.5x-12.82(r²＝0.995)，在0.0024～0.048g/l濃度范圍內(nèi)二者線性關(guān)系良好。

進(jìn)一步確定脫細(xì)胞基質(zhì)中fn含量。稱取50mg脫細(xì)胞基質(zhì)加入膠原酶分5次酶解，合并5次酶解的上清液，冷凍干燥，得到123mg凍干物(含提取液里的鹽類物質(zhì))，取4mg凍干后的產(chǎn)物復(fù)溶，利用胰蛋白酶酶解，酶解產(chǎn)物按照hplc-ms定量檢測(cè)條件分析，按fn中特征多肽sspvvidastaidapsnlr的提取離子濃度為0.007mg/ml，經(jīng)計(jì)算得到脫細(xì)胞基質(zhì)中fn的含量為0.43％。

線性范圍：將同一樣品稀釋成不同的濃度，分別為2.4μg/ml、4.8μg/ml、9.6μg/ml、19.2μg/ml、48μg/ml、96μg/ml、192μg/ml，通過hplc-ms檢測(cè)其纖維連接蛋白含量，由濃度梯度和峰面積做曲線，確定峰面積呈線性的濃度的范圍。多次實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本方法在2.4μg/ml～192μg/ml之間成線性。

精密度：精確稱取fn標(biāo)準(zhǔn)品100μl，按定量hplc-ms條件進(jìn)行分析，重復(fù)進(jìn)樣五次，結(jié)果fn標(biāo)準(zhǔn)品中特征多肽sspvvidastaidapsnlr的峰面積相對(duì)偏差rsd為2.58％，結(jié)果表明方法精密度良好。

圖7和圖8分別為特征多肽einlapdsssvvvsglmvatk的提取離子流圖和一級(jí)質(zhì)譜圖。將einlapdsssvvvsglmvatk肽段作為特征多肽，通過以下方式檢測(cè)纖維連接蛋白含量：

(1)預(yù)處理：取200mg的脫細(xì)胞基質(zhì)，將其剪成尺寸約0.5cm×0.5cm的片狀，置于低溫粉碎機(jī)內(nèi)，加入液氮，粉碎溫度低于-100℃條件下粉碎，粉末粒徑控制值在100微米。

(2)酶解1：準(zhǔn)確稱取100mg脫細(xì)胞基質(zhì)粉末，加入到8ml緩沖液中(50mm/ltris-hcl，0.36mmol/lcacl2，ph7.4)，加熱至100℃并保持10min，冷卻后加入2mg的膠原酶(含80％i型膠原酶和20％的iii型膠原酶)，在37℃振蕩處理1h，10000rpm離心3min，取出上清液，沉淀加入2mg膠原酶和8ml緩沖液，繼續(xù)37℃酶解1小時(shí)，重復(fù)上述過程5次，合并上清液。

(3)酶解2：使用0.05mol/l的naoh溶液將步驟(2)獲得的溶液ph調(diào)節(jié)至8.0，加入1mg胰蛋白酶，于37℃反應(yīng)16h。

(4)質(zhì)譜檢測(cè)：將步驟(3)獲得的酶解溶液進(jìn)行氮吹法干燥，準(zhǔn)確稱取1mg干燥后的粉末，溶解于1ml濃度為0.5mol/l的nh4hco3溶液，直接進(jìn)行質(zhì)譜分析，檢測(cè)纖維鏈接蛋白酶解產(chǎn)物中的特征多肽einlapdsssvvvsglmvatk對(duì)應(yīng)的帶雙電荷離子m/z1059，其峰面積為1.1×10⁵，以1mg/ml的fn標(biāo)準(zhǔn)品溶液的胰蛋白酶酶解產(chǎn)物為對(duì)照并制作擬合曲線，質(zhì)譜法檢測(cè)特征多肽einlapdsssvvvsglmvatk對(duì)應(yīng)的帶雙電荷離子m/z1059峰面積，測(cè)得細(xì)胞外基質(zhì)中纖維鏈接蛋白的含量為0.48％。

同理，參見附圖，其中圖9和圖10分別為特征多肽ftqvtptsltaqwtapnvqltgyr的提取離子流圖和一級(jí)質(zhì)譜圖；圖11和圖12分別為特征多肽flattpnsllvswqppr的提取離子流圖和一級(jí)質(zhì)譜圖；圖13和圖14分別為特征多肽paqgvvttlenvsppr的提取離子流圖和一級(jí)質(zhì)譜圖；圖15和圖16分別為特征多肽dtltsr的提取離子流圖和一級(jí)質(zhì)譜圖。通過酶解纖維連接蛋白標(biāo)準(zhǔn)物針對(duì)上述特征多肽繪制濃度梯度和峰面積擬合曲線；對(duì)脫細(xì)胞基質(zhì)兩次酶解，質(zhì)譜法檢測(cè)上述特征多肽中一個(gè)或多個(gè)的濃度，從而準(zhǔn)確測(cè)量脫細(xì)胞基質(zhì)中細(xì)胞連接蛋白的含量。

本發(fā)明通過二次酶解的方法實(shí)現(xiàn)了采用質(zhì)譜技術(shù)檢測(cè)脫細(xì)胞基質(zhì)中纖維連接蛋白含量的問題。此外進(jìn)一步采用分批次酶解和液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對(duì)脫細(xì)胞基質(zhì)材料中fn含量進(jìn)行了定量檢測(cè)。針對(duì)sis的膠原酶酶解方案進(jìn)行優(yōu)化，消除了時(shí)間長(zhǎng)，效率低等弊端，將膠原酶酶解時(shí)間由96h降為6h，大大地提高了酶解效率。實(shí)驗(yàn)中fn經(jīng)酶解得到多個(gè)特征肽段，可用于檢測(cè)纖維連接蛋白的含量。這種方法操作簡(jiǎn)便，且適用于組織中fn的檢測(cè)。

此外，基于上述酶解方法，可以采用纖維連接蛋白標(biāo)準(zhǔn)物以及分步酶解所用的酶制作為試劑盒。將試劑盒與質(zhì)譜分析儀相結(jié)合以用于定量檢測(cè)待測(cè)脫細(xì)胞基質(zhì)纖維連接蛋白的含量。還可以直接采用上述特征多肽的標(biāo)準(zhǔn)物以及兩次酶解所用的酶作為試劑盒。將試劑盒與質(zhì)譜分析儀相結(jié)合以用于定量檢測(cè)待測(cè)脫細(xì)胞基質(zhì)纖維連接蛋白的含量。

本發(fā)明通過脫細(xì)胞基質(zhì)的預(yù)處理、分步酶解方法獲得纖維連接蛋白的所有多肽序列混合物，再篩選纖維連接蛋白中的特征多肽序列，通過質(zhì)譜法檢測(cè)特征多肽含量，從而測(cè)定出脫細(xì)胞基質(zhì)中纖維連接蛋白含量。該方法解決了以往無法使用質(zhì)譜法定量檢測(cè)脫細(xì)胞基質(zhì)中組織型纖維連接蛋白含量的問題；進(jìn)一步地，通過分步酶解的方式去除脫細(xì)胞基質(zhì)中膠原蛋白成分、減少測(cè)試過程非目標(biāo)蛋白多肽序列的干擾，從而節(jié)約了測(cè)試時(shí)間，提高工作效率、檢測(cè)精度和穩(wěn)定性。